Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/
i
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC CAO DUY PHÚC
NGHIÊN CỨU GIẢI MÃ TRÌNH TỰ HỆ GENOME
CỦA CHỦNG VIRUS XOĂN LÁ THUỐC LÁ
(TLCV) PHÂN LẬP TẠI VIỆT NAM Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học
Mã số: 60 42 0201 LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. LÊ VĂN SƠN
Hà Nội, ngày tháng năm 2013
Tác giả luận văn
Cao Duy Phúc
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/
ii
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC TỪ VIẾT TẮT
µg
microgam
µl
microlitre
bp
Base pair
CP
Coat protein (protein vỏ)
DNA
Deoxyribonucleic acid
dNTP
Deoxyribonucleotide triphosphate
E. coli
Escherichia coli
EDTA
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/
iii
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng
Tên bảng
Trang
1.1
Một số bệnh virus hại cây trồng quan trọng trên thế giới và đã
đƣợc xác định có ở Việt Nam ……………………………………
4
1.2
Một số bệnh trên cây thuốc lá do virus gây ra……………………
11
2.1
Nguồn gốc các mẫu thuốc lá nghiên cứu…………………………
23
2.2
Trình tự và thông số của hai mồi…………………………………
25
2.3
Thành phần phản ứng PCR cặp mồi prV324N/prC889N………….
26
2.4
Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR cặp mồi prV324N/prC889N…….
26
2.5
Thành phần phản ứng PCR cặp mồi TYLCV-A-R………………
27
iv
DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình
Tên hình
Trang
1.1
Cấu trúc genome của Begomovirrus có một vòng DNA (A) và
cấu trúc genome của TLCV có 2 vòng DNA (B)………
14
1.2
Cấu trúc vòng DNA-β ……………………………………………
17
1.3
Cây thuốc lá bị nhiễm bệnh xoăn lá ……………………………….
18
1.4
Bọ phấn Bemisia tabaci
20
2.1
Mô hình minh họa vị trí các mồi trên genome TLCV……………
25
2.2
Kết quả BLAST trình tự vòng DNA-A của thể phân lập HN……
45
3.9
Kết quả BLAST trình tự vòng DNA-A của thể phân lập BG……
46
3.10
Kết quả BLAST trình tự vòng DNA-A của thể phân lập LS………
46
3.11
Cây phát sinh chủng loại …………………………………………
49
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/
v
MỤC LỤC
Trang phụ bìa
Lời cảm ơn
i
Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt
ii
Danh mục các bảng
iii
Danh mục các hình
iv
Mục lục
v
20
CHƢƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
23
2.1. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU
23
2.1.1. Nguồn vật liệu
23
2.1.2. Chủng vi sinh vật, plasmid và các bộ kit
23
2.1.3. Hóa chất, máy móc và thiết bị
23
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/
vi
2.1.4. Địa điểm nghiên cứu
24
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
24
2.2.1. Tách chiết DNA tổng số
24
2.2.2. Phản ứng PCR
25
2.2.3. Phƣơng pháp điện di phân tích DNA trên gel agarose
27
2.2.4. Phƣơng pháp thôi gel
28
2.2.5. Gắn sản phẩm PCR vào vector tách dòng pBT
28
2.2.6. Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli DH5α bằng
41
3.2. ĐÁNH GIÁ SỰ ĐA DẠNG DI TRUYỀN
44
3.2.1. Kết quả so sánh trình tự nucleotide
44
3.2.2. Đánh giá tính đa dạng của các thể phân lập BG, HN, LS thông qua
cây phát sinh chủng loại
48
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
52
TÀI LIỆU THAM KHẢO
53 1
MỞ ĐẦU
Lý do chọn đề tài
Thuốc lá (Nicotiana tabacum L.) là cây công nghiệp ngắn ngày đƣợc trồng
nhiều nơi trên thế giới và có giá trị kinh tế cao. Không chỉ để sản xuất thuốc lá,
nó còn đƣợc sử dụng làm nguyên liệu sản xuất nicotin, axit hữu cơ, dùng làm
thuốc trừ sâu hay chiết xuất dầu thực vật từ hạt. Ngoài ra với khả năng dễ tái
sinh và chấp nhận gen ngoại lai thuốc lá còn đƣợc xem là cây mô hình quan
trọng trong nghiên cứu công nghệ sinh học cây trồng.
