BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
* * * * * * *
NGUYỄN HUỲNH HOÀNG MINH ĐỊNH DANH NẤM Phytophthora spp. BẰNG CÁC KỸ
THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ
LUẬN VĂN KỸ SƢ
CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 8/2006 MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING
NONG LAM UNIVERSITY, HCMC
DEPARTMENT OF BIOTECHNOLOGY
* * * * * IDENTIFYING Phytophthora spp. BY MOLECULAR
TECHNOLOGIES

GRADUATION OF THESIS
MAJOR: BIOTECHNOLOGY

Professor: Student:
PhD. LE DINH DON NGUYEN HUYNH HOANG MINH
Bs. TRINH THI PHUONG VY TERM: 2002 - 2006

TỬ ”.
Giáo viên hướng dẫn: TS. Lê Đình Đôn
KS. Trịnh Thị Phương Vy
Nấm Phytophthora được xem là một trong những tác nhân nguy hiểm hàng đầu
cho nền kinh tế nông nghiệp nước ta hiện nay. Dựa trên một số kết quả đạt được từ
những nghiên cứu trước đây về hình thái và sinh thái của giống nấm này, chúng tôi đã
đề nghị qui trình định danh giống nấm này trên cơ sở cấu trúc di truyền của chúng.
Mục đích của đề tài bao gồm việc sử dụng kỹ thuật PCR, kỹ thuật giải trình tự nhằm
khuếch đại và xác định vùng trình tự đặc trưng ITS1- 5,8S- ITS2. Kết quả của đề tài
tạo cơ sở cho những nghiên cứu điều tra và kiểm soát mầm bệnh Phytophthora ở nước
ta.
Sau khi thực hiện toàn bộ qui trình, chúng tôi thu được một số kết quả sau:
- Sản phẩm khuếch đại trong vùng ITS1- 5,8S- ITS2 của hai mẫu nấm trên
tiêu Bà Rịa và sầu riêng Đồng Nai là 900 bp. Trong khi sản phẩm khuếch
đại của hai mẫu nấm trên địa lan cho band 800 bp hoặc 900 bp hoặc cả hai
band trên.
- Kết quả giải trình tự hai mẫu nấm trên địa lan cho thấy trình tự của toàn vùng
ITS1- 5,8S- ITS2 khoảng 800 bp. Trong đó vùng ITS1 khoảng 225 bp; vùng
5,8S là 160 bp và vùng ITS2 là 420 bp.

vi
MỤC LỤC
.......o0o.......

Trang

Lời cảm ơn ............................................................................................................ iv
Tóm tắt ................................................................................................................... v
Mục lục ................................................................................................................. vi
Danh mục các hình .............................................................................................. ix

2.3.3 Kỹ thuật protein profile .............................................................................. 12
2.3.4 Isozyme ....................................................................................................... 13
2.3.5 Huyết thanh học và kit chuẩn đoán ............................................................ 13
2.3.6 Kỹ thuật RFLP ( Restriction Fragment Length Polymorphism ) ............... 14
2.3.7 Kỹ thuật probe acid nucleic, DNA fingerprinting ..................................... 14
2.3.8 Sự lai DNA-DNA ....................................................................................... 15
2.3.9 Kỹ thuật PCR và RAPD ............................................................................. 15
2.4 Một số công trình nghiên cứu định danh nấm Phytophthora ........................ 15
2.4.1 Một số công trình nghiên cứu ngoài nước .................................................. 15
2.4.2 Công trình nghiên cứu trong nước.............................................................. 17
2.5 Một số lưu ý trước khi thực hiện thí nghiệm ................................................. 18
2.5.1 Sơ lược về trình tự ITS ............................................................................... 18
2.5.2 Danh mục các loài Phytophthora được tìm thấy ở Việt Nam .................... 19
3. Vật Liệu và phương pháp ................................................................................ 21
3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài .......................................................... 21
3.1.1 Thời gian thực hiện ..................................................................................... 21
3.1.2 Địa điểm thực hiện ..................................................................................... 21
3.2 Vật liệu và hoá chất ....................................................................................... 21
3.2.1 Tăng sinh và nhân sinh khối ...................................................................... 21
3.2.2 Ly trích DNA .............................................................................................. 22
3.2.3 Điện di ........................................................................................................ 22
3.2.4 Kỹ thuật PCR .............................................................................................. 23
3.3 Phương pháp nghiên cứu ............................................................................... 23
3.3.1 Tăng sinh và nhân sinh khối ....................................................................... 23
3.3.2 Ly trích DNA .............................................................................................. 24
3.3.3 Kỹ thuật PCR .............................................................................................. 26
3.3.4 Kỹ thuật giải trình tự .................................................................................. 28

