ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
LỚP DH06SH
Bài Tiểu Luận
: CHẨN ĐOÁN BỆNH NEWCASTLE BẰNG KỸ
THUẬT NUÔI CẤY TẾ BÀO
GVHD: PGS.TS. NGUYỄN NGỌC HẢI
SVTH: TRẦN THỊ THANH PHẤN
MSSV: 06126110
Thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 10/2009
Chẩn đoán bệnh Newcastle bắng kỹ thuật nuôi cấy tế bào
2
MỤC LỤC

I. ĐẶT VẤN ĐỀ 4

1.2. Mẫu huyết thanh 19
2. Xử lý mẫu 21
3. Phương pháp chuẩn bị môi trường xơ phôi gà ( CEF) một lớp 21
3.1 Nguyên liệu 21
3.2 Trypsin có tế bào 22
3.3 Cấy tế bào vào chai 23
4. Kiểm tra mẫu bệnh phẩm 23
IV. KẾT LUẬN 25
V. TÀI LIỆU THAM KHẢO 26

I. ĐẶT VẤN ĐỀ

Bệnh Newcastle hiện nay đang là mối quan tâm hàng đầu trong chăn nuôi gà
bởi bệnh lây lan rất nhanh, tỷ lệ chết cao làm ảnh hưởng trực tiếp đến kinh tế hộ
gia đình. Hơn thế bệnh còn là mối nguy cơ bùng phát dịch trên diện rộng gây ô
nhiễm môi trường và sức khoẻ cộng đồng. Ảnh hưởng của bệnh Newcastle đối với
nền kinh tế gia cầm toàn cầu rất lớn, là một trong những b
ệnh gây tác hại lớn đến
sự phát triển của ngành chăn nuôi gia cầm thế giới. Ngoài ra thiệt hại liên tục do
bệnh Newcastle gây ra sẽ ảnh hưởng trực tiếp đến số lượng cũng như chất lượng
thực phẩm cho người dân. Trong thực tế đã có nhiều người thường có tư tưởng
chủ quan khi thấy trong thời gian dài trong gia đình nhà mình không bị bệnh
Newcastle đã không thực hiện đúng quy trình nh
ỏ và tiêm phòng vaccine
Newcastle từ đó đã dẫn đến nguy cơ mắc bệnh cao.Từ đó mỗi khi có dịch bệnh xảy
ra công tác kiểm soát dịch bệnh trở nên khó khăn hơn. Vì vậy việc chẩn đoán mẫu
bệnh phẩm để xác định nguyên nhân gây chết của gia cầm có phải là do virus
Newcastle gây ra hay không có ý nghĩa thực tế rất lớn nhằm góp phần làm giảm tối
đa các rủi ro có thể xảy ra cũng như
ngăn chặn không cho dịch bệnh lan tràn sang

là thể bệnh Newcastle độc lực cao hướng nội tạng ( VVND: Viscerotropic
velogenic Newcastle disease).
(2) Thể Beach ( Beach, 1942) [69] cũng là thể bệnh Newcastle cấp tính thường
gây tử vong ở gà mọi lứa tuổi. Các triệu chứng hô hấp và thần kinh thường
xuất hiện nổi trội vì vậy được gọi là bệnh Newcastle độc lực cao hướng thần
kinh (NVND: Neurotropic velogenic Newcastle disease).

(3)
Thể Beaudette ( Beaudette and Black, 1946) [74] là một thể Newcastle nhẹ
hơn, thường chỉ gây tử vong ở gà con. Virus gây ra týp bệnh này thuộc
nhóm virus có độc lực trung bình ( Mesogenic NDV) và một số chủng virus
thuộc nhóm này đã được sử dụng làm vaccine virus sống dùng để tiêm
chủng lặp lại.

Chẩn đoán bệnh Newcastle bắng kỹ thuật nuôi cấy tế bào
6
(4) Thể Hitchner ( Hitchner và Johnson,1948) [127] là một thể bệnh đường hô
hấp nhẹ gây ra bởi nhóm virus có độc lực thấp ( Lentogenic NDV), thường
sử dụng để sản xuất các loại vaccine virus sống.

