TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM CHẨN ĐOÁN BỆNH GIA SÚC
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC GIA CẦM BẰNG SHPT - 1 -
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

GVHD: PGS.TS. NGUYỄN NGỌC HẢI
Sinh viên thực hiện: Nguyễn Thị Hoa Thùy (MSSV: 06126151)
Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 10 năm 2009
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM CHẨN ĐOÁN BỆNH GIA SÚC
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC GIA CẦM BẰNG SHPT - 2 -
ĐẶT VẤN ĐỀ



1. Khái niệm:
Viêm não Nhật Bản (VNNB) là một bệnh truyền nhiễm trùng cấp
tính gây ra bởi một loại siêu vi trùng thuộc nhóm Arbovirus có ái tính với tế bào
thần kinh, có tên là Japanese Encephalitis Virus (JE Virus). Virus lây truyền qua
người nhờ trung gian là muỗi Culex tritaeniorhynchus và Culex vishnui. Bệnh có
thể xảy ra rải rác hay thành dịch. Bệnh không truyền từ người này sang người
khác.Bệnh có thể dẫn đến tình trạng tổn thương não vĩnh viễn, tỷ lệ tử vong rất
cao. Bệnh viêm não đã mô tả từ năm 1871 nh
ững mãi đến nam 1935 mới phát
hiện và phân lập được từ bệnh nhân ở Tokyo nên được gọi là bệnh viêm não Nhật
Bản.
Tùy theo mức độ và vị trí tổn thương tại hệ thần kinh trung ương
(HTKTW), lâm sàng sẽ có biểu hiện triệu chứng của nơi bị xâm phạm như : viêm
não, viêm màng não, viêm sừng trước tủy sống hoặc bệnh cảnh phối hợp: viêm
não màng não, viêm não màng não tủy sống.
2. Dịch tễ học
Khái quát lịch sử:

VNNB là bệnh dẫn đầu trong số các bệnh viêm não do virus ở Châu
Á. Nó được lưu hành rộng rãi ở các nước trong vùng Đông Á, Nam Á, và Đông
Nam Á trong đó có Việt Nam. Bệnh cũng đã xuất hiện ở phía Tây Thái Bình
Dương. Hằng năm vào khoảng 50000 trường hợp mới mắc trên thế giới với con
số tử vong ước chừng 10000(1988).
Bệnh đã được biết tới vào 1871 nhưng mãi đến năm 1924 mới biết
rõ về lâm sàng qua trận dịch lớn với 6000 trường hợp, và tỷ lệ tử vong vào
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM CHẨN ĐOÁN BỆNH GIA SÚC
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC GIA CẦM BẰNG SHPT
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC GIA CẦM BẰNG SHPT - 5 -
trong thiên nhiên. Các loài chim di cư có thể lây truyền mầm bệnh virus từ vùng
này qua vùng khác.

Qua điều tra giám sát về huyết thanh, hầu hết gia súc như trâu bò,
dê, cừu, chó, đều có thể nhiễm virus VNNB, nhưng chỉ có heo, ngựa có biểu hiện
bệnh như: viêm não ở ngựa, virus có thể qua nhau, nhiễm bào thai ở heo nái gây
chết thai, hoặc xảy thai.
Tuy nhiên chỉ có heo là nguồn nhiễm virus huyết quan trọng truyền
cho muỗi vì những lý do sau:
- Heo đẻ được nhiều lứa, tạo ra số lượng một quần thể heo cảm nhiễm virus
mới
- Luân chuyển thường xuyên mỗi 6-8 tháng
- Chỉ số heo nhiễm virus trong tự nhiên cao hơn tất cả gia súc khác
- Nhiễm virus máu ở heo thường cao nên dễ truyền virus qua muỗi
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM CHẨN ĐOÁN BỆNH GIA SÚC
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC GIA CẦM BẰNG SHPT - 6 -
b. Trung gian truyền bệnh
Đối với virus VNNB thì
muỗi là con vật trung gian truyền bệnh
quan trọng. Hiện nay người ta đã phát
hiện có 30 loài muỗi khác nhau thuộc 5
họ Culex, Anopheles, Aedes, Mansoni
và Amergeres là trung gian truyền bệnh