viii
3.3.5 Xử lý kết quả giải trình tự .......................................................................... 29

Bảng 2.2. Danh mục các loài nấm Phytophthora được tìm thấy ở Việt Nam ..... 19
Bảng 3.1. Thành phần cho phản ứng PCR thể tích 25 l ..................................... 26
Bảng 3.2.Thành phần cho phản ứng PCR thể tích 50 l ...................................... 27
Bảng 3.3.Chu kì nhiệt cho phản ứng PCR ........................................................... 27
Bảng 4.1. Các nguồn nấm trên ngân hàng gen được dùng để so sánh ............... 37
Bảng 4.2. So sánh trình tự nucleotide vùng ITS của hai mẫu DL1, DL2 ........... 38
Bảng 4.3. Kết quả so sánh từng vùng trên đoạn ITS1- 5,8S- ITS2 ..................... 40
Bảng 4.4. Trình tự vùng gen (ITS1-5.8S-ITS2) của mẫu Phytophthora địa lan 42

xi
DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT

bp: base pair
Kbp Kilobase pair
DNA: Deoxyribonucleic acid
dNTP: 3’- Deoxyribonucleoside- 5’-
triphosphate
dGTP: deoxyguanosine triphosphate
dCTP: deoxycytidine triphosphate
dATP: deoxyadenosine triphosphate
dTTP: deoxythymidine triphosphate
ETDA: Ethylenediamine tetraacetic acid
PCR: Polymerase Chain Reaction
RFLP: Restriction fragment length polymorphism
RAPD: Random Amplified Polymorphism DNA
RNA: Ribonucleic acid
rDNA: ribosome Deoxynucleotide acid
SDS: Sodium dodecyl sulfate
TAE: Tris Acetate EDTA
Taq: Thermus aquaticus

môn Bảo Vệ Thực Vật- Khoa Nông Học). Chúng tôi đã thực hiện đề tài ”
ĐỊNH DANH NẤM Phytophthora spp. BẰNG CÁC KỸ THUẬT SINH HỌC
PHÂN TỬ ” nhằm hoàn thiện qui trình định danh nấm Phytophthora bằng các
kỹ thuật sinh học phân tử.
2
1.2. Mục đích – yêu cầu của đề tài
1.2.1 Mục đích của đề tài
Định danh nấm Phytophthora.bằng các kỹ thuật sinh học phân tử. Cụ thể
là sử dụng kỹ thuật PCR với cặp mồi ITS4 và ITS5 để khuếch đại vùng ITS1 và
ITS2 trong ribosomal DNA của nấm Phytophthora. Sau đó dùng kỹ thuật đọc
trình tự để định danh các mẫu nấm trên.
1.2.2 Yêu cầu của đề tài
- Tăng sinh, nhân sinh khối các mẫu nấm Phytophthora trên nhiều loại cây trồng
ở một số vùng khác nhau.
- Phát hiện đoạn gen ITS1- 5,8S- ITS2 bằng kỹ thuật PCR với cặp mồi ITS4 và
ITS5.
- Sử dụng kỹ thuật đọc trình tự để định danh các mẫu nấm đã phân lập ở trên.
1.2.3 Giới hạn của đề tài
Đề tài chỉ thực hiện được trên các mẫu nấm phân lập được ở một số cây trồng
thuộc vùng Đông Nam Bộ. Do đó, đề tài chỉ định danh được ở một mức độ giới
hạn các loài nấm Phytophthora ở Việt Nam.
1.2.4 Đối tƣợng của đề tài
Các mẫu nấm được lấy từ nhiều loại cây khác nhau như: Tiêu, Sầu Riêng, các
loại Lan tại các tỉnh như: Đồng Nai, Bà Rịa Vũng Tàu.