(5)
Thể ruột, không triệu chứng ( asymptomatic-enteric form) ( Lancaster,
1981) [156] là thể gây nhiễm ở đường ruột bởi các virus gần như không có
độc lực, không gây bệnh rõ ràng ( Apathogenic or avirulent NDV). 1.2 Virus gây bệnh

1.2.1 Hệ thống phân loại
APMV-1 hay virus Newcastle được xếp vào chi Rubulavirus thuộc họ phụ

virus Newcastle cho thấy có độ dài bao gồm 15.186 Nucleotide ( Philips và ctv,
1998) [188].
Chẩn đoán bệnh Newcastle bắng kỹ thuật nuôi cấy tế bào
8

Hạt virus có khoảng 20-25% Lipid có nguồn gốc từ tế bào vật chủ và khoảng
6% carbonhydrade. Tổng trọng lượng phân tử của một hạt virus trung bình là
khoảng 5.10
8
Da, tỉ trọng trong đường Sucrose là 1,18-1,2 g/l ( Alexander, 2003)
[53].
Điện di các tiểu thể virus Newcastle tinh sạch đã bị phá vỡ trên gel
Polyacryamid thường cho thấy ít nhất 7 chuỗi Polypeptide. Tuy nhiên một trong 7
chuỗi này là Protein actin của vật chủ tích hợp vào hạt virus.
1.2.3. Các đặc tính sinh học
a. Hoạt tính gây ngưng kết hồng cầu
Khả năng gây nhưng kết hồng cầu ( Haemagglutination: HA) của virus
Newcastle và các APMV khác là do Protein HN bám dính vào các thụ thể nằm trên
bề mặt hồng cầu. Đặ
c tính này và sự ức chế ngưng kết đặc hiệu bởi huyết thanh
miễn dịch đã được chứng minh là công cụ hiệu quả trong chẩn đoán bệnh
Newcastle.
Chẩn đoán bệnh Newcastle bắng kỹ thuật nuôi cấy tế bào
9

Hồng cầu gà thường được dùng trong phản ứng HA nhưng virus Newcastle có
thể gây ngưng kết hồng cầu của các loài lưỡng thê, bò sát và những loài chim khác
( Lancaster, 1966) [154]. Avian Paramyxovirus còn có thể làm ngưng kết các tế
bào không phải là hồng cầu nếu chúng có thụ thể phù hợp.
a. Hoạt tính Neuraminidase

có độc lực khác nhau: virus Newcastle độc lực cao, virus Newcastle độc lực trung
bình và virus Newcastle độc lực thấ
p dựa vào ba mốc thời gian gây chết phôi gà
sau khi virus được tiêm vào túi niệu là < 60 giờ, từ 60-90 giờ và trên 90 giờ. Những
nghiên cứu tiếp theo bởi khả năng gây bệnh của virus Newcastle dựa vào giá trị
MDT ( Mean Death Time), ICPI ( Intracerebra Pathogenicity Index), IVPI (
Intravenous Pathogenicity Index) đã củng cố và sáng tạo thêm sự phân nhóm này (
bảng 1.2).
Bảng 1.2: Phân loại nhóm độc lực của virus Newcastle được đánh giá qua các chỉ
số độc lực cơ bản
Nhóm độc lực MDT (giờ) ICPI IVPI
Viscerotropic
VNDV*
<60 1.5-2.0 2.0-3.0
Neurotropic
VNDV*
<60 1.5-2.0 2.0-3.0
Mesogenic NDV 60-90 1.0-1.5 0.0-0.5
Chẩn đoán bệnh Newcastle bắng kỹ thuật nuôi cấy tế bào
11
Lentogenic NDV >90 0.2-0.5 0.0
Asymptomaic
NDV
>90 0.0-0.2 0.0
Nguồn: Alexander, 1989 [89]
VNDV*: Velogenic NDV
d. Đặc tính nuôi cấy
Tất cả APMV đều có thể nhân lên trong phôi trứng gà. Các virus Newcastle có
khả năng và thời gian gây chết phôi gà rất khác nhau. Khi có virus Newcastle vào
xoang niệu mô của phôi gà ấp từ 9-11 ngày, tùy theo độc lực của từng chủng mà có

