bộ giáo dục
v đo tạo
viện khoa học
v công nghệ việt nam
Viện công nghệ sinh học ngô thị hơng Nghiên cứu giải mã một phần hệ gen ty thể của loi
sán lá gan nhỏ
Opisthorchis

viverrini
(mẫu việt nam)
v so sánh với các chủng của thế giới
bằng các phơng pháp sinh học phân tử

Chuyên ngành: Hóa sinh học
Mã số: 62 42 30 15 tóm tắt Luận án tiến sĩ sinh học Lun ỏn s c bo v trc Hi ng chm lun ỏn cp Nh
nc, hp ti: Vin Cụng ngh
sinh hc, H Ni
vo hi 14 gi ngy 25 thỏng 09 nm 2008 Có thể tìm hiểu luận án tại:
- Th viện Quốc gia
- Th viện Viện Công ngh sinh học

1
MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Ký sinh trùng (KST) là tập hợp sinh vật rất đa dạng, nên việc phân
loại về nhóm, loài, chủng trước đây đã có phần thiếu chính xác, đặc biệt
đối với một số loài đồng hình (sibling species), đôi khi đã gộp nhầm những
cá thể hoặc quần thể ký sinh trùng mà thực chất chúng có những đặc tính
di truyền học hoàn toàn khác biệt nhau. Hiện nay các phương pháp sinh
học phân tử (SHPT) đ
ã bước đầu được ứng dụng trong chẩn đoán phân
loại và lập phả hệ sinh vật. Trong đó, các chỉ thị di truyền hệ gen ty thể
(cox1, nad1, nad3, atp6…) đã được sử dụng phổ biến trong phương pháp
phân loại sinh học phân tử. Ưu điểm của gen ty thể là ở thể đơn bội, không
tái tổ hợp, di truyền theo dòng mẹ và có tỷ lệ bi
ến đổi nucleotide cao. Do
có kích thước nhỏ, lại chứa các gen tối cần thiết cho hoạt động sống của tế
bào, nên ADN hệ gen ty thể được coi là đối tượng lý tưởng để khảo sát sự

Opisthorchis viverrini (mẫu Việt Nam) và so sánh với các chủng của thế
giới bằng các phương pháp sinh học phân tử”
2. Mục tiêu đề tài :
- Giải mã một vùng gen ty thể chứa một số gen quan trọng của một số
phân lập O. viverrini thu nhận tại các vùng địa lý khác nhau ở Việt Nam.
- Phân tích, so sánh các gen thu nhận được từ các phân lập của Việt
Nam và so sánh với các phân lập c
ủa thế giới.
- Phân tích mối quan hệ phả hệ của các phân lập sán lá gan nhỏ O.
viverrini dựa vào trình tự các gen thu nhận được.
- Thẩm định mối quan hệ về loài của O. viverrini trong lớp Trematoda
và trong ngành sán dẹt (Platyhelminthes) trên cơ sở phân tích vùng gen ty
thể.
3. Những đóng góp mới về khoa học và thực tiễn của đề tài
- Lần đầu tiên trình tự vùng gen ty thể dài 4,2 kb của các phân lập O.
viverrini ở những vùng địa lý khác nhau của Việt Nam là Qu
ảng Nam,
Bình Định và Phú Yên được xác định.
- Lần đầu tiên đặc tính gen học vùng gen ty thể dài 4,2 kb của loài
sán lá gan nhỏ O. viverrini bao gồm trật tự, cấu trúc, tương đồng, thành
phần kiến tạo, mối quan hệ phả hệ được phân tích, góp phần quan trọng
vào phát triển nghiên cứu sinh học phân tử của ngành ký sinh trùng hiện
đại.
- Lần đầu tiên mối quan hệ về loài và vị trí phân loại của sán lá gan
nhỏ O. viverrini được làm sáng tỏ, giúp hi
ểu biết hơn về các loài trong lớp
sán lá (Trematoda) và ngành sán dẹt Platyhelminth.
Các kết quả thu được từ vùng gen 4,2 kb của các phân lập O.
viverrini sẽ giúp ích cho việc xây dựng kit chẩn đoán để phòng chống và
điều trị bệnh này có hiệu quả ở Việt Nam và thế giới.

