THU NHẬN POLY -  HYDROXYBUTYRATE,
MỘT LOẠI NHỰA SINH HỌC DỄ PHÂN HỦY,
TỪ VI KHUẨN METHYLOBACTERIUM SP. PHÂN LẬP
TẠI VIỆT NAM
PRODUCTION OF POLY -

-

HYDROXYBUTYRATE, A BIODEGRADABLE
POLYMER, BY METHYLOBACTERIUM SP. ISOLATED IN VIETNAM LÊ LÝ THÙY TRÂM
Trường Đại học Bách khoa, Đại học Đà Nẵng
KIỀU PHƯƠNG NAM, BÙI VĂN LỆ
Trường ĐH Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hồ Chí Minh TÓM TẮT
PHB (poly--hydroxybutyrate), một loại nhựa sinh học chịu nhiệt, dễ phân hủy, đang được
quan tâm như là một nguồn thay thế lý tưởng cho nhựa tổng hợp bởi nó có các tính chất
tương tự nhựa tổng hợp. PHB được tích lũy trong tế bào nhiều loài vi sinh vật với hàm lượng
khác nhau. Chủng Methylobacterium sp. (kí hiệu Mcd), được phân lập từ môi trường nuôi cấy
mô cây chanh dây tạp nhiễm vi khuẩn màu hồng, có thể phát triển trên môi trường khoáng
căn bản với methanol 1% là nguồn C và lượng PHB tạo ra chiếm 31,37 % tổng lượng sinh
khối khô sau 4 ngày nuôi cấy. Sản xuất PHB theo con đường sinh học từ nguồn C rẻ tiền
(methanol) đang mở ra một hướng nghiên cứu và ứng dụng mới đầy triển vọng ở nước ta
hiện nay.
ABSTRACT
PHB (poly--hydroxybutyrate), a biodegradable thermoplastic material, has been considered
as an attractive substitute for petroleum-derived synthetic plastic because it has properties

khuẩn Methylobacterium sp., là nhóm vi khuẩn sắc tố hồng, có khả năng sử dụng methanol
làm nguồn cung cấp Carbon và tổng hợp PHB theo con đường biến dưỡng serine. Từ nguồn
nguyên liệu rẻ tiền (methanol) có thể sản xuất được PHB, một sản phẩm nhựa có giá trị ứng
dụng, chúng tôi hy vọng sẽ mở ra một hướng nghiên cứu mới để giải quyết vấn đề ô nhiễm
môi trường hiện nay.

2. VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP
2.1. Chủng vi khuẩn, môi trường nuôi cấy và điều kiện tăng trưởng
Chủng vi khuẩn được phân lập từ môi trường nuôi cấy mô cây chanh dây bị tạp nhiễm
vi khuẩn có sắc tố hồng trên môi trường MMS có bổ sung 1% methanol. Chủng thuần được
phân tích các đặc điểm sinh lý, sinh hóa và hình thái, kết hợp với giải trình tự vùng 16S rDNA
nhằm tiến hành định danh. Kết quả cho thấy chủng vi khuẩn này thuộc chi Methylobacterium
(kí hiệu là Mcd).
Môi trường nuôi cấy được sử dụng có thành phần như sau: 1% (v/v) methanol, 0,1 g/L
cao nấm men, 1 g/L (NH
4
)
2
SO
4
, 0,45 g/L MgSO
4
.7H
2
O, 1,305 g/L KH
2
PO
4
, 4,02 g/L
Na

O, 130 g/L ZnSO
4
.7H
2
O, 100
g/L MnSO
4
.H
2
O, pH =7.[2]
Khuẩn lạc được cấy vào các erlen 250mL chứa 100mL môi trường, nuôi lắc 150v/p ở
nhiệt độ 29 ± 1
0
C. Tiến hành ly tâm thu sinh khối ở 8500v/p trong 20 phút vào các thời điểm
khác nhau (24h, 48h, 72h, 96h và 120h). Sinh khối được sấy khô hoàn toàn ở 65
0
C và cân
trọng lượng.
2.2. Xác định hàm lượng PHB trong sinh khối vi khuẩn
Sau khi ester hóa chuyển PHB về dạng -hydroxybutyric methyl ester, hàm lượng
PHB trong sinh khối vi khuẩn ở các thời điểm nuôi cấy khác nhau được xác định bằng
phương pháp sắc ký khí (GC - Gas Chromatography) với acid benzoic là chất nội chuẩn [5].
Đường chuẩn được xây dựng với chất chuẩn là PHB (hãng Aldrich,USA)
2.3. Tách chiết PHB
Đồng nhất 0,1g sinh khối khô thành bột mịn, sau đó hòa trong 3mL NaOCl 5% và
vortex mạnh cho đến khi sinh khối trắng hoàn toàn. Sau đó, bổ sung 4mL chloroform, vortex
đều và ủ ở 60
0
C trong 60 phút. Ly tâm 8000v/p trong 15 phút để thu nhận phân lớp
chloroform có hòa tan PHB. Để bay hơi chloroform tự nhiên thu được một dạng bột trắng.