0
C
nhưng không còn khả năng gây nhiễm.
Ở pH < 2 hoặc pH > 10, virus mất khả năng gây nhiễm, virus cũng dễ bị diệt
bởi các tia tử ngoại ( Nguyễn Lương, 1994) [21]
1.3 Đặc điểm dịch tễ học của bệnh Newcastle
1.3.1 Phân bố và diễn biến của bệnh
Việc sử dụng rộng rãi phòng bệnh Newcastle ở nhiều nước trên thế giới là một
bằng chứng về
sự phổ biến của bệnh này trên thế giới.
Hiện tại, vẫn có thể nói rằng bệnh Newcastle hiện diện ở khắp thế giới nhưng
xảy ra thường xuyên chủ yếu là ở châu Phi, châu Á, Trung Mỹ, và một số vùng của
Nam Mỹ.
Do vậy, bệnh này vẫn được quan tâm giám sát và việc nghiên cứu cải tiến các
kỹ thuật chuẩn đoán và biện pháp phòng bệnh luôn luôn được khuyến khích ( Falcon,
2004) [104].
1.3.2
Vật chủ
Bên cạnh gà, có lẽ hầu hết chim nuôi và chim hoang dã đều có thể bị nhiễm với
các dòng virus Newcastle. Gà là vật chủ quan trọng nhất đối với virus Newcastle đồng
thời có thể có vai trò của các loài chim khác như vịt, ngỗng, gà lôi, chim cút, bồ câu,
gà tây.
Virus newcastle cũng có thể gây nhiễm các loài động vật hữu nhũ. Con người
cũng nhiễm bệnh, kể cả với các loài virus có độc lực cao lẫn độc lực thấp và sự nhiễm
bệnh cũng có thể gây nên chứng viêm kết mạc nặng ( Chang, 1981) [88]
1.3.3 Đường xâm nhập và truyền lây của virus
Virus Newcastle xâm nhập vào cơ thể gà qua đường hô hấp, kết mạc mắt và
đường tiêu hóa. Có giả định cho rằng gà mẫn cảm hơn đối với virus Newcastle khi
Chẩn đoán bệnh Newcastle bắng kỹ thuật nuôi cấy tế bào
13

lên ở các mô ngoài hệ thống thần kinh ngừng lại từ giờ thứ 60 sau khi nhiễm và gà
bắt đầu chết ( Asdell và Hanson, 1960) [65]. Đa số virus xâm nhập vào hệ thống
Chẩn đoán bệnh Newcastle bắng kỹ thuật nuôi cấy tế bào
14
thần kinh trung ương qua đường máu trước khi một lượng kháng thể có ý nghĩa
xuất hiện ở trong hệ thống tuần hoàn. Tuy nhiên một số virus hướng thần kinh đã
nằm trong hệ thống thần kinh cùng thời điểm ở đường tiêu hóa và hô hấp là do có
thể xâm nhập vào trung ương thần kinh thông qua dây thần kinh khướu giác.
1.4.2 Triệu chứng và bệnh tích
Thời gian nung bệnh rất khác nhau, trung bình là 5-6 ngày.Hiên nay có 4 dạng
bệnh khác nhau:
a. Dạng gây ra do ch
ủng độc lực mạnh-nhóm velegenic.
* Triệu chứng: bệnh xuất hiện đột ngột và lây lan nhanh, chết cấp tính trong 3-4
ngày và biểu hiện rõ triệu chứng,bệnh tích. Chỉ thấy một số triệu chứng.
- Gà lờ đờ, hô hấp tăng, thở mạnh, ho.

- Đi tiêu chảy đôi khi có máu.
- Một số chảy dịch nhờ ở mũi, mặt.
- Mào, mồng, tích tím, có thể phù quanh đầu.
- Sau 4-5 ngày nếu không chết thì biểu hiện triệu chứng thần kinh ( Mổ lung
tung , đi quay tròn ).
- Gà đẻ giảm số lượng trứng, vỏ mềm.
- Tỉ lệ chết 50%- 90% tùy từng đàn.
* Bệnh tích:
- Đường tiêu hóa xuất huyết và loét từng điểm.
Chẩn đoán bệnh Newcastle bắng kỹ thuật nuôi cấy tế bào
15
- Thực quản, dạ dày tuyến, dạ dày cơ ( mề ), ruột tịt, ruột già, lỗ huyệt đều thấy
xuất huyết.