1.2 HỆ GEN TY THỂ VÀ ỨNG DỤNG TRONG NGHIÊN CỨU KÝ
SINH TRÙNG
Hiện nay đã có rất nhiều loài đã có hệ gen ty thể được giải mã toàn bộ
hoặc một phần, cung cấp nguyên liệu chuỗi nucleotide và amino acid cho
so sánh giám định các loài cần nghiên cứu. Do có kích thước nhỏ, lại chứa
gen tối cần thiết cho hoạt động sống của tế bào, nên ty thể được coi là đối
tượng lý tưởng
để khảo sát sự biến đổi trong hệ gen phục vụ nghiên cứu về
giám định, phân loại và lập phả hệ quần thể. Các gen trong ty thể lại có hệ
số biến đổi nhanh hơn hệ gen nhân tế bào 10-15 lần, nên rất thuận lợi cho
nghiên cứu về tiến hoá. Các gen của ty thể trong cùng chủng, cùng loài,
thậm chí trong các loài có quan hệ gần về sinh học có sự bảo tồn rất cao,
do vậy, bất cứ s
ự thay đổi nhỏ nào cũng là dấu hiệu giá trị trong giám định
và phân loại.
Nghiên cứu hệ gen ty thể còn có tầm quan trọng trong chẩn đoán, điều
trị và phòng chống bệnh, vì có nhiều bệnh ở người và động vật liên quan
đến sự biến đổi ở ty thể. Đối với KST, hiểu biết đầy đủ về hệ gen ty thể,
còn có giá trị định hướng trong phòng chống, đặc biệt tìm kiế
m hóa chất,
hóa dược, hoặc thực nghiệm các loại vacxin thế hệ mới. Đã có nhiều hệ
gen ty thể của các loại KST như giun đũa (Ascaris suum), giun chỉ
(Onchocerca volvulus), sán máng (Schistosoma mansoni, S. japonicum, S.
mekongi, S. haematobium), sán dây (Taenia solium, T. saginata, T.

4
asiatica, T. crasiceps ), sán lá gan lớn (Fasciola hepatica, F. gigantica),
sán lá gan nhỏ (Clonorchis sinensis, Opisthorchis viverrini), sán lá ruột
(Fasciolopsis buski) đã được giải mã và phân tích cung cấp nguồn dữ
liệu cần thiết cho nghiên cứu giám định, phân loại, phả hệ, quần thể ký

Việc xác định các cấu trúc một gen hay nhiều gen đặc trưng của sán
lá gan nhỏ còn giúp cho các nhà sinh học xác định được sản phẩm cụ thể
của gen đó. Đây sẽ là cơ sở cho việc sả
n xuất các kháng nguyên đặc hiệu,
sử dụng cho phương pháp chẩn đoán bằng miễn dịch học.
Nguồn thông tin thu được sẽ giúp cho việc xác định phân bố phân tử
của chúng cũng như giúp cho các nghiên cứu về phòng chống và điều trị
có hiệu quả bệnh này ở Việt Nam và thế giới.

5
CHƯƠNG 2
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU
Nguyên liệu nghiên cứu là mẫu sán lá gan nhỏ trưởng thành có kích
thước 1,2 x 0,1 cm, màu vàng nhạt, được xác định là O. viverrini về mặt
hình thái học. Mẫu sán được thu thập từ bệnh nhân tại các địa điểm sau:
- Xã An Mỹ, huyện Tuy An, tỉnh Phú Yên. Ký hiệu (OvPY3)
- Xã Mỹ Thọ, huyện Phù Mỹ, tỉnh Bình Định. Ký hiệu (OvBD1)
- Xã Tam Xuân 1, huyện Núi Thành, tỉnh Quảng Nam. Ký hiệu (OvQN).
Đây là những nơi được xác định là vùng lư
u hành bệnh sán lá gan nhỏ.
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Để thu nhận được các chuỗi ADN hệ gen ty thể của các phân lập O.
viverrini, phương pháp PCR được sử dụng kết hợp, bao gồm PCR thông
thường và PCR cực đại (long PCR). Các sản phẩm PCR được dòng hóa,
giải trình trình tự và phân tích theo quy trình tổng quát như sau:
2.2.1. Phương pháp tách chiết ADN tổng số từ mẫu vật: sử dụng bộ
sinh phẩm QIAamp DNA Mini kit (QIAGEN Inc, USA).
2.2.2. Phương pháp tiến hành phản ứ
ng PCR: phản ứng PCR cực