2.1.1. Cây tiến hóa của Phytophthora (Andre
’
Drenth, 2001)
Bảng 2.1. Cây tiến hoá của nấm Phytophthora

Ngành Lớp Bộ Họ Giống
Chromista Oomycetes Lagenidiales
Leptomitales
Saprolegniales Saprolegniaceae Achlya
Saprolegnia
Peronosporales Pythiaceae Pythium
Phytophthora
Peronosporaceae Bremia
Peronospora
Albuginaceae Albugo

2.1.2. Chu kì sống của phytophthora

mẫu tốt nhất từ những bộ phận này ta nên lấy mẫu từ mép của một vết thương đang
phát triển nhanh. Mẫu mô lá hay thân lý tưởng được chọn cho việc phân lập nên chứa
cả phần bệnh và phần mô khỏe. Mô thu được sau đó được xử lý vô trùng bề mặt rồi
chuyển sang môi trường chọn lọc thích hợp (A. Drenth và B. Sendall, 2004).
6
2.1.4. Một số môi trƣờng phân lập Phytophthora từ mô bệnh
- Môi trường 3-P dùng để phân lập mô mới nhiễm bệnh .
- Môi trường 3-P + 10 mg/ml pimaricin dùng để phân lập trên mô cây già hay đất.
- Môi trường Hymexazol-25 và Hymexazol-50 hạn chế sự phát triển của Pythium
đồng thời cũng hạn chế sự phát triển của một số loài Phytophthora.
- Môi trường P10VP phân lập Phytophthora từ đất và mô bị bệnh.
- Môi trường P10ARP và P5ARP là những môi trường dùng để phân lập hầu hết các
loài Phytophthora.
2.1.5. Đặc điểm hình thái của giống Phytophthora
Ta có thể xác định một số loài Phytophthora thông qua một số đặc điểm hình
thái sau (A. Drenth và B. Sendall, 2004):
- Túi bào tử
Hình thái túi bào tử (hình dạng, kích thước, chiều dài, chiều rộng,…),
hệ gai của túi, tính rụng sớm của chúng.
Chiều dài của cuống trên túi bào tử.
Sự tăng sinh của túi bào tử.
Nhánh của cuống túi bào tử mà trên đó túi bào tử sinh ra.
Một số loài Phytophthora tạo ra bào tử ngay trên môi trường Agar, trong khi
nhiều loài khác cần dược nuôi cấy trong nước, dung dịch muối khoáng và dịch trích từ

Gia ở Hà Nội. Từ những kết quả điều tra và những nghiên cứu ngoài đồng, 13 loài
Phytophthora đã được tìm thấy ở Việt Nam. Sau đây là những thông tin về bệnh
Phytophthora trên một số cây trồng chính tại Việt Nam theo ghi nhận của Thanh,
Ngo, Viên và Andre’ Drenth năm 2004.
2.2.1. Cà chua và khoai tây
Bệnh tàn lụi lá là bệnh chính trên nhóm cây trồng này. Được nghiên cứu ở
vùng đồng bằng sông Hồng trong những năm 1960. Tác nhân gây bệnh là
Phytophthora infestans và bệnh xuất hiện hàng năm từ tháng 12 đến tháng 3 khi điều
kiện khí hậu lạnh và ẩm; gây mất mùa 30 – 70%, trong trường hợp xấu bệnh gây mất
mùa toàn bộ (Vũ, 1973). Điều đáng lưu ý là phạm vi ảnh hưởng của bệnh cao hơn
mức trung bình ở những vùng đất sét. Bệnh dược khống chế bằng phun 1% Bordeaux.
Ngoài ra thuốc diệt nấm Maneb và Zineb 0,2 – 0,3% a.i. cũng được xem là có hiệu
quả phòng chống P. infestans cao.
2.2.2. Khoai sọ
Bệnh tàn lụi lá gây ra bởi P. colocasiae được xem là bệnh chính trên khoai sọ ở
Bắc Việt Nam. Bệnh được báo cáo đầu tiên bởi Roger (1951). Nhiệt độ ấm (24 –
30
0
C) và ẩm độ cao là yêu cầu cho bệnh lan rộng. Bệnh xuất hiện hằng năm, bắt đầu 8
vào giữa tháng 4, tháng 5 và cao điểm ở tháng 7, tháng 8 khi nhiệt độ ổn định ở 27 –
29
0
C, lượng mưa trung bình trong tháng ở mức 201 – 308 mm.
2.2.3. Dứa
Bệnh thối nõn dứa là một trong những bệnh chính gây mất năng suất dứa. Bệnh
được tìm thấy ở tất cả các vùng trồng dứa trên khắp đất nước gồm Thừa Thiên Huế,
Nghệ An, Hà Tây, Bắc Giang, Thanh Hóa và Ninh Bình. Giống dứa cayenne mẫn cảm