Nuôi cấy tế bào là kỷ thuật duy trì và phát triển các tế bào ở ngoài cơ thể sống,
các tế bào trong điều kiện phòng thí nghiệm vẫn tự phân chia, thực hiện đầy đủ các
chức năng biến dưỡng và chức năng chuyên bi
ệt của tế bào.
2.2 Các loại tế bào nuôi cấy: Tế bào biểu mô, Nguyên sợi bào, Tế bào cơ,
Tế bào thần kinh, Lympho bào.
2.3 Một số máy móc thiết bị cần thiết
Tủ cấy vô trùng chuyên nuôi cấy tế bào, tủ ấm thường và tủ ấm CO
2
tủ lạnh thường và
lạnh sâu, bình Nito lỏng, hệ thống nước cất hai lần, hệ thống lọc vô trùng và hệ thống
trypsin hóa, dụng cụ thủy tinh và nhựa, kính hiển vi soi ngược và một số máy móc
khác.
2.4 Thành phần môi trường.
Chẩn đoán bệnh Newcastle bắng kỹ thuật nuôi cấy tế bào
17
- Carbohydrate: Glucose cung cấp nguồn năng lượng.
- Aminoacid nồng độ 0,1- 0,2 mol tiền chất tổng hợp protein.
- Muối đẳng trương: Giữ cân bằng trong và ngoài tế bào.
- Bicarbonate: Hệ thống đệm trong sẽ kết hợp 5-10% CO
2
( tủ ủ )
- Vitamin, hormon: Nồng độ sử dụng khác nhau tùy theo nhu cầu các loại tế bào.
- Phenol red: Chất chỉ thị PH môi trường.
* Điểu kiện nuôi cấy.
- Nhiệt độ 37
o
C.
- PH 7,4.
* Chất bổ sung vào môi trường.

C: hàng tuần, hàng tháng
- Nhiệt độ: -196
0
C: lâu hơn
2.8. Nguyên nhân gây nhiễm trùng trong nuôi cấy tế bào
- Là do vi sinh vật từ rất nhiều nguồn khác nhau: không khí, tủ cấy, vật dụng, người
thao tác, và chất bổ sung vào môi trường.
- Cách nhận biết:
+ Giảm đột ngột pH của môi trường
+ Tạo lớp mây của môi trường
+ Môi trường đục, tạo cặn
- Giảm nguồn nhiễm:
+ Sát trùng nơi làm việc
+ Sử dụng vật dụng nuôi cấy vô trùng
+ Vệ sinh cá nhân
+ Chọ
n nguồn huyết thanh
2.9. Ứng dụng của kỹ thuật nuôi cấy tế bào
- Trong chẩn đoán bệnh
- Chẩn đoán và điều trị ung thư
- Sản xuất kháng thể đơn dòng
- Sản xuất vaccine
Chẩn đoán bệnh Newcastle bắng kỹ thuật nuôi cấy tế bào
19
- Chẩn đoán biến đổi gen và sản xuất các sản phẩm sinh học ( hormon, enzyme trị
liệu )
3. Chẩn đoán bệnh Newcastle bằng phương pháp nuôi cấy tế bào
- Việc chẩn đoán bệnh rất quan trọng vì những lý do sau đây:
+ Newcastle là bệnh có trong danh mục kiểm dịch biên giới và các nước có dịch
xảy ra phải thông báo với tổ chức dịch tễ thế giới ( OIE)

các trang bị
bẩn hoặc kỹ thuật gởi mẫu kém. Nguyên nhân của hiện tượng tan
huyết bao gồm:
+ Máu chảy chậm do tắt nghẽn, không trúng mạch.
+ Mẫu bị nóng, thường do để trong xe hoặc bị ánh nắng mặt trời chiếu trực tiếp
quá lâu.
+ Làm đông lạnh mẫu.
+ Sự nhiễm bẫn của mẫu do nước.
+ Sự nhiễm bẩn do phân và các vật liệu khác.
+ Dùng sức ép mạch máu chảy qua tim
+ Bị
nhiễm khuẩn khi lấy mẫu
+ Dùng các thùng không khử trùng để lấy mẫu và lưu giữ mẫu.
- Bảo quản mẫu huyết thanh trước khi đưa đến phòng thí nghiệm
+ Các mẫu máu và huyết thanh không được để trong bình, các thùng hoặc ống
và kim tiêm kèm theo chưa được khử trùng.
+ Để đông mẫu trước khi vận chuyển. Mẫu cần được để nơi ấm cho đến khi
đông lại ( máu có thể không đông trong thời tiết lạ
nh hoặc mẫu đã được làm lạnh
ngay sau khi lấy).
+ Khi máu đã đông mẫu cần được bảo quản lạnh để giảm sự nhiễm bẫn, giảm
hiện tượng tan huyết và vỡ hồng cầu.
Chẩn đoán bệnh Newcastle bắng kỹ thuật nuôi cấy tế bào
21
+ Nếu mẫu không chuyển ngay đến phòng thì nghiệm được và để lâu mới xét
nghiệm nên chắt riêng huyết thanh vào lọ nhựa 5ml và 1.8ml vô trùng có nút vặn
và chỉ chuyển huyết thanh đi.
+ Các mẫu máu dùng để chắc huyết thanh không được làm đông lạnh trước khi
chắc huyết thanh. Các mẫu huyết thanh có thể bảo quản đông lạnh với điều kiện là
không có tế bào máu bên trong