Tuy nhiên, với những đặc điểm sinh học của mình, thuốc lá là cây trồng
mẫn cảm với nhiều bệnh hại, đặc biệt là các bệnh do virus gây nên, ảnh hƣởng
nghiêm trọng đến năng suất và chất lƣợng cây thuốc lá. Trong đó có bệnh xoăn
lá do virus xoăn lá thuốc lá (Tobacco leaf curl virus, TLCV) gây nên. Khi cây
mắc bệnh virus, thiệt hại về năng suất có thể lên tới 95-100%. Cho đến nay
chƣa có một loại thuốc bảo vệ thực vật nào có khả năng chống lại bệnh do virus
Nội dung nghiên cứu
- Tách chiết DNA tổng số của TLCV
- Thực hiện phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu
- Tách dòng gen
- Đọc trình tự gen và phân tích trình tự
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/
3
CHƢƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. VIRUS THỰC VẬT
1.1.1. Các bệnh do virus thực vật gây ra hiện nay
Cho tới nay, hơn 2000 virus đã đƣợc phát hiện và công nhận, trong đó
khoảng 1000 là các virus gây hại thực vật. Các virus thực vật nhìn chung không
làm chết cây nhƣng chúng ảnh hƣởng nghiêm trọng đến sinh trƣởng, phát triển
của cây, năng suất và chất lƣợng nông phẩm. Nhiều trƣờng hợp, bệnh do virus
gây có thể là một trong các nguyên nhân chính cản trở sản xuất của một cây
trồng nào đó. Ở cây lâu năm, một số virus sau khi gây bệnh nặng trong mùa khi
có thời tiết và nhiệt độ ôn hòa, nhƣng khi nhiệt độ thấp hay quá cao thƣờng gây
giống vô tính trong phòng thí nghiệm, virus có khả năng lây lan rất lớn trong
việc phát triển công nghệ sinh học và các vùng trồng trọt công nghệ cao.
Cho tới nay, 52 virus thực vật thuộc 52 loài đã đƣợc xác định ở Việt Nam
(Bảng 1.1), phần lớn đã đƣợc giải trình tự. Trong số này, đa số là các virus
thuộc 2 chi Begomovirus (22 virus) và Potyvirus (18 virus). Đây cũng là 2
chi virus thực vật lớn nhất với mỗi chi chiếm khoảng 20 % tổng số virus
thực vật toàn thế giới. Ngoài ra, nhiều virus có ý nghĩa kinh tế, chẳng hạn các
virus gây bệnh trên lúa nhƣ bệnh lùn xoắn lá (Rice ragged stunt virus, RRSV),
bệnh lúa cỏ hay còn gọi là bệnh vàng lùn (Rice grassy stunt virus), bệnh lúa lùn
sọc đen (Southern rice black streaked dwarf virus, SRBSDV) cũng mới đƣợc
xác định chính xác [20].
Bảng 1.1: Một số bệnh virus hại cây trồng quan trọng trên thế giới và đã
đƣợc xác định có ở Việt Nam
STT
Tên bệnh
1
Bệnh xoăn vàng lá cà chua do nhiều begomovirus.
2
Bệnh chùn ngọn chuối do banana bunchytop virus (BBTV).
3
Bệnh đốm hình nhẫn đu đủ, bầu bí do papaya ring spot virus (PRSV).
4
Bệnh tàn lụi cây có múi do citrus tristeza virus (CTV).
5
Bệnh khảm lá khoai tây trên khoai tây do potato virus Y (PVY).
6
Bệnh khảm lá cây họ đậu do bean common mosaic virus virus (BCMV).
7
Bệnh tungro hại lúa nhƣ bệnh tungro do phức hợp 2 virus là rice tungro
bacilliform virus (RTHN) và rice tungro spherical virus (RTSV).
bằng một số cách nhƣ: Chọn giống từ nguồn sạch (ruộng không bị bệnh, khu
vực không bị bệnh), xử lý nhiệt, xử lý hóa chất để tiêu diệt virus tồn tại trên vỏ
hạt, nuôi cấy đỉnh sinh trƣởng, tạo giống in vitro, sử dụng hóa chất (ribavirin) để
tiêu diệt virus trong nuôi cấy mô.
*Biện pháp canh tác
Comment [SCD2]: in vitro
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/
6
.
. Tuy nhiên, nhiều loại virus nhƣ TMV
lây truyền qua đƣờng cơ giới, virus lây lan trực
: chỉ cần 1
con rầy nâu/cây lúa đã có thể truyền virus lùn lúa cỏ (RGSV).
