1

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
************* Bài tiểu luận
CHẨN ĐOÁN AUJESZKY’S DISEASE VIRUS
(ADV) BẰNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY TẾ BÀO

Môn học: Chẩn đoán bệnh gia súc, gia cầm
GVHD: TS. Nguyễn Ngọc Hải
SVTH: Vũ Thị Phương Thảo
Thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 10/2009

2

Mục lục
I. Đặt vấn đề 3
II. Tổng quan 3
II.1 Virus Aujeszky 3
II.1.a Tình hình 3

ra những rối loạn sinh sản ở heo (Pensaert and Kluge, 1989). Vì thế
cần có một phương pháp chẩn đoán nhanh sự vấy nhiễm của ADV
trong các bầy đàn để kiểm soát một cách hiệu quả sự lây nhiễm của
bênh bằng cách cách ly và loại bỏ các đàn gia súc nhi
ễm nhằm làm
giảm những thiệt hại về kinh tế mà ADV đã gây ra.
D Nhiều phương pháp đã được sử dụng để chẩn đoán sự vấy nhiễm
của ADV, bao gồm sự phân lập virus bằng phương pháp nuôi cấy
tế bào, phương pháp miễn dịch peroxidase, phương pháp miễn dịch
huỳnh quang, dot-blot, PCR. Mỗi phương pháp đều có những ưu,
nhược điểm riêng được so sánh về các m
ặt độ nhậy, độ đặc hiệu, dễ
phát hiện, chi phí và tốc độ.
D Trong những năm gần đây, sự phân lập virus bằng shell vial assay
(SVA) kết hợp với kĩ thuật miễn dịch huỳnh quang hay miễn dịch
peroxidase được sử dụng để phát hiện cytomegaloviruses, herpes
simplex virus, respiratory virus. Kĩ thuật SVA nhanh, nhậy và là
phương pháp đặc biệt đối với sự chẩn đoán các loại virus này. (b)
II. T
ổng quan
1) Virus Ạujeszky
a) Tình hình
D A. Aujeszky đã phát hiện ra bệnh này vào năm 1902 ở Hungary
trên bò và chó, đặt tên là bệnh “giả dại” vì ở phần lớn các loài động
vật mắc bệnh đều có triệu chứng ngứa ngáy và tự cắn xé mình. Lợn
mắc bệnh không có những triệu chứng này mặc dù chỉ riêng lợn là
kí chủ tự nhiên của virus. Các động vật mắc bệnh đều có độ mẫn
cả
m cao, tỉ lệ chết có thể lên tới 100%.
4

khác, ví dụ như cơ quan hô hấp, nhiễm vào nhiều loại động vật có
vú ngoại trừ người và các loài khỉ không đuôi.
D Kí chủ tự nhiên của ADV là heo, là một nguồn lây nhiễm tiềm tàng
(ngoại trừ heo con dưới 2 tuần tuổi bị chết do viêm não). (g)
c) Hình thái và cấu trúc ADV
Cấu trúc tổng quát của ADV được cho thấy ở hình 1.
• Phầ
n lõi bao gồm một sợi đôi DNA dài khoảng 150 kbp được
bao bọc bởi một capsid, vỏ (tegument) và vỏ bọc (envelope).
• Bộ gen của ADV bao
gồm 2 vùng đơn vị
(two unique regions),
một đơn vị dài
(unique long U
L
), và
một đơn vị ngắn
(unique shot U
S
),
được cặp sườn bởi 2
trình tự lặp lại, một
cái bên trong (an
internal one-IRS), một cái ở phía cuối (a terminal one-TRS). Cả
bộ gen đã được Klupp và ctv giải trình tự.
• Những gen khác nhau trong bộ gen của alphaherpesvirus được
chỉ định bởi 2 kí tự là US hay UL phụ thuộc vào vị trí của nó
trong đơn vị dài U
L
hay đơn vị ngắn U

D Phần lớn các chất sát trùng, tiêu độc đều có thể tiêu diệt được virus
như dung dịch NaOH 1%, trong 6 giờ, formal 3% trong 3 giờ, ở
nhiệt độ 60
o
C virus bị diệt sau 1 giờ.
D Virus trong xác chết thối rữa bị diệt sau 10 ngày, trong thịt ướp sau
20 ngày.
D Trong nước tiểu lợn bệnh, virus sống 3 tuần, trong chất độn chuồng
virus bị bất hoạt trong vòng 8-15 ngày.
D Các chất hóa học có hợp chất Clo là thuốc sát trùng có hiệu quả
nhất như nước vôi đặc, các chế phẩm Clorua vôi hòa tan trong
nước. (a)
e) Dịch tễ học
D Các loài vật mẫ
n cảm với ADV
• Heo là kí chủ chính của
ADV, là nguồn lây nhiễm
chính cho một phổ rộng kí
chủ thứ hai như bò, cừu,
chó, mèo, chuột và loài
gặm nhấm.
• Ngựa, chim, và người có
khả năng kháng ADV. (c)
D Đường lây nhiễm
• ADV vẫn tồn tại ở dạng
tiềm tàng trong suốt thời gian sống của heo bị nhiễm bệnh đã
khỏi. Sự lây lan bệnh có thể do trự
c tiếp tiếp xúc giữa heo khỏe
và heo bệnh hoặc mang trùng, có thể qua không khí, cũng có thể
lây lan gián tiếp qua chất độn chuồng, dụng cụ chăn nuôi, người

