1

Trường Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh
Bộ môn Công nghệ sinh học
Lớp DH06SH

Bài tiểu luận: CHẨN ĐOÁN VIRUS LỞ MỒM
LONG MÓNG BẰNG KỸ THUẬT
NUÔI CẤY TẾ BÀO Giáo viên hướng dẫn: Nguyễn Ngọc Hải
Sinh viên thực hiện: Nguyễn Duy Lan
MSSV: 06126067
32. TỔNG QUAN
2.1 Bệnh lở mồm long móng
2.1.1 Lịch sử phát hiện bệnh
Mô tả đầu tiên bằng văn bản về dịch có lẽ vào năm 1514, khi Fracastorius mô tả một căn
bệnh tương tự trên gia súc tại Italy. Gần 400 năm sau, vào năm 1897 Friedrich Loeffler và
Frosch đã chứng minh được tác nhân gây nên bệnh lở mồm long móng có thể qua lọc.
Hình: Friedrich Loeffler
Đây là minh chứng đầu tiên cho thấy một bệnh trên động vật do tác nhân qua lọc gọi là
virus gây ra, mở ra một kỷ nguyên mới cho ngành virus học (Virology).
1929: Những trường hợp cuối cùng ở Mỹ
1953: Những trường hợp cuối cùng ở Canada và Mexico
1993: Italy
1997: Đài Loan (Taiwan)
2001: Anh (United Kingdom)
Vài đợt dịch khác trong những năm 1967-1968 and 1981. Dịch bệnh lở mồm long móng đã
xảy ra ở nhiều châu lục như châu Á, châu Phi, châu Âu và Nam Mỹ. (7)
Ở châu Âu, bệnh đã bùng phát tại Anh, Hà Lan và Pháp vào năm 2001. Hàng triệu gia súc
bị thiêu hủy gây tổn thất lớn cho ngành chăn nuôi nói riêng và nền kinh tế các quốc gia này
nói chung.
Cùng năm đó, dịch cũng đã xảy ra tạ
i Hàn Quốc, Nhật Bản và Đài Loan.

4

6

Hình: FMD type O virus từ phía Bắc Việt Nam
Tính tới ngày 1/11/2009:
Ở Tuyên Quang: Ngày 25/10/2009, dịch Lở mồm đã xảy ra trên địa bàn xã Công Đa của huyện
Yên Sơn làm 17 con trâu mắc bệnh. Kết quả xét nghiệm bệnh phẩm dương tính với chủng vi rút Lở
mồm long móng type O. Hiện tại, địa phương đang tiến hành các biện pháp phòng, chống dịch theo
quy định.
Hiện nay, cả nước còn 10 tỉnh là: Quảng Nam, Đăk Lăk, Yên Bái, Sơn La, Hà Giang, Quảng Ninh,
Gia Lai, Hòa Bình, Lai Châu và Tuyên Quang có dịch LMLM chưa qua 21 ngày.
2.2 Giới thiệu về virus lở mồm long móng
2.2.1 Đặc điểm cấu trúc, hình thái
Virus lở mồm long móng ( Foot and Mouth Desease Virus) được phát hiện bao gồm một
sợi đơn RNA, kích thước khoảng 8500 base, được bao bọc bởi bốn protein cấu trúc (VP1,
VP2, VP3, VP4) tạo thành lớp vỏ capsid có 20 mặt (icosahedral). (1)
VP1, VP2, VP3 tạo nên một bề mặt của khối 20 mặt đối xứng (phân tử 12S) còn VP4 là
protein bên trong capside, kết dính ARN virus với mặt trong của capside.

7

Hình: Cấu trúc FMD Virus
FMD Virus thuộc họ Picorna Viridae có 7 type (O, A, C, SAT1, SAT2, SAT3 và Asia 1,
mỗi type còn có nhiều phụ type, thí dụ như các tiểu type O1, O2, O3 …, A1, A2, A3, C1,
C2, C3 … căn cứ vào sự khác biệt về gen và cấu trúc kháng nguyên). Các type virus phân
bố không đều nhau trên thế giới, type O là type phổ biến trên thế giới hơn cả. Các type khi
giám định huyết thanh đều không có miễn dịch chéo, và trong các ổ dịch, động vật có thể
mắc bệnh do một hoặc cùng một lúc nhiều type huyết thanh. Vì thế, nếu có sự biến đổi về
mặt di truyền dẩn đến biến đổi về mặt kháng nguyên virus ở các ổ dịch thì việc kiểm soát
bệnh bằng vaccine cũ sẽ không có hiệu quả.
Virus type A là nhóm có tính đa dạng kháng nguyên cao nhất. Type A có đến 32 type phụ.