*Sử dụng giống kháng bệnh mang gen kháng của cây
Quan hệ gen-đối-gen: đối với mỗi gen qui định tính kháng trong cây ký
chủ có một gen tƣơng ứng qui định tính không độc trong ký sinh và 2 gen này
tƣơng tác đặc hiệu với nhau. Quan hệ gen-đối-gen cho tới nay đã đƣợc chứng
minh là tồn tại trong rất nhiều loại bệnh do hầu hết các nhóm tác nhân gây bệnh
(nấm, vi khuẩn, virus, tuyến trùng, mollicus ) gây ra. Các gen cây ký chủ qui
định tính kháng đƣợc gọi chung là gen R (Resistance). Các gen ký sinh qui định
tính không độc của ký sinh đƣợc gọi chung là gen Avr (Avirulence). Tính kháng
của cây trồng tuân theo quan hệ gen-đối-gen đƣợc gọi là tính kháng gen-đối-gen.
Tính kháng gen-đối-gen thƣờng là tính kháng đặc hiệu ký chủ, tính kháng đơn
gen, tính kháng gen chủ, tính kháng không bền vững. Hậu quả của một phản ứng
kháng gen-đối-gen thƣờng là phản ứng siêu nhạy/apoptosis.
Cho tới nay, rất nhiều gen kháng R của cây đã đƣợc xác định. Sản phẩm
của các gen này gọi là các protein kháng R. Hiện nay, các protein kháng R đƣợc
chia thành 5 lớp dựa trên đặc điểm cấu trúc và vị trí hoạt động của chúng trong
tế bào ký. Các protein trong cùng lớp nhìn chung khá bảo thủ. Các protein kháng
có kích thƣớc biến động trong khoảng 30-34 nm. Virus lớn nhất dạng cầu là
Tomato spotted wilt virus cũng chỉ có đƣờng kính 80 nm. Nhóm Rhabdoviridae
là virus dạng vi khuẩn to nhất (135-380 x 45-96 nm). Virus dài nhất là các virus
dạng sợi nhóm Closterovirus dài 2000 x 12 nm. Chúng nhỏ bé nhƣ vậy nên việc
tìm kiếm phát hiện đòi hỏi phải có những phƣơng pháp đặc biệt.
Virus có cấu tạo rất đơn giản, chúng có 2 thành phần chính là protein và
nucleic acid. Lõi nucleic acid ở bên trong đƣợc bao bằng một lớp vỏ protein
(capsid). Hầu hết virus thực vật có genome RNA sợi đơn mạch (+) và nhiều
dạng có capsid hình que, các protein capsomer hình xoắn. Ví dụ: Tobacco
mosaic virus (TMV) Genome TMV là RNA sợi đơn. Genome của chúng mã hoá
ít nhất 4 chuỗi polypeptid. Protein 130 và 180 kDa đƣợc dịch mã trực tiếp từ
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/
8
cùng một codon bắt đầu trên RNA bộ gene. Hai protein khác, 30 kDa và protein
vỏ đƣợc dịch mã từ đoạn RNA. Protein 130 và 180 kDa liên quan với sao chép
virus, trong khi đó protein 30 kDa cần cho sự di chuyển của virus từ tế bào này
đến tế bào khác. Vì vậy 3 loại protein này cần cho sự nhân lên của virus trong
toàn bộ cây. Các virus DNA Virus thực vật có bộ gene DNA rất hiếm, chỉ gồm 2
nhóm: tuy nhiên 2 nhóm virus thực vật đƣợc nghiên cứu nhiều nhất có chứa
genome DNA: Cauliflower mosaic virus (CaMV) và gemini virus.
Cauliflower mosaic virus: CaMV đƣợc nghiên cứu nhiều nhất trong nhóm
Caulimovirus. Đây là nhóm virus dạng cầu, chứa genome DNA vòng tròn, mạch
kép, kích thƣớc khoảng 8 kb. Caulimovirus gây ra một số bệnh làm thiệt hại
kinh tế cấy trồng. Chúng có phổ vật chủ hạn chế, chỉ nhiễm cây 2 lá mầm.DNA
của CaMV có cấu trúc không bình thƣờng, có 3 điểm gián đoạn trên sợi kép, hai
điểm trên một sợi và một điểm trên sợi còn lại với những vùng trình tự overlap.