nhiên này có thể mắc bệnh khi bị muỗi đốt. Người được coi là vật chủ cuối cùng
đối với virus VNNB và có vai trò rất quan trọng trong dịch tễ học bệnh này.
Virus VNNB trong máu người tồn tại trong thời gian ngắn với nồng
độ thấp, nên không thể lây bệnh từ người này sang người khác qua muỗi đốt.
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM CHẨN ĐOÁN BỆNH GIA SÚC
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC GIA CẦM BẰNG SHPT - 8 -
d. Phân bố bệnh
Phân bố theo mùa:
¾ Virus VNNB lan truyền theo mùa trên hầu hết các vùng của Châu Á.
¾ Khí hậu với những yếu tố nhiệt độ và mưa có ảnh hưởng đến tình
hình bệnh. Ở vùng ôn hòa, virus Japansese encephalitis lan truyền vào mùa hè và
đầu mùa thu(vào khoảng từ tháng 5-9). Ở vùng cận nhiệt và nhiệt đới, sự lan
truyền virus theo mùa có liên quan đến sự thừa thải trung gian truyền bệnh là
muỗi và vật chủ lan truyền có xương sống.Vào mùa mưa ruộng lúa đầy n
ước tạo
điều kiện tốt cho muỗi sinh sản và phát triển mạnh trong thiên nhiên, trùng hợp
với thời điểm bệnh xảy ra nhiều.
¾ Vào mùa hè thời tiết nóng, ở nhiệt độ từ 27
0
C - 30
0
C virus thường
phát triển tốt trong cơ thể muỗi. Nếu dưới 20
0
C thì sự phát triển của virus dừng
lại.
¾ Mô hình dịch tễ học lại khác nhau giữa các vùng miền, cụ thể là ở 2

Khi bị muỗi đốt, virus từ nước bọt của muỗi qua da. Giai đoạn đầu
virus nhân lên tại chỗ và ở hạch lympho vùng, đây là nguồn dẫn đến virus huyết
đầu tiên. Từ máu virus đi đến các tổ chức và nội tạng khác như tổ chức lympho,
mô liên kết, cơ vân, cơ tim, tuyến nội và ngoại tiết. Virus tiếp tục nhân lên tại tổ
chức ngoài thần kinh đưa đến virus huyết lần n
ữa kéo dài 3-5 ngày, thường với
nồng độ thấp ở người. Nếu kháng thể trung hòa tăng kịp thì xảy ra hiện tượng
virus huyết ngưng. Chưa biết rõ cơ chế xâm nhập hệ thần kinh trung ương của
virus. Tuy nhiên, não bộ bị nhiễm lan tỏa chứng tỏ virus xâm nhập qua đường
mạch máu. Mặt khác khi hàng rào mạch máu não bị tổn thương trong giai đoạn
tiềm ẩn dễ tạo cơ hội cho virus xâm nh
ập thần kinh, như mắc bệnh VNNB trong
trường hợp có sẵn bệnh cysticercosis não, hoặc sau chấn thương sọ não.
Những biến đổi bệnh lý trong quá trình phát triển của virus trong hệ
thần kinh trung ương như sau :
¾ Virus nhân lên trong tế bào thần kinh với nồng độ trong não gấp
triệu lần so với ở vị trí khác ngoài thần kinh. Trong giai đoạn cấp tính, nói chung
màng não bình thường hoặc thoáng mờ, não bị xung huyết , phù nề, xuất hiện
điểm xuất huyết hoặc chảy máu tại chất xám, hoại tử ở đồi thị, nhân xám nề
n sọ,
não giữa, tiểu não, nhân xám thân não, chất xám của võ não, không thấy tổn
thương của chất trắng. Sừng trước tủy sống bị tổn thương giống như trong sốt bại
liệt.
¾ Về mặt vi thể, hiện tượng tế bào thần kinh đệm thực bào thần kinh
chết tạo ra những nốt điển hình do quá sản tế bào thần kinh đệm, khi bệnh kéo dài
tế bào viêm bao quanh huyết qu
ản tạo thành những hình ảnh vỏ ngoại quản, cuối
cùng xuất hiện những ổ hoại tử khan hiếm tế bào do những tế bào thần kinh bị
thoái hóa, tiêu hủy tạo ra, đôi khi có chất vôi ứ đọng bên trong.


gũi với West Nile virus và ST.Louis encephalitis virus.
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM CHẨN ĐOÁN BỆNH GIA SÚC
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC GIA CẦM BẰNG SHPT - 12 -
Virus viêm não Nhật Bản hình cầu, nhân chứa RNA mạch đơn, kích
thước 45-50nm, bao quanh bởi cấu trúc hình khối gọi là capsid, phần vỏ giàu chất
lipid.
Virus viêm não Nhật
Bản dễ mất hoạt lực ở nhiệt độ
56
o
C trong nửa giờ hoặc trong
formalin 0,2%, ether,
natrideoxycholate và cũng bị bất
hoạt nhanh bởi tia tử ngoại.
Virus này có thể được
nuôi cấy trên tế bào thận heo, thận
chuột Hamster, trên não chuột
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM CHẨN ĐOÁN BỆNH GIA SÚC
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC GIA CẦM BẰNG SHPT - 13 -
bạch sơ sinh, chuột bạch trưởng thành hay trên tế bào của tổ chức côn trùng như
muỗi.
Virus viêm não Nhật Bản có 3 loại protein kháng nguyên: protein
màng M, protein lõi C, protein vỏ E trong đó kháng nguyên vỏ E đóng vai trò
quan trọng nhất trong bước đầu tiên của phản ứng với tế bào kí chủ và tạo ra kích