Adsorption and
penetration
Capsid proteins (VP1 to 3)
Integrins, other receptors (?),
entry factors (?)
Translation Lpro, IRES elements eIFs, PTBP, ITAF45
RNA replication
S region, poly(C), cre, 2B, 2C, 3A, 3B,
3Cpro, 3Dpol
Cellular membranes, PCBP,
PABP
Assembly and
maturation
Capsid proteins (VP0, VP1, and VP3),
3Cpro, 2A, viral RNA
Cellular membranes (?)
Bảng: Các yếu tố của virus và tế bào chủ có thể quyết định độc lực.
Các nghiên cứu cho thấy virus có trình tự RGD của VP1 G-H loop thì hoặc sẽ đột biến
hoặc không thể nhân lên trong nuôi cấy hoặc không thể gây bệnh ở gia súc được. (11)
Các biến thể virus type O rất thích hợp với các thụ thể HS in vitro, cho thấy tầm quan trọng
của sự tương tác virus-intergrin in vivo (Integrin là họ các protein xuyên màng có trong
màng của tế bào động vật. Chức năng chính của nó là tạo liên kết với extracellular matrix
(ECM) và truyền tín hiệu giữa ECM với tế bào).
L
pro
được

cho thấy là một yếu tố quyết định độc lực virus, dựa trên cơ sở thí nghiệm trên
động vật với các kỹ thuật di truyền, virus type A
12

cánh tay và các nơi khác. Đặc biệt, mụn gây ngứa, gây triệu chứng gãi nhiều, đôi khi mụn
có thể mọc ở lợi răng, gây viêm miệng. Bệnh có thể kéo dài đến 10 ngày, sau đó sẽ hết
bệnh.
Chất chứa virus:
- Mụn nước là nơi tập trung nhiều virus nhất, đặc biệt là mụn nước sơ phát mới hình
thành.
- Trên cơ thể thú ngoài mụn nước, các chất bài tiết như nước bọt, nước tiểu, phân, sữa,
nước mắt, nước mũi cũng chưá nhiều virus. Số lượng virus trong chất thải này có thể thay
đổi tuỳ thuộc vào thời gian mắc bệnh, thường rất cao trong ngày đầu và giảm dần. Sau 2
tuần hầu như không còn thấy virus trong các chất bài tiết. Trung bình 1 con heo mắc bệnh
sẽ bài thải khoảng 4 tỉ virus mỗi ngày (gấp 3.000 lần trên bò).
- Trên thú chết hoặc bị giết mổ, virus tập trung nhiều trong máu, bắp cơ và ở các nội tạng.
Lượng virus trong bắp cơ cao hơn trong máu và có mặt đến ngày thứ 7 sau khi mắc bệnh.
2.3.2. Đường xâm nhập và cách truyền bệnh (5)
Đường xâm nhập chính là tiêu hoá, virus có thể vào cơ thể qua niêm mạc miệng, và niêm
mạc ống tiêu hoá. Ngoài ra, các vết trầy ở da, đầu vú cũng là nơi virus xâm nhập vào cơ
thể. Đường sinh dục và hô hấp được coi là đường xâm nhập phụ.
Quá trình lây lan bệnh diễn ra theo các cách thức sau:
+ Lây trực tiếp qua nước bọt hoặc các chất bài tiết do nhố
t chung hoặc chăn thả chung
gia súc bệnh với gia súc khoẻ mạnh.

11
+ Lây gián tiếp qua thức ăn, nước uống, các dụng cụ chăn nuôi, chân tay, giầy dép của
người chăn nuôi, người tham gia điều trị bệnh hoặc lây lan do việc bán chạy các gia súc
mắc bệnh, mổ lậu gia súc mắc bệnh, không xử lý đúng mức thịt gia súc mắc bệnh hoặc
vận chuyển gia súc mắc bệnh.
+ Virus có thể theo gió phát tán ra không khí trong cự ly 10km.
2.3.3. Cơ chế gây bệnh (5)
- Thời gian nung bệnh trung bình 2-4 ngày, đôi khi kéo dài đến 7 ngày.