trình trình tự trên máy ABI3100 Avant Genetic Analyzer.
2.2.4. Phương pháp xử lý số liệu: các chuỗi nucleotide được xử lý
bằng chương trình SeqEdv1.03, sau đó so sánh sử dụng chương trình
AsemblyLIGNv1.9c và MacVector8.2 (Accelrys Inc.) trên máy tính
Macintosh; các chương trình GENEDOC2.5, MEGA3.1 trên máy tính PC,
được sử d
ụng để phân tích, so sánh về thành phần nucleotide và amino
acid cũng như phân tích mối quan hệ phả hệ

6
CHƯƠNG 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. KẾT QUẢ THU NHẬN VÙNG GEN TY THỂ DÀI 4,2 KB
CỦA CÁC PHÂN LẬP SÁN LÁ GAN NHỎ O. VIVERRINI
Phản ứng PCR thông thường và PCR cực đại (long PCR) được sử
dụng kết hợp để thu nhận vùng gen ty thể có kích thước 4,2 kb của các
phân lập O. viverrini của Việt Nam (OvQN, OvBD1, OvPY3) và của Thái
Lan (OvKK). theo sơ đồ tổng quát giới thiệu ở Hình 3.1.

Hình 3.1: Sơ đồ tổng quát thu nhận vùng gen dài 4,2 kb của các phân lập
OvQN, OvBD1, OvPY3 của.Việt Nam và OvKK của Thái Lan.

S
2
SNR LNR
W
atp6 nad
2
A
V N
I
F M
nad1
P
K
Q
D
nad3
cox
3
cob nad
4
H
nad4L
S
1
4,2 Kb
1,3 kb
2,9 kb
OvQN
OvBD1
OvPY3

Q
D
nad3
cox
3
cob nad
4
H
nad4L
S
1
Ov4R
OvN3R
Ov15R
Ov17R
Ov19R
Ov21R
Ov8F
OvR
OvF
4,2 Kb
3,7 kb
OvQN
OvBD1
OvPY3
OvQN
OvBD1
OvPY3
OvR
OvKK

SNR LNR
W
atp6 nad
2
A
V N
I
F M
nad1
P
K
Q
D
nad3
cox
3
cob nad
4
H
nad4L
S
1
4,2 Kb
1,3 kb
2,9 kb
OvQN
OvBD1
OvPY3
OvQN
OvBD1

K
Q
D
nad3
cox
3
cob nad
4
H
nad4L
S
1
Ov4R
OvN3R
Ov15R
Ov17R
Ov19R
Ov21R
Ov8F
OvR
OvF
4,2 Kb
3,7 kb
OvQN
OvBD1
OvPY3
OvQN
OvBD1
OvPY3
OvR

Trật tự các gen được sắp xếp như trình bày ở Bảng 3.2
.
3.2.3. Kết quả phân tích các gen mã hóa protein nằm trong vùng
gen ty thể 4,2 kb
a) Kết quả phân tích thành phần nucleotide và amino acid đoạn gen
nad4 của các phân lập O. viverrini
Bảng 3.3: So sánh tỷ lệ (%) tương đồng về nucleotide (trên đường chéo) và
amino acid (dưới đường chéo) của các phân lập O. viverrini với nhau (một
phần gen nad4 dài 807 nucleotide) 999999
OvPY3
999999
OvBD1