Ngoài ra DNA CaMV có ribonucleotide gắn với đầu cuối 5’ của điểm gián đoạn.
Từ các nghiên cứu ở CaMV [22], [30] cho rằng sao chép CaMV liên quan với
phiên mã ngƣợc qua trung gian RNA của bộ gene. Chu trình sao chép giống với
capsomeres có 158 amino acid và có trọng lƣợng 1800 Daltons. Virion có
chiều dài 300 mm và đƣờng kính là 18mm. Các tiểu đơn vị protein liên kết
chặt chẽ tạo thành cấu trúc dạng xoắn (độ khoảng 2,3 nm hay 16 + 1/3 tiểu đơn
vị/vòng) xung quanh một ống trụ có bán kính khoảng 2nm. Một sợi đơn RNA
dài 6395 nucleotide, có cấu trúc xoắn tƣơng tự (49 nucleotide/vòng hay 3
nucleotide/tiểu đơn vị) có bán kính khoản 4nm, và liên kết với bề mặt trong của
tiểu đơn vị protein. Virus có thể phân tách thành acid nucleic và vỏ protein và
cũng có thể hợp nhất lại thành dạng virus gây bệnh bền vững.
TMV có thể gây bệnh trên rất nhiều loại cây trồng và cây dại khác nhau
nhƣng nhiều nhất là trên cây thuốc lá. Đây là bệnh rất phổ biến trên cây thuốc lá,
gây hại nghiêm trọng đến năng suất và chất lƣợng của lá thuốc, nhất là đối với
thuốc lá sợi vàng. Bệnh còn có tên là bệnh hoa lá vàng. Bệnh có thể tấn công
cây con, cây trƣởng thành và cả cây đời tái sinh. Bệnh nặng và phân bố rộng ở
nhiều nơi và vào bất kỳ mùa vụ nào trong năm. Bệnh xuất hiện càng sớm thì
càng ảnh hƣởng đến năng suất. Tuy nhiên, phẩm chất của lá thuốc thƣờng bị tác
hại nghiêm trọng hơn so với tác hại về năng suất: lá thuốc bị bệnh, sau khi sấy,
lá sẽ bị nâu đen, dòn, dễ bị nát vụn ra, không có mùi vị thơm ngon và hút nặng.
Khi cây bị bệnh các lá non đều biến màu thành dạng khảm bao gồm các
vùng xanh nhạt xanh đậm không đều xen lẫm nhau, hình loang lổ nhƣ da ếch,
hay còn gọi là dạng khảm. TMV đƣợc lan truyền bằng đƣờng cơ giới do tiếp xúc
virus thâm nhập vào các tế bào qua vết thƣơng và qua khí khổng lá, thân hoặc
rễ. TMV rất bền nhƣ ở dạng kết tủa cồn, ở lá khô virus vẫn còn hoạt tính gây
bệnh sau một năm.
1.2.2. Virus gây bệnh khảm dƣa chuột (Cucumber mosaic virus, CMV)
CMV thuộc loại Cucumovirus, họ Bromoviridae đƣợc Price phát hiện lần
đầu tiên vào năm 1934 ở Mỹ. Loài virus này phân bố khắp nơi trên thế giới, phổ
biến ở vùng có khí hậu ôn hòa. CMV là loại virus thực vật có phổ gây bệnh rộng
nhất với số loại cây có thể bị lây nhiễm lên đến 1000 loài [18], [29] bao gồm 85
Comment [SCD10]: Cucumber mosaic virus,
CMV
1.2.3. Virus gây bệnh héo đốm cà chua (Tomato Spotted Wilt Virus, TSWV)
TSWV là virus thuộc loại Tospovirus họ Bunyaviridae, đƣợc phát hiện lần
đầu tiên vào năm 1915 khi gây thiệt hại lớn trên cà chua trồng ở Australia.
TSWV có phổ ký chủ rất rộng, trên 600 loài và 70 họ thực vật, trải dài trên khắp
các lục địa. Trong số đó, cỏ dại là nguồn chứa TSWV chính [2]. Tospovirus
đƣợc đánh giá là một trong mƣời nhóm virus gây bệnh cây nghiêm trọng nhất.