3.2 Trypsin có tế bào
- Sát trùng toàn bộ quả trứng bằng cồn iode. Dùng kéo cắt vỏ trứng nơi buồng hơi.
- Dùng kẹp lấy phôi gà ngâm vào dung dịch PBS có kháng sinh. Dùng kéo cắt bỏ
đầu, cánh, chân và phủ tạng chỉ lấy phần thân ngâm vào dung dịch PBS.
- Rửa thân phôi với dung dịch PBS 3 lần
- Cắt nhỏ phần thân phôi bằng kéo. Cho thân phôi đã được cắt nhỏ vào bình có khía
với thanh khuấ
y từ.
- Cho dung dịch PBS vào bình khía: rửa sạch các mảnh phôi đã được cắc nhỏ và để
yên cho lắng xuống, chắt bỏ phần nước ở trên. Lập lại 3 lần cho đến khi nước
trong.
- Cho trypsin 0.25% mới cũng đã làm ấm trước ở 37
0
C. 20ml/phôi, đặt bình khía
lên máy khuấy từ và khuấy trong 20 phút ở 37
0
C để phân cách tế bào ra.
- Thu hoạch huyễn dịch tế bào và thêm một lượng MEM lạnh và huyết thanh để
ngưng hoạt động của trypsin.
- Lọc qua 4 lớp vải màng và bình ly tâm và ly tâm lạnh với tốc độ 1500 vòng/ phút
trong 10 phút. Bỏ phần nước bên trên, phần tế bào bên dưới đáy được pha với một
thể tích môi trường MEM thích hợp, đếm tế bào với 0.1% Trypan blue và điều
chỉnh lượng tế bào để được số lượ
ng 10
6
tế bào/ ml hoặc 1 phôi gà pha với 100ml
môi trường phát triển( MEM 5% NCS).
Chẩn đoán bệnh Newcastle bắng kỹ thuật nuôi cấy tế bào
23
3.3 Cấy tế bào vào chai

DEAE mới thấy tế bào bị nhiễm.
Chẩn đoán bệnh Newcastle bắng kỹ thuật nuôi cấy tế bào
25
IV. KẾT LUẬN
Bệnh Newcastle là bênh truyền nhiễm cấp tính và lây lan rất nhanh, bệnh gây xáo
trộn và bệnh tích trên đường hô hấp, tiêu hóa và thần kinh. Hiện nay bệnh là mối
nguy hiểm cho ngành chăn nuôi gia cầm, bệnh thường gây nhiễm ghép với các
bệnh khác và tỉ lệ chết là 100%. Do đó bệnh Newcastle đã gây ra những tổn thất to
lớn cho nền kinh tế của các nước xảy ra dịch bệnh cũng như của cả thế giới. Ngoài
ra nó còn ảnh hưởng đế
n sức khỏe của con người, gây ô nhiễm môi trường và gây
ra những vấn đề về dinh dưỡng. Vì vậy, việc chẩn đoán bệnh có ý nghĩa rất lớn cả
về phương diện kinh tế lẫn xã hội. Phương pháp chẩn đoán bằng nuôi cấy tế bào
có độ chính xác cao và đây là phương pháp duy nhất thu nhận virus cho các
nghiên cứu tiếp theo. Tuy nhiên, phương pháp này có nhược điểm là rất chậm, đắt
tiền, đ
òi hỏi tay nghề kỷ thuật cao.
Hiện nay, không có thuốc điều trị đặc hiệu. Nên bổ sung thêm vitamin C và
vitamin nhóm B, chế phẩm K.C- Electrolyte, cải thiện khẩu phần thức ăn có thể
làm giảm bớt tỉ lệ tử vong trong giai đoạn cuối ổ dịch.