OvPY3
CTCTTTTGGTTTGT
OvBD1
TCTTCCTGGCTCAC
OvQN
TCCGCTCTCCTTAT
OvKK
16781616158714391407135412581247124612421207114110691019
Các vị trí có thay đổi nucleotide
Chủng
nad2atp6trnM
TCCTCTTGGCCCAT
OvPY3
CTCTTTTGGTTTGT
OvBD1
TCTTCCTGGCTCAC
OvQN
TCCGCTCTCCTTAT
OvKK
16781616158714391407135412581247124612421207114110691019
Các vị trí có thay đổi nucleotide
Chủng
(B)
trnF*nad4
GC-ACTTTGCTTTT
OvPY3
GTTGTCCTATCTAC
OvBD1
GC-GCTTAGCTCAT
OvQN


nad1
*
trnAnad2
TCTTCAACCTATCGC
OvPY3
CGTCTGATTTGTTGT
OvBD1
TGTTCACCTTACCAT
OvQN
CGGTTAACTCACCGC
OvKK
334532983023300229522881260325332340212220552047193419021695
Các vị trí có thay đổi nucleotide
Chủng
nad1
*
trnAnad2

CGGCCTAGTGTTCCT
OvKK
416941454083407040164004399539273908380737233545351934543381
Các vị trí có thay đổi nucleotide
Chủng
(D)
(C)

10

Bảng 3.2: Vị trí các gen mã hoá protein và các trình tự nối các gen (vùng
giao gen) trong vùng gen ty thể dài 4,2 kb của các phân lập O. viverrini
Gen và
trình tự
Vị trí 5'→3'
Độ dài
bp/aa
Bộ mã bắt đầu/
Kết thúc
Ghi chú
nad4 1- 807 807/268 */TAG
808 - 814 Vùng giao gen (7bp)
trnQ 815 - 877 63
878 - 889 Vùng giao gen (12bp)
trnF 890 - 955 66
trnM 956 - 1022 67
atp6 1023 - 1538 516/171 ATG/TAG

Kết quả phân tích thành phần nucleotide và amino acid của đoạn gen
nad4 của các phân lập O. viverrini của Việt Nam và Thái Lan, cho thấy
mức độ tương đồng (%) là rất cao, 98-99% (nucleotide) và 99% (aminino
acid) (Bảng 3.3). Có 10 vị trí có sự sai khác về nucleotide, dẫn đến thay đổi
3 amino acid ở các vị trí 9, 12 và 70 (Bảng 3.4).

b) Kết quả phân tích thành phần gen atp6 ở các phân lập O. viverrini
Bảng 3.5: So sánh tỷ lệ (%) tương đồng về nucleotide (trên đường chéo) và
amino acid (dưới đường chéo) của các phân lập O. viverrini với nhau (gen
atp6)
VCSOvPY3
VSPOvBD1

769729726696516490234
2093425
Các vị trí có thay đổi nucleotide
Chủng
999999
OvPY3
999999
OvBD1
999899
OvQN
999999
OvKK
OvPY3OvBD1OvQNOvKK
999999
OvPY3
999999
OvBD1
999899
OvQN
999999
OvKK
OvPY3OvBD1OvQNOvKK

12
Bảng 3.6: So sánh các vị trí có thay đổi về nucleotide và amino acid giữa
các phân lập O. viverrini (atp6)


viverrini của Việt nam hoàn toàn giống nhau. Ngoại trừ vị trí 46 phân lập
OvBD1 có sai khác với các phân lập còn lại của Việt Nam và Thái Lan dẫn
đến làm thay đổi amino acid ở vị trí 16.
TCTTGGCCCAOvPY3
TTTTGGTTTGOvBD1
TCCTGGCTCAOvQN
GCTCTCCTTAOvKK
41638433123522422321918411846
C¸c vÞ trÝ cã thay ®æi nucleotide
Chñng
TCTTGGCCCAOvPY3
TTTTGGTTTGOvBD1
TCCTGGCTCAOvQN
GCTCTCCTTAOvKK
41638433123522422321918411846
C¸c vÞ trÝ cã thay ®æi nucleotide
Chñng
VFGMOvPY3
VFGVOvBD1
VFGMOvQN
GLLMOvKK
139797516
VÞ trÝ cã sai kh¸c amino acid
Chñng
VFGMOvPY3
VFGVOvBD1
VFGMOvQN
GLLMOvKK
139797516
VÞ trÝ cã sai kh¸c amino acid

