1
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC BÀI TIỂU LUẬN MÔN CHẨN ĐOÁN BỆNH GIA SÚC, GIA CẦM BẰNG KỸ
THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ
CHỦ ĐỀ :
CHẨN ĐOÁN PHÂN BIỆT CÁC TYPE PRRS

Giáo viên hướng dẫn : PGS.TS Nguyễn Ngọc Hải

Sinh viên thực hiện : Nguyễn Thị Thanh Nga MSSV : 06126084
Lớp : DH06SH
2


I. ĐẶT VẤN ĐỀ
PRRS : hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp trên heo (Porcine Reproductive And
Respiratory Syndrome).Bệnh này xảy ra với các biểu hiện rối loạn sinh sản trên
heo nái và hô hấp trên heo thịt, gây thiệt hại đáng kể cho nhà chăn nuôi.
Bệnh xuất hiện đầu tiên ở Bắc mỹ vào đầu những năm 1980, sau đó bệnh xuất hiện
ở Châu Âu và Châu Á.Và ở Việt Nam bệnh được phát hiện vào năm 1997 trên đàn
lợn nh
ập từ Mỹ.
Hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp trên heo nhiều lần đã bùng phát thành dịch ở
nhiều nơi trên thế giới
Khi phân tích về mặt di truyền người ta xác định được các dòng virus PRRS :
dòng châu Âu (chủ yếu là Lelystad) , dòng châu Mỹ (chủ yếu là VR-2332).Và
trong những năm gần đây thì còn phát hiện thêm dòng virus có nguồn gốc từ Trung
Quốc với mức độ gây bệnh khá nguy hiểm.
Vì vậy viêc chuẩn đoán phân biệt
được các type là điều rất cần thiết vì như vậy thì
ta có thể áp dụng được việc sử dụng nguồn vaccine có hiệu quả, sử dụng phương
pháp phòng chống bệnh thích hợp.
Phát hiện kháng thể, phân lập virus trên môi trường nuôi cấy tế bào, và RT-PCR là
các phương pháp phổ biến sử dụng để chuẩn đoán PRRS. Tùy thuộc vào thời gian
nhiễm bệnh và mẫu thí nghiệm có sẵn mà lựa chọn phương pháp chuẩn
đoán thích
hợp nhất.
Để chẩn đoán phân biệt được các type virus PRRS thì ta có thể dùng kỹ thuật RT-
PCR , nested PCR , cắt phân đoạn đa hình (RFLP), ELISA.
Với các kỹ thuật trên, kỹ thuật RT-PCR định lượng với thuốc nhuộm TaqMan
được xem là thành công nhất cho việc nghiên cứu chuẩn đoán bệnh .Kỹ thuật này
có thể phát hiện và cho thấy sự khác nhau của 2 dòng PRRSV EU và US.


II.2 Giới thiệu về phương pháp phát hiện

Trong các phương pháp dùng để phát hiện PRRSV thì phương pháp thành
công nhất để phát hiện acid nucleic đặc trưng của PRRSV là RT-PCR (Reverse
Transcription Polymerase chain reaction).
Một số phương pháp RT-PCR được thiết lập để phát hiện PRRSV, nhưng có một
vài trong số này không thể phân biệt được dòng virus PRRS EU và US. Và chỉ có
RT-PCR định lượng là có thể phát hiện được.
RT-PCR thông thường tốn thời gian hơn TaqMan
®
RT-PCR (định lượng) và dễ bị
nhiễm DNA từ lần PCR trước.Hơn nữa, nó đòi hỏi 1 số bước trước và sau khi
khuếch đại. Sự phát triển của công nghệ TaqMan là 1 sự cải tiến đáng kể trong
phương pháp phát hiện bằng cách cho phép phân tích định lượng.
Nguyên tắc hoạt động của TaqMan
®
là cắt probe (sợi đôi) được đánh dấu huỳnh
quang ở đầu 5’ và chất hấp phụ huỳnh quang ở đầu 3’ nhờ hoạt động 5’- 3’
exonuclease của các Taq DNA polymerase (chịu nhiệt).
Không chỉ các primer mà các probe đều có thể gắn đặc hiệu với trình tự đích, do
đó, ngay cả khi sản phẩm khuếch đại không đặc hiệu được tạo ra thì sẽ không thu
được tín hiệu TaqMan dương tính vì các probe không gắn vào các phân tử DNA.
Khi 2 primer được chọn ch
ỉ để khuếch đại 1 đoạn DNA ngắn có chứa probe có các
vị trí gắn kết thì hiệu quả khuếch đại sẽ được nâng cao.Nhiều thí nghiệm có thể
được phát triển dễ dàng bởi vì có thể đánh dấu các probe với các thuốc nhuộm
huỳnh quang khác nhau. Do sự khác biệt lớn về chiều dài bước sóng để phát ra tín
hiệu của thuốc nhuộm huỳnh quang VIC và FAM , Sequence Detector SDS 7700
có thể phân biệt đồng thời được các tín hi
ệu của probe đánh dấu VIC –FAM cùng