6 Qua chất tiết từ tinh dịch hay âm đạo khi giao hợp.
6 Qua sữa hay sữa non của thú mẹ truyền qua thú con, ngoài ra
virus có thể xâm nhập qua nhau thai, truyền dọc từ thế hệ
này sang thế hệ khác.
6 Qua những vật dụng dùng trong thú y đã bị nhiễm (ví dụ như
kim tiêm, ống tiêm).
9

6 Virus có thể tồn tại trong thịt heo đến 5 tuần. Những con chó
ăn thịt heo nhiễm cũng bị nhiễm và chết. Tỷ lệ nhiễm bằng
con đường ăn thịt heo bị nhiễm cao hơn là bằng đường hô
hấp.
6 Lan truyền nhờ
gió từ nông trại
này đến nông trại
khác có thể xảy
ra dưới điều kiện
thích hợp. (báo
cáo ở Anh có thể
tới 2 km).
6 Virus có thể tồn
tại nhiều tuần
trong một vũng
nước đọng, trên
cỏ, ổ rơm. Vì thế, môi trường truyền nhiễm từ bầy đàn này
sang bầy đàn khác cần phải được quản lý, đặc biệt là những
nơi rác thải không được thu gom và xử lý.

Vai trò của côn trùng đang được điều tra, loài gặm nhấm cũng đóng một vai
trò là một nguồn nhiễ

sẩy thai, thai yếu, thai chết lưu trong bụng. phần lớn những
thai chế
t, thai sẩy có bệnh tích điển hình là hiện tượng hoại
tử gan, lách, tuyến thượng thận, hạch lâm ba ruột.

Neurological disorders in piglets.
11

(Photos Copyright FAO 1997)

D Ở bò chủ yếu biểu hiện ở 2 thể:
• Thể kích thích: đặc trưng nhất là ngứa nhiều ở một vùng hay
nhiều vùng ở các vùng da đầu, ngực, đùi.
• Thể bại liệt: con vật suy nhược, chướng bụng, táo bón, bại liệt,
chảy nhiều dãi, có trường hợp bị liệt bụng.
D Ở chó và mèo:
• Ở mèo, triệu chứng đầu tiên là rối loạn v
ận động, con vật bồn
chồn, kêu nhiều, tiếng kêu khan khan, sau đó run rẩy, liệt toàn
thân và chết nhanh.
• Ở chó biểu hiện ngứa nhiều ở mõm, liệt cơ họng.
• Ở những loài khác thường thì chỉ những vùng bị thương bị
phù,sung huyết ở tủy sống
(a, />HTM)
g) Bệnh tích

White to yellow necrotic foci on spleen (pig).
(Photos Copyright FAO 1997)
D Bệnh giả dại ít có bệnh tích đặc trưng.
• Có những điểm hoại tử trắng ở gan, lách.

thận, hạch bạch huyết,
niêm mạc họng, amidam
được lấy từ những con
13

heo nghi ngờ nhiễm ADV.
D Lấy mẫu thí nghiệm ở heo
• Mẫu máu: lấy ở tĩnh mạch cổ hay ở tĩnh mạch tai bằng xylanh
tự động.
• Dịch mũi: khi con vật có biểu hiện rối loạn hô hấp (khó thở, khò
khè…) lấy tăm bông ngoáy vào hốc mũi.

D Thời gian lấy mẫu
• Khi con vật biểu hiện những triệ
u chứng lâm sàng, lấy mẫu ở
các lỗ tự nhiên.
• Khi con vật đã
chết (mới chết
trong vòng 6
giờ) mổ ra,
biều hiện bệnh
tích ở đâu thì
lấy mẫu tại đó
(đường hô hấp, tiêu hóa, thần kinh).
D Những điều cần lưu ý khi lấy mẫu:
• Lấy máu ở tĩnh mạch cổ khi cần lượng máu nhiều.