thời gian so với kỹ thuật nuôi cấy tế bào thông thường. Kỹ thuật SVC tốn khoảng
36 giờ trong khi kỹ thuật nuôi cấy thông thường cần
đến 3-7 ngày cho chuẩn đoán
một mẫu quan trọng.
Trong 50 mẫu lấy từ 50 bệnh nhân, SVC có thể chuẩn đoán tất cả 24
trường hợp dương tính chuẩn đoán bằng phương pháp miễn dịch huỳnh quang
trực tiếp. Ngoài ra, SVC còn chuẩn đoán được thêm 5 trường hợp mà phương
phâp miễn dịch huỳnh quang trực tiếp không chuẩn đoán được.
Nguyên liệu và phương pháp
¾ Mẫu:
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM CHẨN ĐOÁN BỆNH GIA SÚC
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC GIA CẦM BẰNG SHPT - 15 -
Dịch não-tủy được lấy từ việc tiêm chích vào thắt lưng 50 bệnh nhân, bao
gồm 46 bệnh nhân khoa nhi từ 18 tháng tuổi đến 12 tuổi và 4 người trưởng thành
từ 13 đến 40 tuổi. Tất cả các bệnh nhân này đến từ Pondicherry và quận lân cận
của Tamil Nadu State.
¾ Dòng tế bào:
Tế bào thận lợn (PS-Porcine Kidney) lấy từ trung tâm quốc tế về khoa học
tế bào được sử dụng trong nghiên cứu. Tế bào phát triển trong bình nuôi cấy mô
plastic và bình Roux ở 37
o
C.
¾ Dung môi:
Eagle’s modified MEM, NEAA, phenol red không có l-glutamine,
NaHCO
3
và kháng sinh được sử dụng. L-glutamine (3%), NaHCO

điểm khác nhau 12h, 24h, 36h và 48h tại nhiệt độ phòng. Tế bào một lớp được cố
định lại với acetone lạnh và nhuộm màu bằng kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang
trự
c tiếp. Người ta thấy rằng kết quả sớm nhất là sau 36h ủ.
¾ Phương thức của thử nghiệm Shell vial
1ml tế bào thận (4 x 10
5

tế bào/ml) trong dung môi phát
triển được thêm vào mỗi shell
vial và ủ ở 37
o
C cho tới khi tế
bào một lớp hợp dòng được tạo
thành. Dung môi phát triển của
virus được lấy ra. 300 µl mẫu
xét nghiệm được tiêm nhiễm
vào shell vial và nhuộm màu
bằng kỹ thuật miễm dịch huỳnh
quang trực tiếp. Shell vial được
đem đi ly tâm 1000 rpm trong 45 phút tại nhiệt độ phòng sau đó thêm 1 ml dung
môi bảo quản vào shell vial rồi đem ủ ở 37
o
C trong vòng 36h. Dung môi bảo quản
được lấy ra cẩn thận khỏi shell vial và loại bỏ. Tế bào một lớp được rửa với PBS
(pH 7.2) 3 – 4 lần sấy khô và cố định bằng acetone trong 30 phút. Lamen được
nhuộm bằng phương pháp miễn dịch huỳnh quang trục tiếp. Vết trải trên bàn kính
sẽ được quan sát dưới kính hiển vi quang học, nếu có sẽ cho huỳnh quang tế bào
chất màu xanh (apple green fluorescence).



TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM CHẨN ĐOÁN BỆNH GIA SÚC
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC GIA CẦM BẰNG SHPT - 18 -

TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu tiếng Anh: (tài liệu cho phần Shell vial culture)
1.Umenai T, Kruzysko R, Bektimirov TA, Assaad FA: Japanese
encephalitis-Current world status.
2. Cinque P, Bossolasco S, Lundkvist A: Molecular analysis of
cerebrospinal fluid in viral diseases of the central nervous system.
3.Forbes BA, Sahm DF, Weissfeld AS: Indirect Immunofluorescence.
4. Engler HD, Preuss J: Laboratory diagnosis of respiratory virus
infections in 24 hours by utilising shell vial cultures.
5.Kedarnath N, Prasad SR, Dandavathe CN, Koshy AA, George S, Ghosh
SN: Isolation of Japanese encephalitis and West Nile viruses from peripheral
blood of encephalitis patients.
Tài liệu tiếng Việt: (tài liệu cho phần giới thiệu virus và bệnh VNNB)
Trần Văn Hưng: Giáo trình Vi sinh vật Y học. NXB Y học.
Web: (tài liệu, hình ảnh cho giới thiệu virus và bệnh VNNB)




/>5&ct=result&prev=/search%3Fq%3DArbovirus%26hl%3Dvi%26sa%3DG
e/

/>