Virus thuộc họ này có vật liệu di truyền là ssRNA. Genome của TSWV gồm ba
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/
11
phần: Một sợi RNA âm tính và hai sợi ambisene. Ba sợi RNA này khác nhau về
kích thƣớc và đƣợc gọi là Large (L), Middle (M), Short (S). Mỗi RNA đƣợc bao
bọc bởi nhiều bản copy của 1 tiểu đơn vị Nucleocapside (N) và 10 – 20 bản sao
của protein lớn (L) là polymerase của virus [5]. Giữa các đoạn L, M, S có trình
tự kết thúc nhƣ nhau. TSWV hình cầu, đƣờng kính 80 – 110 nm. TSWV đƣợc
truyền từ cây này sang cây khác thông qua nhiều loài bọ trĩ khác nhau.
Cây nhiễm TSWV có triệu chứng chung là xuất hiện các vòng tròn đồng
tâm, những đốm héo trên lá non do sự hoại tử của các mô, có đốm lấm
chấm. Đầu tiên những đốm này có màu vàng, nhƣng sau đó những vùng bị chết
sẽ chuyển sang màu nâu đỏ. Từ cây con đến cây trƣởng thành đều có thể bị
TSWV tấn công. Khi bị nhiễm virus, cây trồng bị cằn cỗi, còi cọc, chồi phát
triển nghiêng về một bên (ne ngọn). Hình thái của cây thay đổi: Lá cây nhăn
nheo, vặn vẹo, nhƣ bóp nát, thân cây bị uốn cong, ngã, rủ xuống, phát triển bất
thƣờng. Cây bị bệnh không phát triển trong nhiều tuần, lá rụng dần và chết. Cây
trồng bị nhiễm bệnh vào giai đoạn đang phát triển thì có thể không ra quả hoặc
có quả nhƣng rất nhỏ, có các đốm nhỏ hay các vòng hoại tử hay thể khảm trên
vỏ quả. Đặc điểm này làm giảm đi giá trị cảm quan khi sử dụng hay dùng
thƣơng phẩm. Tuy nhiên, triệu chứng này có thể giống với các bệnh do các virus
khác, vi khuẩn, nấm hay stress môi trƣờng gây ra. Vì thế cách chẩn đoán bệnh
theo triệu chứng bên ngoài chỉ là cách xác định bệnh nhất thời nên có thể không
Tái tổ hợp Tobacco vein distorting virus (virus gây bệnh biến
dạng gân lá thuốc lá) và tobacco mottle virus (virus gây đốm thuốc
lá)
8
Kỵ axit thuốc lá
Tobacco etch virus (virus gây bệnh kỵ axit thuốc lá)
9
Xoăn thuốc lá
Tobacco leaf curl virus (virus gây xoăn thuốc lá)
10
Khảm thuốc lá
Tobacco mosaic virus (virus gây bệnh khảm thuốc lá) và Satellite
tobacco mosaic virus (virus gây bệnh khảm thuốc lá vệ tinh)
11
Hoại tử thuốc lá
Tobacco necrosis virus (virus gây hoại tử thuốc lá)
12
Bung hạt thuốc lá
Tobacco rattele virus (virus gây bung hạt thuốc lá)
13
Đốm vòng thuốc lá
Tobacco ring spot virus (virus gây bệnh đốm vòng thuốc lá)
14
Sọc thuốc lá
Tobacco streak virus (virus gây bệnh sọc thuốc lá)
15
Còi cọc thuốc lá
Tobacco stunt virus (virus gây bệnh còi cọc thuốc lá)
16
Vằn gân thuốc lá
có trọng lƣợng khoảng 28-34 đvC, gồm hai capsom giống nhau, mỗi capsom
gồm 5 phân tử protein (Murphy et al., 1994). Khi soi dƣới kính hiển vi thấy các
hạt virion thuần khiết luôn ở dạng cầu ghép đôi. Mỗi hạt trong cặp chỉ chứa một
trong hai loại DNA có trình tự nucleotide khác nhau.
Những loài Begomovirus phát hiện trƣớc đây có hệ gen gồm các gen
trùm nằm trên cùng một vòng DNA-A sợi đơn kích thƣớc khoảng 2,7 kb (thể
monopartite). Sau đó, ngƣời ta phát hiện nhiều chủng virus có hệ gen gồm 2
vòng DNA sợi đơn tách biệt với kích thƣớc xấp xỉ nhau khoảng 2,6 - 2,8 kb là
DNA-A và DNA-B (thể bipartite). Gần đây, ngƣời ta còn phát hiện một số loài
thuộc nhóm một vòng gen ngoài vòng DNA-A còn có một hoặc hai vòng DNA
vệ tinh (DNAβ và DNA1) với kích thƣớc xấp xỉ một nửa DNA-A có tác dụng
tăng cƣờng biểu hiện triệu chứng bệnh trên cây chủ [8]; [11]; [20].