kinh tế 15 tỉ đồng VND (1,5 triệu USD). Những nơi khác, bệnh đã được tìm thấy phổ
biến nhất ở Cái Bè, Tiền Giang, với 24,6% cây bị nhiễm bệnh. Tỷ lệ mắc bệnh có liên
quan với tuổi cây, những cây hơn 10 tuổi là mẫn cảm với bệnh nhất.
2.2.6. Mận
Trong những năm gần đây bệnh đốm đen trên mận (Prunus salicilas) đã làm
giảm lượng thu hoạch một cách đáng kể ở tỉnh Bắc Hà và Mộc Châu. Phytophthora
cactorum được nhận biết là tác nhân gây bệnh. Ở Bắc Hà vào tháng 3 năm 1996, bệnh
gây thiệt hại nghiêm trọng trên 300ha mận làm mất mùa 20%. Suốt những năm 1997
và 1998, bệnh lan rộng ít hơn nhưng mức độ tàn phá thì mãnh liệt hơn, với những
vướn bị đốm đen thì mất mùa trên 50%.
Triệu chứng bệnh trên mận là những điểm úng nước màu trắng xám trên trái
non, phát triển thành những đốm đen trũng với rìa mép màu nâu. Trong vài trường
hợp bệnh nặng, toàn bộ trái bị khô quắt lại và rụng khỏi cây. Những đốm trũng được
bao phủ bởi những sợi nấm trắng trong điều kiện ẩm ướt, P. cactorum được phân lập
từ những đốm đen trong điều kiện này.
Nhiệt độ mát (nhiệt độ ngày 14 – 18
0
C), chênh lệch nhiệt độ ngày đêm cao, ẩm
ướt và có sương mù được xem là điều kiện lý tưởng cho P. catorum lây nhiễm. Do vật
bệnh tăng nhanh vào tháng 3 và đầu tháng 4, chậm dần khi nhiệt độ tăng dần lên gần
cuối tháng. Và cây mận chưa trưởng thành mẫn cảm với bệnh đốm đen hơn cây mận
đã trưởng thành. Vào tháng 3 năm 1998, ở tỷ lệ bệnh trên cây mận hai năm tuổi là
10% trong khi trên cây mận bốn năm tuổi là 2,1%.
2.2.7. Cao su
Trong những năm 1960, bắt đầu có những nghiên cứu quan tâm đến bệnh trên
cao su ở Việt Nam. 19 bệnh ảnh hưởng đến cao su ở Việt Nam, rụng lá, sọc đen và
loét thân gây ra bởi các loài Phytophthora. P. palmivora được phân lập từ khoảng
70% cây cao su bị bệnh sọc đen, trong khi P. botryosa được tìm thấy trên 75 – 80% từ
lá và trái của những cây cao su bị rụng lá. Cả hai loài P. palmivora và P. botryosa
được biết là tác nhân gây bệnh trên cao su ở tất cả các vùng trồng trên đất nước.