n làm thay đổi 1 amino acid ở vị trí 164. Riêng
phân lập OvBD1 có đến 7 vị trí sai khác về nucleotide so với phân lập
OvKK của Thái Lan và dẫn đến làm thay đổi 3 amino acid ở các vị trí 20,
126 và 164. Nếu chỉ xét riêng về gen nad2, kết quả phân tích cho thấy
phân lập OvBD1 có sự thay đổi nhiều nhất về nucleotide cũng như amino
acid so với phân lập OvKK của Thái Lan và các phân lập khác của Việt
Nam.
999999
OvPY3
999898
OvBD1
9999100
OvQN
999999
OvKK
OvPY3OvBD1OvQNOvKK
999999
OvPY3
999898
OvBD1
9999100
OvQN
999999
OvKK
OvPY3OvBD1OvQNOvKK
CTATCGCTCCOvPY3
TTG
TTGTCTCOvBD1
TTA
CCATTCTOvQN

Chủng

14
d) Kết quả phân tích thành phần gen nad1 ở các phân lập O. viverrini
Bảng 3.9: So sánh tỷ lệ (%) tương đồng về nucleotide (trên đường chéo) và
amino acid (dưới đường chéo) của các phân lập O. viverrini (gen nad1)
Bảng 3.10: So sánh các vị trí có thay đổi về nucleotide và amino acid giữa
các phân lập O. viverrini (nad1)
Ghi chú: Khung bôi đậm: Nucleotide làm thay đổi amino acid.
Phân tích gen nad1 cho thấy thành phần nucleotide và amino acid
giữa các phân lập O. viverrini cũng có mức độ tương đồng cao, 99%
(nucleotide) và 98-99% (amino acid) (Bảng 3.9).
Có 10 vị trí sai khác về nucleotide giữa các phân lập O. viverrini của
Việt Nam so với phân lập OvKK của Thái Lan (Bảng 3.10). Kết quả phân
tích cho thấy phân lập OvQN có 5 vị trí sai khác về nucleotide so với phân
lập OvKK của Thái Lan; kết quả dẫn đến làm thay đổi 2 amino acid ở các
vị trí 116 và 290. Phân lập OvPY3 cũng có 5 vị trí sai khác về nucleotide
so vớ

Các vị t
r
ícótha
y
đ
ổ
inucleotide
Chủng
TTCTTCTTCAOvPY3
TCTTCGTCTGOvBD1
CCCCTGTTCAOvQN
TCCTCGGTTAOvKK
869843778705669622347326276205
Các vị t
r
ícótha
y
đ
ổ
inucleotide
Chủng
MLQVMIOvPY3
MFEVTVOvBD1
TLEVMIOvQN
MLEGMIOvKK
29026020811610969
Vị trí có sai khác amino acid
Chủng
MLQVMIOvPY3
MFEVTVOvBD1