Dựa vào hệ thống phát sinh loài và sự sắp xếp các gen trong genome,
Begomovirrus đƣợc chia làm hai nhóm chính: (1) nhóm virus OldWorld (OW)
gồm những virus có nguồn gốc phát sinh từ các vùng Đông bán cầu, Châu Phi,
Châu Âu và một số khu vực thuộc Châu Á và (2) nhóm virus NewWorld (NW)
có nguồn gốc phát sinh ở Tây bán cầu và Châu Mỹ [28]. Tất cả các virus thuộc
nhóm NW đều là thể bipartite trong khi cả hai thể monopartite và bipartite đều
xuất hiện trong nhóm OW. Bên cạnh đó, DNA-A của các virus bipartite trong
nhóm NW đều thiếu khung đọc ORF của AV2 [40]. Protein vỏ của chúng mang
một motif (vùng cấu trúc) có tên là PWRsMaGT ở đầu 5’ trong khi nhóm OW
thì không có. Hầu hết các dẫn chứng về phát sinh chủng loại đều cho rằng các
virus NW phát sinh sau OW từ sau thời kỳ phân tách lục địa của Châu Mỹ từ
Gondwara [35]. Tuy nhiên, gần đây các nhà khoa học đã phân lập một số chủng
virus thuộc khu vực OW nhƣng có sự tƣơng đồng chặt chẽ với virus NW. Điều
này gợi ý rằng những virus NW có thể có mặt trong OW từ trƣớc thời kỳ phân
tách lục địa [20].
trúc genome của TLCV có 2 vòng DNA (B)
(A)
(B)
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/
15
việc nhận biết điểm khởi đầu origin đƣợc định vị trong vùng IR. Rep là protein
đa chức năng vừa khởi đầu, kết thúc tổng hợp DNA virus, đồng thời gây ra sự
tích lũy nhân tố phiên mã vật chủ trong tế bào lây nhiễm. Những nghiên cứu ban
đầu trên Begomovirus cho thấy AC1 có 3 motif bảo thủ là motif I, II và III ở đầu
N của protein Rep là cần thiết cho hoạt động chức năng. Motif I (FLTY) cần
thiết cho quá trình bám dsDNA đặc hiệu trong khi motif II (HLH) là một vị trí
bám sửa có thể liên quan với protein tƣơng thích và phân cắt DNA [3]. Motif III
(YxKD/E) là một vị trí xúc tác cho phân cắt DNA. Trong tái bản DNA virus,
protein Rep liên kết đặc hiệu với dsDNA tại một trình tự bảo thủ trong cấu trúc
vòng của sợi con mới và hoạt động nhƣ tác nhân mở xoắn DNA virus trong suốt
quá trình tái bản sợi mới [24], [27]. Bên cạnh hoạt động xúc tác, motif chức
năng phía đầu N cũng gián tiếp liên kết với trình tự đặc hiệu của dsDNA và đảm
bảo sự nhận dạng các thành phần genome cùng họ đến một Rep đã định.
Trong quá trình hoạt động, protein Rep tƣơng tác với các protein khác. Sự
hình thành các phân tử protein Rep cùng họ cần thiết cho sự liên kết với ssDNA
và hoạt động của helicase [27]. Rep tƣơng tác với protein AC3 trong việc tăng
cƣờng tích lũy DNA virus và tƣơng tác với protein vỏ trong việc giảm hoạt động
phân tách và kết nối in vitro. Bên cạnh đó, Rep liên kết với một vài protein tế
bào chủ liên quan đến biểu hiện gen bao gồm PCNA (proliferating cell nuclear
antigen - Protein tích lũy phiên mã) [4], RPA (protein bám sợi đơn), histon H3
và một số protein liên quan đến phân bào.
(3) Gen C2 mã hóa protein AC2 (protein hoạt hóa phiên mã - TrAP
protein) có trọng lƣợng khoảng 15 kDa. AC2 chứa một trình tự cấu trúc định vị
nhân (NLS-nuclear localization signal), một hạch trung tâm với vùng cấu trúc
mặt của AC2 hoạt động là đích của quá trình RNA silencing có vai trò hoạt hóa
quá trình phiên mã gen CP, preCP và điều khiển biểu hiện gen của cả virus và tế
bào vật chủ.