ly trích RNA.
3.2 Thiết kế primer và probe

Trình tự của dòng đầu tiên Lelystad M 96262 và ATCC VR 2332 được aligned
dùng phần mềm Gene Works 2.5.1 (Oxford Molecular Group , Oxford, UK).
Với sự ổn định của khung ORF 7 của bộ gen của cả 2 type virus thì mồi ngược
USalignEU-R (5’ AAATGIGGCTTCTCIGGITTTT 3’) và mồi xuôi USalignEU-
F (5’ TCAICTGTGCCAGITGCTGG 3’) đã được chọn và khi TaqMan
®
RT-PCR
khuếch đại thì sẽ tạo ra các đoạn DNA có kích thước 105pb (type US) với 96 pb
(type EU).
Các primer và probe đặc hiệu được thiết kế bởi phần mềm Primer Express
TM

(Applied Biosystems, Foster City, USA) và được tổng hợp bởi PE Biosystem,

7
Weiterstadt, Germany (probes) và Microsynth, Balgach, Switzerland (primers).
Hai probe TaqMan
®
được thiết kế đặc trưng cho 2 type PRRSV. Probe đặc trưng
cho type EU-PRRSV :VIC–EU (5’ CCCAGCGCCAGCAACCTAGGG 3’, định
hướng antisense ) được đánh dấu với VIC ở điểm cuối ở đầu 5’ và TAMRA ở điểm
kết thúc của đầu 3’. Nhưng trái lại Probe đặc trưng cho type US-PRRSV :
FAM–US–rev (5’TCCCGGTCCCTTGCCTCTGGA 3’, định hướng sense ), đầu 5’
được đánh dấu với FAM và ở đầu 3’ là TAMRA.
3.3 Ly trích RNA và các mẫu định lượng

Mẫu RNA cho cả 2 type sẽ được chuẩn bị, sau khi ly trích RNA bằng cách sử

C : 20s ; 72
0
C : 20s ) với Taq DNA polymerase
( Promega, Madison, USA ). Các phản ứng được phân tích bằng điện di với gel
agarose, và kết quả là có xuất hiện 2 băng đặc trưng ở 637 bp (EU) và ở 660 bp
(US).
Hỗn hợp (25µl) của TaqMan
®
RT-PCR gồm có : 5.5 mM MgCl
2
and 1 x
Buffer A [bao gồm 60 nM thuốc nhuộm ROX (6-carboxy-N,N,N_,N_-
tetramethylrhodamine), 50mM KCl, 0.01 mM acid ethylenediamine tetraacetic
(EDTA) và 10mM Tris-HCl, pH 8,3) từ bộ Kit TaqMan
®
Gold RT-PCR (Applied
Biosystems, Foster City, USA), 300µM dATP, dGTP, dCTP và dTTP (Promega),
400 nM cho mỗi primer, 100 nM cho mỗi probe, 0.625 units Ampli Taq Gold
R

DNA Polymerase (Applied Biosystems), 12.5 units MultiScribeTM Reverse
Transcriptase (Applied Biosystems), và 10 units Recombinant Rnasin
®
(Promega).
Cuối cùng là 2µl RNA đích được thêm vào hỗn hợp.
Nồng độ của probe và primer được xem xét để phản ứng đạt được ngưỡng : số
chu kỳ (C
T
) thấp nhất và tín hiệu huỳnh quang tăng lên sau các chu kỳ ( ∆R
n