Phân tích gen nad3 cho thấy thành phần nucleotide và amino acid
giữa các phân lập O. viverrini có mức độ
tương đồng rất cao, 98-99%
(nucleotide) và 98-100% (amino acid) (Bảng 3.11).
Có 9 vị trí có sự sai khác cơ bản về nucleotide giữa các phân lập O.
viverrini của Việt Nam so với phân lập OvKK của Thái Lan. (Bảng 3.12).
Kết quả phân tích cho thấy phân lập OvQN có 3 vị trí sai khác về
nucleotide so với phân lập OvKK của Thái Lan. Phân lập OvPY3 cũng có
3 vị trí sai khác về nucleotide so với phân lập OvKK của Thái Lan, Tuy
nhiên sự thay đổi này ở cả 2 phân lập không dẫn đến làm thay đổi amino
acid. Phân lập OvBD1 có 4 vị
trí sai khác về nucleotide so với phân lập
OvKK của Thái Lan, và làm thay đổi amino acid ở 2 vị trí là 20 và 72.
Như vậy, kết quả phân tích các gen nad2, nad1, nad3 đều cho thấy phân
lập OvBD1 tương đổi có nhiều thay đổi về thành phần nucleotide cũng như
amino acid so với phân lập OvKK của Thái Lan hơn là các phân lập khác
của Việt Nam so với phân lập O. viverrini của Thái Lan.
98100100
OvPY3
989898
OvBD1
9898100
OvQN
999899
OvKK
OvPY3OvBD1OvQNOvKK
98100100
OvPY3
989898

DVOvQN
DVOvKK
7220
Vị trí có sai khác amino acid
Chủng
DVOvPY3
NIOvBD1
DVOvQN
DVOvKK
7220
Vị trí có sai khác amino acid
Chủng

16
3.2.4. Kết quả phân tích các gen ARN vận chuyển nằm trong vùng
gen ty thể 4,2 kb
Xác định được 10 ARN vận chuyển amino acid là trnQ, trnF, trnM,
trnV, trnA, trnD, trnN, trnP, trnI và trnK. Các gen ARN vận chuyển này
có kích thước gần giống nhau, dao động trong khoảng 62-69 nucleotide,
tương tự với các loài sán dẹt khác đã được nghiên cứu như F. hepatica,
Paragonimus westermani, Taenia solium, T. crassiceps
So sánh từng gen ARN vận chuyển của các phân lập O. viverrini,
chúng tôi nhận thấy các trình tự này đều giống nhau ở hầu hết các chuỗi
ARN vận chuyển. Tuy nhiên, cũng có một vài đột biến xảy ra ở trình tự
ARN vận chuyển, nhưng các đột biến này đều nằm ngoài vị trí của bộ ba
nucleotide của đối mã (anticodon), dùng để nhận biết bô ba mã hóa cho
amino acid mà chúng vận chuyển, nên cũng không làm ảnh hưởng đến
chức năng vận chuyển amino acid của chúng.
Trật tự của 10 gen ARN vận chuyển của các phân lập
O. viverrini


Hình 3.2: Phân tích mối quan hệ phả hệ trên cơ sở gen atp6 của các
phân lập O. viverrini và các loài C. sinensis (CsND), Paragonimus
westermani (PwKR), Fasciolopsis buski (FbL2), Fasciola gigantica
(FgIND), F. hepatica (FhUS), Echinococcus granulosus, G1 (EgG1),
Echinococcus granulosus, G4 (EgG4), Echinococcus mutilocularis (Em),
Taenia crasciceps (TcUS), T. solium (TsCN) và T. asiatica (TasTW).
Kết quả cho thấy, các phân lập O. viverrini của Việt Nam và Thái Lan
tập trung với nhau tạo thành nhóm phụ trong nhóm các loài thuộc lớp
Trematoda. Các loài sán dây thuộc lớp Cestoda nhóm họp cùng nhau tạo
thành một nhóm riêng tạo thành một trong 2 nhánh phân loại riêng biệt c
ủa
sán dẹt (Hình 3.2). Trong lớp Trematoda, các phân lập O. viverrini tập hợp
thành một nhóm; trong đó phân lập OvQN và OvPY3 xếp gần nhau và gần
với phân lập OvKK (Thái Lan) hơn so với phân lập OvBD1, phù hợp với
kết quả phân tích về mức độ tương đồng về thành phần nucleotide ở trên.
OvPY3atp6
OvQNatp6
OvKKatp6
OvBD1atp6
CsNDatp6
PwKRatp6
FbL2atp6
FgINDatp6