(4) Gen C3 mã hóa protein AC3 khối lƣợng phân tử khoảng 16 kDa
(protein tăng cƣờng tái bản - REn protein) có vai trò hoạt hóa quá trình tái bản
và cùng với gen C1 tăng cƣờng khả năng phân chia hệ gen virus; Protein REn
không trực tiếp cần thiết cho sao chép DNA của virus, nhƣng nó có tác dụng làm
tăng tích lũy số lƣợng dsDNA và ssDNA của virus trong suốt quá trình lây
nhiễm và do đó gián tiếp ảnh hƣởng đến mức độ biểu hiện triệu chứng. Protein
REn hoạt động có thể tƣơng tác với một số protein nhƣ Rep, PRB và với chính
nó. Điều này có ý nghĩa cho sự tồn tại của một mạng lƣới phức tạp của các mối
tƣơng tác chức năng giữa Rep, REn, và PRB. Protein REn cũng tƣơng tác với
một số protein mã hóa của tế bào chủ là PCNA và pRBR.
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/
17
(5) Gen C4 đƣợc nằm trùm trong gen C1 trên vòng DNA-A nhƣng khác
khung đọc mã hóa cho protein AC4 có khối lƣợng khoảng 12 kDa. Trình tự
amino acid của nó có độ bảo thủ kém nhất trong các protein của Begomovirus.
AC4 có chức năng điều khiển chu kỳ sống và tham gia vào vận chuyển virus.
Những thí nghiệm trƣớc đây với TGMV (Tomato golden mosaic virus) đã chỉ ra
rằng C4 không cần thiết cho lây nhiễm virus [14] nhƣng bằng các thí nghiệm đột
biến với C4 của TYLCSV (Tomato yellow leaf curl sardina virus) và ToLCV đã
chứng tỏ chức năng sinh học thích hợp của nó nhƣ là một yếu tố lây nhiễm nhân
tạo.
(6) Gen V2 (preCP) mã hóa cho protein AV2 kích thƣớc khoảng 13 kDa
(protein vận chuyển - MP protein) liên quan đến biến đổi hình thái virus và vận
chuyển virus giữa các tế bào trong cây chủ. Đột biến xảy ra trong gen này dẫn
đến nhiễu loạn tỷ số ssDNA/dsDNA và ảnh hƣởng đến biểu hiện bệnh trên cây
chủ [32]. Những khám phá gần đây cho thấy trong các chủng Begomovirus
trong đó có chứa một đoạn gen mã hóa phức hợp protein tái bản có trọng lƣợng
khoảng 36 kDa, một trình tự giàu adenin khoảng 200 nucleotide và một điểm khởi
đầu tái bản nằm trên cấu trúc vòng sterm-loop chứa trình tự bảo thủ TAGTATT/AC
giống nhƣ những nanovirus khác. DNA1 có khả năng tự tái bản nhƣng cần sự trợ
giúp của virus cho quá trình biểu hiện và vận chuyển trong cây chủ. DNA1 hiện
chƣa xác định là có ảnh hƣởng lên sự biểu hiện bệnh của cây chủ [8].
1.3.3. Triệu chứng và cơ chế lây bệnh
Ở cây bị bệnh sẽ phát triển chậm chạp, cây còi cọc và lùn thậm chí ngừng
sinh trƣởng. Lá ngọn bị xoăn vào trong, méo mó biến dạng và thu nhỏ kích
thƣớc. Lá ngoài thì cúp xuống và cứng, có hiện tƣợng lá bị biến dạng nhƣ gân lá
trở nên dày, xoăn lại và các lá phía trên nhỏ cong queo (Hình 1.3). Do lá biến
dạng các mạch dẫn bị tắc, phá vỡ sự vận chuyển tinh bột trong lá, hình thành các
mạch dẫn mới xung quanh mô tƣợng tầng. Sự phát triển vô tổ chức làm lá biến
dạng sâu sắc mất đi sự khác biệt giữa mặt trên và mặt dƣới của lá. Hoa ít và
thƣờng bị thui, quả nếu có thƣờng khô, chín không đều và chất lƣợng kém.
Hình 1.3: Cây thuốc lá bị nhiễm bệnh xoăn lá
(Nguồn: http://www.forestryimages.org/browse/detail.cfm?imgnum=1402091)
Copyright: Tài liệu đại học ©