trƣờng nuôi cấy
Đây được xem là kỹ thuật định danh cơ bản bởi vì nó xuất hiện sớm và được sử
dụng rộng rãi trong quá trình phân lập, định danh các loài nấm cũng như vi khuẩn gây
bệnh.
Những đặc điểm hình thái làm cơ sở để nhận biết nấm Phytophthora bao gồm:
hình dạng túi bào tử, chóp đầu và tính rụng; hình thái túi bào tử; sự hiện diện của bào
tử vách dày và sợi nấm trương phồng; sự tiếp xúc giữa túi đực và túi noãn và tổ chức
hữu tính là cùng tản hay khác tản
Hình 2.2. Một số bệnh do Phytophthora gây ra trên một số cây trồng;
(1) Loét thân cây ca cao do P.palmivora; (2) Thối rễ tiêu do P.capsici; (3) Tổn
thƣơng thân cà chua do P.infestans; (4) Thối nõn dứa do P.nicotianae
11
Môi trường thông thường dùng cho quá trình nhận biết Phytophthora: V-8
juice, cà rốt agar, lima bean agar.
Khi ủ ở nhiệt độ thích hợp, mẫu nấm nuôi cấy sẽ có những biểu hiện hình thái
đặc trưng cho loài. Đặc điểm sợi nấm, hình dạng tản nấm hoặc khả năng hình thành bộ
phận vô tính như túi bào tử, bào tử vách dày (chlamydospore) trên bề mặt môi trường
nuôi cấy là đặc điểm quan trọng để phát hiện Phytophthora.
Với kỹ thuật trên ta có thể phát hiện một số loài Phytophthora chẳng hạn: loài
P. capsici với dạng tản nấm đồng nhất, túi bào tử hình thành nhiều nhưng không có sự
hiện diện của bào tử vách dày (chlamydospore). Trong khi P. parasitica với dạng nấm
xòe ra, túi bào tử và bào tử vách dày (chlamydospore) hình thành phong phú trên môi
trường nuôi cấy.
Tuy nhiên, kỹ thuật này đòi hỏi nhiều thời gian, công sức. Nó không phải là
giải pháp tốt cho những kiểm tra thường lệ trên một số lượng mẫu lớn (Drenth và
Irwin, 2001). Mục đích định danh muốn thực sự đạt hiệu quả cao, ta phải kết hợp đồng
thời kỹ thuật quan sát hình thái với các kỹ thuật hiện đại về sinh hoá hay sinh học

2.3.4. Isozymes
Trong phân tách Isozyme, nhiều enzyme có thể không kiểm tra được trong các
mẫu đã định. Các enzyme cắt này được xác định có thể ở dạng đơn hình trong khi có
rất ít sự khác nhau giữa các loài, dưới loài hoặc chúng có độ đa hình rất cao. Các
enzyme sau khi điện di trên tinh bột, gel polyacrylamide, hoặc màng cellulose acetate
cơ chất enzyme được cho vào cùng với thuốc nhuộm chlorogenic. Phản ứng giữa
enzyme với cơ chất và với thuốc nhuộm, phức tạp của phản ứng màu phản ánh sự hiện
diện của enzyme. Sự khác nhau nhỏ giữa trong cấu hình acid amino có thể thay đổi
trong cấu trúc hay vật mang của protein. Sự xác định và tính biến động của những
enzyme này phụ thuộc nhiều yếu tố khác nhaubao gồm những điều kiện trên sinh vật
như tốc độ tăng trưởng, độ pH, dòng điện, hệ thống đệm, tuổi, độ đậm của dung dịch
nhuộm,và chuẩn bị mẫu.
Gel cellulose acetate thường được sử dụng do nó hạn chế thấp nhất thời gian
chuẩn bị so với điện di bằng gel polyacrylamide và tinh bột
2.3.5. Huyết thanh học và kit chẩn đoán
Việc ứng dụng kháng thể trong việc kiểm tra và phát hiện nấm gây bệnh có
nguồn gốc từ đất đã ra đời 5 - 10 năm trước. Nhiều phương pháp thường được sử dụng
để sản xuất ra huyết thanh miễn dịch các loại bệnh cây do nấm gây ra mà không cần
phải hiểu biết về mặt di truyền của nguyên liệu nấm bệnh (vách tế bào, bào tử, các
protein hòa tan,…) đã tạo ra huyết thanh miễn dịch đa dòng đặc biệt. Vấn đề gặp phải 13
với kháng thể sử dụng là sự thiếu tính chuyên biệt và đặc hiệu trong hầu hết chất nền
là mô cây hay đất.
Kháng thể đơn dòng được chấp nhận như một dụng cụ chẩn đoán và phát hiện
ở mức độ loài và dưới loài. Kháng thể đơn dòng có thể ở cấp độ giống, loài, hay các
chủng đặc biệt.
Các kit chẩn đoán thường kiểm tra và phát hiện các mầm bệnh từ đất dựa vào
kỹ thuật kháng thể đơn dòng hay đa dòng. Những kit này có thể chứng minh rằng sự