khi, hàm lượng PHB đạt cực đại ở ngày thứ 4 (0,252 g/L môi trường, chiếm 31,37% tổng sinh
khối khô vi khuẩn) và sau đó giảm dần. Như vậy, trong giai đoạn đầu, khi nguồn C còn dồi
dào, vi khuẩn sử dụng chính methanol làm nguồn C để sinh trưởng và tích lũy PHB. Tuy
nhiên, sau ngày thứ 4, có lẽ nguồn C trong môi trường đã cạn kiệt nên vi khuẩn sử dụng chính
PHB tích lũy trong tế bào làm nguồn C dẫn tới sự suy giảm hàm lượng PHB trong nội bào. Từ
kết quả này, chúng tôi cũng đã thử nghiệm tăng hàm lượng methanol bổ sung vào môi trường
lên 2%, tuy nhiên tốc độ tăng trưởng lại giảm so với methanol 1%. Rất có thể, nồng độ
methanol 2% có ức chế đến sự tăng trưởng tế bào. Thử nghiệm bổ sung methanol 1% vào môi
trường sau ngày thứ 4 cho kết quả sinh khối vẫn không tăng đáng kể trong các ngày thứ 6 và
thứ 7. Điều này có thể là do lượng dinh dưỡng tổng cộng trong môi trường đã cạn kiệt. Như
vậy trong điều kiện nuôi cấy đã khảo sát, chủng Mcd tích luỹ PHB cực đại vào ngày thứ 4
nuôi cấy.
3.2. Kết quả tách chiết PHB
Từ kết quả khảo sát hàm lượng PHB trong sinh khối qua các thời điểm khác nhau,
sinh khối sau 4 ngày nuôi cấy được chọn để tách chiết PHB. Sau khi ly tâm, có sự hình thành
3 phân đoạn: lớp trên cùng là NaOCl, lớp giữa là cặn tế bào đã bị cắt bới NaOCl nhưng không
tan trong chloroform và lớp dưới cùng là chloroform có hòa tan PHB. Hàm lượng bột trắng
thu được so với tổng sinh khối khô đem chiết chỉ đạt khoảng 20-25%. So sánh với kết quả xác
định hàm lượng PHB trong sinh khối bằng phương pháp GC (31,37%) cho thấy có sự chênh
lệch. Sai số này có thể giải thích là do sự hao hụt sản phẩm trong quá trình tách chiết do chưa
có các thiết bị chuyên dùng.
Hình 3. Phổ
13
C-NMR với các mũi tương ứng 4 loại C trong cấu trúc của PHB
CDCl
3
1
3
2
4
O
CH
CH
3
CH
2
C
O
1
2
3
4
n
CDCl
3
1
3
2
4

2
3
4
n
1
2
3
4
n Hình 4. Phổ
1
H-NMR với các mũi tương ứng với 3 loại H trong cấu trúc của PHB

* Các đặc tính lý hóa của sản phẩm

Các thông số
PHB tách chiết PHB chuẩn (Aldrich,USA)
Mw (g/mol) 1.2793 x10
5
7.0464x10
5
D (độ đa phân tán) 3.8034 3.2738

Bảng 1. So sánh các thông số về phân tử lượng bằng phương pháp GPC
của sản phẩm và chất chuẩn

TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] Anderson AJ, Dawes EA, Occurrence, metabolism, metabolic role and industrial uses
of bacterial polyhydroxyalkanoates, Microbiological Rewiews, p.450-472, 1990.
[2] Bourque D., Pomerleau Y., Groleau D., High-cell-density production of poly-

-
hydroxybutyrate (PHB) from methanol by Methylobacterium extorquens: production
of high-molecular-mass PHB, Appl Microbiol Biotechnol 44: p367-376, 1995.
[3] Lundgren D.G., Alper R., Schnaitman C., Marchessault R.H., Characterization of
poly-

-hydroxybutyrate extracted from different bacteria, Journal of Bacteriology,
1965.
[4] Kim Pil, Kim Jung-Hoe, Oh Deok-Kun, Improvement in cell yield of
Methylobacterium sp. by reducing the inhibition of medium components for poly-

-
hydroxybutyrate production, Journal of Microbiol and Biotech 19:357-361, 2003.
[5] Riis V, Mai W., Gas chromatographic determination of poly-

-hydroxybutyric acid
in microbiol biomass after hydrochloric acid propanolysis, Journal Chromatogr,
445:285 -289, 1988.