3.5 Tính chuyên biệt và tính nhạy của TaqMan
®
RT-PCR
Tính chuyên biệt của sản phẩm TaqMan được kiểm tra bằng việc giải trình tự
nucleotide. Tính chuyên biệt của probe được kiểm tra bằng việc phân tích mẫu
RNA của cả 2 type virus EU và US, và của mẫu mô và huyết thanh chứa số lượng
RNA của PRRSV EU và US khác nhau. Ngoài ra thì các probe được kiểm tra riêng
biệt bằng việc thêm 1 số lượng lớn RNA của PRRSV khác loài.
Phân lập virus trên tế bào nuôi cấy, RT-PCR thông thường và TaqMan RT-PCR
được so sánh về tính nhạy bằng việc kiểm tra dịch nổ
i tế bào nuôi cấy được pha
loãng liên tục 10 lần.Các mẫu được pha loãng trước hoặc sau khi ly trích RNA.
Tính nhạy cho các mẫu bệnh phẩm được nghiên cứu bằng việc phân tích dịch nổi ở
độ pha loãng 10 lần được lọc từ mẫu mô được đồng nhất hay huyết thanh từ những
con thú thí nghiệm bị bệnh cũng như những mẫu tại khu chăn nuôi.
Những mẫu bệnh phẩm này được pha loãng liên tục trước khi ly trích RNA.
3.6 Các yếu tố cản trở
Các primer và probe trong thí nghiệm mutiplex RT-PCR có thể tác động qua lại
làm giảm tính nhạy của thí nghiệm. Probe được kiểm tra riêng biệt, và tính nhạy
được so sánh với thử nghiệm mutiplex TaqMan.
Sự tồn tại của 2 type EU và US PRRSV cùng trong một con vật là một điều cản
trở cho việc phát hiện ra 2 type virus này.Điều này được tìm thấy khi thực hiện
nghiên cứu là phát hiện cùng lúc 2 type virus bằng việc trộn các RNA của 2 type
EU và US PRRSV vào cùng 1 ống thí nghiệm. 10II.4. Kết quả

) ít hơn.

Chu kỳ ngưỡng ( C
T
) được sử dụng như 1 đơn vị biểu thị cho số chu kỳ PCR mà
tại đó tín hiệu huỳnh quang đầu tiên phát ra.
Hiệu quả khuếch đại của sản phẩm phụ thuộc vào độ dốc của đường chuẩn được
tạo ra dựa vào việc pha loãng mẫu liên tục 10 lần.Đường chuẩn này được thiết lập
từ giá trị logarit TCID
50
/tube tương ứng với mỗi nồng độ của từng mẫu với giá trị
chu kỳ ngưỡng thu được.

12
Đường chuẩn trên đồ thị cho thấy độ dốc trên đường đồ thị huỳnh quang của
type EU là 3,51 và của type US là 3,58. Kết quả này gần với độ dốc lý tưởng theo
lý thuyết là 3,32, giá trị mà hiệu quả khuếch đại tăng gấp đôi sau mỗi chu kỳ.
Giá trị C
T
cho việc phát hiện với liều TCID
50
là 27,87 (US) và 32,36(EU)
Dịch nổi của tế bào nuôi cấy chứa VR 2332 hoặc M 96262, nơi RNA được ly
trích sau khi mẫu đã pha loãng 10 lần, thì hiệu quả bằng nhau khi phát hiên bằng

Tất cả các mẫu đối chứng âm thì luôn có kết quả âm tính trong thí nghiệm
TaqMan.

15

16
III. KẾT LUẬN

Mục đích của nghiên cứu này là để phát triển tính : nhanh, chắc chắn, nhạy và
đặc hiệu kiểm tra để phát hiện và phân biệt type EU và US của PRRSV trong mẫu
mô và huyết thanh cũng như trong dịch nổi của tế bào nuôi cấy.tính chắc chắn
trong việc phát hiện PRRSV là rất quan trọng bởi vì sự thay đổi và triệu chứng lâm
sàn không đặc trưng bệnh PRRS ở heo. Hơn nữa, PRRS thường được quan tâm
trong chuẩn
đoán phân biệt các bệnh lây nhiễm do virus.Một chiến lược đã được
chọn là sử dụng một cặp primer đơn có khả năng gắn kết với cả 2 type RNA của
PRRSV EU và US. Ở những vùng mà chọn để thiết kế các probe và primer thì có
trình tự của dòng EU và US mang tính ổn định cao.Những kết quả của các thí
nghiệm đã xác nhận tính đặc trưng là tuyệt đối cho dù lượng PRRSV khác loài
được thêm vào nhiều.
Phươ
ng pháp TaqMan có tiến bộ hơn so với ORF 7 RT-PCR thông thường :
- thời gian cần cho quá trình phát hiện ít hơn
- giảm rủi ro cho việc bị nhiễm bẩn
- không cần có quá trình giữa RT và PCR
- không đòi hỏi các bước sau PCR
- biết trước lượng mẫu cho vào