Một ứng dụng khác của các probe acid nuceic gần đây là việc sử dụng các
probe DNA minisatellite trong kỹ thuật DNA fingerprinting (Jeffreys và cộng sự,
1985). Các probe rất nhỏ được sử dụng trên nhiều sinh vật để xác định cá thể và theo
dỏi phả hệ, chúng chỉ hiện diện để xác định độ đa dạng di truyền trên nấm.
Minisatellite probe, probe oligonucleotide có thể được ứng dụng cho cấp độ loài, dưới
loài và cả những dòng clone.( Rodriguez, 1989).
2.3.8. Sự lai DNA-DNA
Sự lai DNA-DNA (DNA-DNA hydridization) được ứng dụng ở một mức độ
giới hạn trong quá trình phân loại nấm bệnh trên. Qui trình thực hiện gồm: tách DNA
của dòng phân lập; trộn với DNA từ chủng khác hay loài khác nhằm mục đích cho
chúng sáp nhập lại; mức độ sáp nhập của chúng phụ thuộc vào sự tương đồng hay
giống nhau giữa các phân tử DNA khác nhau. Kỹ thuật này không được sử dụng rộng
rãi bởi vì giá cả của bộ dụng cụ thực hiện thí nghiệm cao, tuy nhiên tỉ lệ tương đồng
giữa các loài thường rất đáng kể.
2.3.9. Kỹ thuật PCR và RAPD
Phản ứng PCR (Polymerase Chain Reaction) là kỹ thuật nhân đoạn DNA dựa
vào các base trình tự. Kỹ thuật này thường dùng để xác đinh mối quan hệ phát sinh
loài giữa các loài và là kỹ thuật ứng dụng rộng rãi trong nghiên cứu sinh học (Amheim
và cộng sự, 1990; White và cộng sự, 1990). PCR bao gồm enzyme khuếch đại một
trình tự DNA đặc hiệu. Vùng thường được sử dụng để khuếch đại là vùng lập lại
không mã hóa ITS ( Internal Transcribed Spacer) trong RNA ribosome, vùng này có
giá trị thay đổi giữa các loài nấm và do đó có thể xác định mối quan hệ giữa các loài
(Bruns và cộng sự, 1992). Kỹ thuật này rất có giá trị bởi tính tiến hóa ở mức độ cao
của các loài và các chủng có thể được so sánh. PCR rất có giá trị trong việc xác định ở
mức độ loài và chủng. Nó phù hợp để xác đinh các nhóm, các chủng đặc biệt.
Gần đây, kỹ thuật khuếch đại các đoạn đa hình RAPD (Randomly Amplified
Polymorphic DNA) được phát triển (William và cộng sự, 1990). RAPD nhằm sử dụng
những cặp mồi khoảng 10 base để nhận ra nhiều đoạn DNA khác nhau trên toàn DNA
sinh vật (đoạn lớn nhất có kích thước khoảng 1kb). Sự xuất hiện, vắng mặt và sự khác
nhau về các band DNA cho phép xác định sự đa dạng giữa chúng.