OvBD1atp6
CsNDatp6
PwKRatp6
FbL2atp6
FgINDatp6
FhUSatp6
EgG1atp6
EgG4atp6
Ematp6
TcUSatp6
TsCNatp6
TasTWatp6
0.05
OvPY3atp6
OvQNatp6
OvKKatp6
OvBD1atp6
CsNDatp6
PwKRatp6
FbL2atp6
FgINDatp6
FhUSatp6
EgG1atp6
EgG4atp6
Ematp6
TcUSatp6
TsCNatp6
TasTWatp6
0.05
Trematoda

thành một nhóm (Hình 3.4) bao gồm tất cả các phân lập phân lập tại các
vùng địa lý khác nhau của cùng một loài.
Hình 3.4: Phân tích mối quan hệ phả hệ giữa các phân lập O. viverrini
và Fh (F. hepatica) trên cơ sở gen nad1. Các phân lập O. viverrini cũng
tập hợ
p thành một nhóm và Fh (F. hepatica) tách thành một nhóm khác.
OvBD1nad3
OvKKnad3FF
OvLnad3
OvDL3nad3
OvQNnad3
OvPY3nad3
OvMHnad3
Csnad3FF
Pwenad3(Jn)
Fhnad3(AUS)
0.05
OvKKnad1
OvBD1nad1
OvQNnad1
OvPY3nad1
Fhnad1
0.05



OvBD1 OvQN OvPY3 OvKK

No % No % No % No %
T
1884 44,3 1876 44,1 1879 44,2 1877 44,2
C
517 12,2 525 12,3 524 12,3 525 12,3
A
676 15,9 677 15,9 677 15,9 676 15,9
G
1175 27,6 1174 27,6 1172 27,6 1174 27,6
A+T
2560 60,2 2553 60,0 2556 60,1 2553 60,1
G+C
1692 39,8 1699 40,0 1696 39,9 1699 39,9 20
3.4.2. Tương đồng thành phần nucleotide vùng gen ty thể 4,2 kb
giữa các loài sán dẹt thường gặp
Phân tích tương đồng thành phần nucleotide của vùng gen ty thể 4,2
kb giữa 10 loài sán dẹt bao gồm 6 loài thuộc lớp Trematoda (sán lá) và 4
loài thuộc lớp Cestoda (sán dây). Sáu loài sán lá đó là Opisthorchis
viverrini (4 phân lập đang nghiên cứu: OvBD1, OvQN, OvPY3, OvKK),
Clonorchis sinensis (phân lập Nam Định); FgIND: sán lá gan lớn Fasciola
gigantica (nguồn gốc Indonesia); FhAUS: Fasciola hepatica (nguồn gốc
Australia); FbL2: sán lá ruột lớn Fasciolopsis buski (từ lợn); PweKR: sán
lá phổi Paragonimus westermani (nguồn gốc Hàn Qu
ốc). Bốn loài sán dây

Hình 3.5: Quan hệ phân loại giữa O. viverrini và các loài sán dẹt trên cơ sở
phân tích toàn bộ chuỗi gen 4,2 kb. Các dấu móc chỉ mối quan hệ ngày
càng xa dần giữa các phân lập/loài sán lá. Sán dây có quan hệ xa hơn với
O. viverrini và sán lá (lớp Trematoda).

3.5. THẢO LUẬN CHUNG
Vùng gen dài 4,2 kb được chọn để giải trình trình tự vì vùng gen này
chứa các gen quan trọng của ty thể, bao gồm 5 gen mã hóa protein là gen
nad4, atp6, nad2, nad1, nad3 và 10 gen mã hóa cho ARN vận chuyển
amino acid. Vùng gen này bao gồm cụm gen nad4, atp6, nad2, nad1,
nad3, là các gen mã hoá và chịu trách nhiệm tổng hợp các enzym có vai
trò quan trọng trong hoạt động dẫn truyền điện tử và tạo năng lượng của ty