• Lấy máu ở tĩnh mạch tai khi không cần nhiều máu.
• Đối với nái mang thai nên lấy ở giai đoạn heo mới sinh 2-3
ngày.

thành huyễn dịch 10% bằng máy Laboratory Tissue Pulverizer.
Sau đó ly tâm 1000 vòng/phút ở 4
o
C trong 30 phút để loại bỏ
mãnh vỡ của mô. Dịch nổi bên trên được gạn ra và dự trữ ở -
70
o
C. Hoặc ta có thể nghiền bằng tay.
• Mẫu mô được để ngay góc cối gần chỗ miệng lấy ra. Nếu mẫu
mềm thì nghiền trực tiếp. Nếu mẫu cứng thì nghền bằng thủy
tinh nhuyễn để tách được các tế bào đơn.
15

• Lấy 9 phần HBSS cho vào nghiền tiếp, nghiền xong cho vào
ống nghiệm.
• Sau đó cho mẫu vào tủ lạnh rồi đem ra thực hiện 1-2 lần để tế
bào vỡ ra và ta thu hoạch virus.
• Sau đó lọc lấy nước trong (ly tâm) cho vào lọ khác có nắp, cho
kháng sinh vào (penicillin, streptomicine) để trong 30’-1h, sau
đó lọc qua màng lọc 0.2 um và đưa vào môi trường tế bào.
• Mẫu huyết thanh cho qua lọc 0.2 um và đưa vào môi trường tế
bào.
b) Chuẩn b
ị môi trường tế bào
D Cả hai loại tế bào PK-15 và BT được phát triển trong môi trường
tối thiểu của Eagle với muối, 8% huyết thanh thai bò, penicillin
(100 đơn vị/ml), streptomicine sulfate (100 ug/ml), fungizone (1
ml), gentmicine (50 ug/ml).
D Mỗi giếng của đĩa 24 giếng được cho vào 1 ml dịch huyền phù tế
bào chứa 1.5x10

và
được quan sát bệnh tích đặc trưng trong các khoảng cách thời gian
là 8 giờ đồng hồ.
D Sau khi xuất hiện CPE, tế bào một lớp trong các shell vial được
trộn trực tiếp với kháng thể nhuộm huỳnh quang. Sau đó các tấm
phủ được nhẹ nhàng loại ra bằng cách sử dụng cái kẹp. Các tấm
phủ được hơ khô, để ở rìa slide kính, và kiểm tra huỳnh quang. (b)
d) Chẩn đoán ADV bằng 24-Well Plate Cell Culture Assay
D Các giế
ng chứa tế bào một lớp PK15 hay BT được cho vào 0.5 ml
mẫu và ủ ở 37
o
C trong một giờ để virus hấp thụ. Sau khi rửa với
HBSS, 1.5 ml môi trường tối thiểu chứa 4% huyết thanh ngựa chữa
được cho vào và đem đi ủ ở 37
o
C trong không khí có 5% CO
2
.
Thêm vào 1 vial chứa mẫu không nhiễm (mock-infect cell) vào để
làm đối chứng âm. Đĩa dược quan sát dựa trên chỉ tiêu sự xuất hiện
bệnh tích tế bào mỗi ngày trong 7 ngày.
D Những giếng có xuất hiện bệnh tích được xử lý với kháng thể gắn
huỳnh quang.
D Môi trường nuôi cấy được loại bỏ và các tế bào một lớp bị nhiễm
được rửa với phosphate buffer saline (PBS), pH 7.2. Tế bào được
vét với vài giọt PBS bằ
ng một pipet chuyển, và huyền phù tế bào
được cho vào một cái giếng có vòng đen (black-ringed well)
đường kính 7 mm trên một slide kính nhiều giếng (multiwell glass

• Trong 244 mẫu được xác định, 118 (48.4%) mẫu được xác định
là dương tính với phương pháp 24-well plate cell culture, 121
(49.2%) được xác định là dương tính với SVA.
• Trong 118 mẫu dương tính với phươ
ng pháp 24-well plate cell
culture thì có 113 (95,8%) mẫu là dương tính đối với dòng tế
bào BT, 117 (99,2%) mẫu là dương tính đối với dòng tế bào
PK15.
18

• Trong 121 mẫu dương tính với SVA thì có 113 (93,4%) mẫu là
dương tính đối với dòng tế bào BT, 121 (100%) mẫu là dương
tính đối với dòng tế bào PK15.
• 24 giờ sau khi cấy mẫu vào, 91 (75.2%) mẫu có bệnh tích
dương tính đối với SVA, trái lại chỉ có 15 (12.7%) mẫu là
dương tính đối với phương pháp 24-well plate cell culture. (b) III. Kết luận
D Từ kết quả thí nghiệm của Rafique A. Tahir, Sagar M. Goyal ta
thấy phương pháp SVA nhạy và nhanh hơn so với phương pháp
24-well plate cell culture.
D Cũng như thế tế bào PK15 nhạy hơn tế bào BT trong việc phát hiện
ADV. (b)
IV. Tài liệu tham khảo
1) Tiếng việt
(a) Tủ sách khuyến nông phục vụ người lao động-NXB lao động: Những điều
cần bi
ết về một số bệnh mới do virus, trang 14-18.
2) Tiếng anh