OvKK(4.2kb)
100
93
100
100
100
100
100
100
75
100
Emu(4.2kb)
EgG1(4.2kb)
Hdi(4.2kb)
FbL2(4.2kb)
FgIND(4.2kb)
FhAUS(4.2kb)
PweKR(4.2kb)
CsND(4.2kb)
OvBD1(4.2kb)
OvQN(4.2kb)
OvPY3(4.2kbOvPY3(4.2kb)
Tas(4.2kb)
Tso(4.2kb)
Emu(4.2kb)
EgG1(4.2kb
Hdi(4.2kb)
FbL2(4.2kb)
FgIND(4.2kb
FhAUS(4.2kb

FbL2(4.2kb)
FgIND(4.2kb
FhAUS(4.2kb
PweKR(4.2kb)
CsND(4.2kb
OvPY3(4.2kbOvPY3(4.2kb
OvKK(4.2kb)
100
93
100
100
100
100
100
100
75
100

22
Vùng gen ty thể dài 4,2 kb chứa khối gen atp6-nad2-nad1-nad3, đây
là khối gen được gọi là “điểm nóng” (“HOT SPOT”) trong hệ gen ty thể
của sán dẹt, điểm này đánh dấu có sự đảo vị trí hay/hoặc sắp xếp lại trật tự
của các gen. Các nghiên cứu trước đây của một số tác giả trên một số loài
sán dẹt cho thấy trật tự các gen mã hóa protein của sán lá gan nhỏ rất giống
với các loài sán dẹt khác như sán lá gan lớn (Fasciola spp), sán lá phổi
(Paragonimus westermani) hay sán máng châu Á (
Schistosoma japonicum,
S. mekongi ). Tuy nhiên, trật tự gen lại khác biệt đáng kể so với sán máng
châu Phi như Schistosoma mansoni, S. haematobium, S. intercalatum,
trước đây đã được phát hiện, đó là có sự sắp xếp lại trật tự của 2 khối gen

TAG. Gen nad2 của tất cả các phân lập O. viverrini có kích thước là 870
bp, mã hoá cho 289 amino acid. Bộ mã khởi đầu là ATG và bộ mã kết thúc
là TAG. Gen nad1của tất cả các phân lập O. viverrini là 903 bp, mã hoá

23
cho 300 amino acid. Bộ mã khởi đầu là GTG. Bộ mã kết thúc là TAG. Độ
dài của gen nad3 là 357 bp, mã hoá cho 116 amino acid, Bộ mã khởi đầu
cho gen nad3 là GTG. Bộ mã kết thúc cho gen nad3 là TAG.
Các gen ARN vận chuyển có kích thước gần giống nhau, dao động
trong khoảng 62-69 nucleotide. Trật tự của 10 gen ARN vận chuyển của
các phân lập O. viverrini trong đoạn gen phân tích là không có sự thay đổi
so với các loài sán lá khác đã được nghiên cứu. Các gen mã hóa cho các
ARN vận chuyển cũng có kích thước tương tự như
ở một số loài sán lá gan
khác như C. sinenensis, F. hepatica, F. gigantica, các gen này thường có
kích thước dao động trong khoảng 60-70 nucleotide. Các ARN vận chuyển
có cấu trúc dạng “cỏ 3 lá” “clover-leaf” chuẩn, đó là cấu trúc đặc trưng
của ARN vận chuyển có trong hệ gen ty thể và hệ gen nhân của tất cả mọi
loài.
Kết quả phân tích mối quan hệ phả hệ cho thấy các phân lập O.
viverrini được xếp vào cùng một nhóm, chứng tỏ chúng thuộc cùng một
loài và những s
ự sai khác giữa chúng là những đột biến cho phép giữa các
phân lập trong cùng loài. Phân tích mối quan hệ về loài trên cơ sở sử dụng
thành phần gen riêng rẽ mã hoá protein (atp6, nad1, nad3), hay toàn bộ
chuỗi gen dài 4.2 kb bao gồm tất cả các loại gen (mã hoá protein, gen
ARN vận chuyển) kể cả thành phần nucleotide không mã hoá của các vùng
giao gen, đều cho kết quả tương ứng về mối quan hệ phân loại của O.
viverrini với các loài trong ngành sán dẹt (Platyhelminthes).
Các kết quả thu được từ đo