làm gia súc chết ngộp.
2.3.4. Triệu chứng bệnh (8)
Thời gian nung bệnh từ 2-7 ngày, trung bình là 3-4 ngày, gồm 3 thể bệnh
Thể thông thường
- Bệnh hay gặp ở vùng nhiệt đới, thú ủ rũ, lông dựng, da mũi khô, thú sốt cao 40-41 0C
kéo dài 3 ngày.
- Xuất hiện các mụn nước ở da, vành móng kẻ chân, lưỡi, vú làm thú kém ăn, nhai khó
khăn.
13
Chảy nước bọt ở góc miệng Thương tổn lưỡi bò

Hình thành mụn nước quanh đầu vú, đầu vú bị thương tổn

- Ở miệng: lưỡi có mụn to ở đầu lưỡi gốc lưỡi ở hai bên lưỡi, xoang trong miệng trong
má, lỗ chân răng, môi có mụn lấm tấm bằng hạt ké, hạt bắp. Sau đó mụn vỡ và tạo thành
các vết loét đáy nhỏ và phủ màu xám. Nước dãi chảy nhiều như bọt xà phòng.

Virus LMLM gây thương tổn vùng miệng và lưỡi
- Ở mũi: niêm mạc có mụn nước, đặt biệt là vành mũi có mụn loét, nước mũi lúc đầu
trong sau đục dần.

14
- Ở chân, kẽ móng có mụn nước từ trước ra sau, mụn vỡ làm long móng.
- Ngoài da: xuất hiện các mụn loét ở vùng da mỏng như bụng, bẹn, vú, ở đầu núm vú …
- Sau khi hàng loạt mụn nước vỡ dần sẽ dẫn đến nhiễm trùng máu, nhiễm trùng da, thú
sốt cao, suy nhược dần rồi chết
Thể biến chứng

móng, thối móng, rụng xương bàn chân. Khi khỏi bệnh thì ở các vết loét sẽ để lại sẹo ở
miệng.
2.4 Chẩn đoán virus lở mồm long móng
2.4.1 Chẩn đoán bằng kỹ thuật nuôi cấy tế bào
a. Giới thiệu về kỹ thuật nuôi cấy tế bào
Nuôi cấy tế bào là là đơn vị nuôi cấy nhỏ nhất, là kỹ thuật duy trì và phát triển các tế bào
ngoài cơ thể sống, các tế bào trong điều kiện phòng thí nghiệm vẫn tự phân chia, thực hiện
đầy đủ các chức năng biến dưỡng và các chức năng chuyên biệt của tế bào. Nuôi cấy tế bào
Kỹ thuật nuôi cấy tế bào được tiến hành lần đầu vào năm 1907 bởi Harrison với những tế
bào thần kinh ếch.
Ngày nay, kỹ thuật nuôi cấy tế bào được ứng dụng rộng rãi trong các lĩnh vực thú y, nhân
y, sinh học trong mục đích nghiên cứu tác động của các chất lên tế bào (dược học, độc tố
học), chẩn đoán và điều trị ung thư (ung thư học), chẩ
n đoán các tác nhân gây bệnh, sản
xuất kháng thể đơn dòng, sản xuất vaccine (miễn dịch học, virus học, vi khuẩn học), chẩn
đoán biến đổi gen và sản xuất các sản phẩm sinh học như hormone, enzyme trị liệu (công
nghệ gen, công nghệ sinh học). Việc nuôi cấy tế bào động vật đòi hỏi các điều kiện tiệt
trùng nghiêm ngặt và môi trường nuôi cấy phức tạp, giàu chất dinh dưỡng.
Các loại tế bào nuôi cấy

16
Trong nuôi cấy tế bào động vật, người ta phân biệt hai trường hợp: tế bào bậc một hay tế
bào sơ cấp và tế bào bậc hai hay tế bào thứ cấp.
- Tế bào bậc một (Primary cells) là những tế bào thu được trực tiếp từ các cơ quan hay
mô động vật.
- Khi nuôi cấy chuyển tiếp các tế bào này trong điều kiện phòng thí nghiệm sẽ thu được
tế bào bậc hai (Secondary cells), những tế bào này có thể được nuôi chuyển tiếp nhiều
lần, một số trong đó có khả năng duy trì sự phát triển trong vài tuần hoặc vài tháng,
nhưng một số có thể duy trì sự phát triển không hạn định. Những tế bào này sẽ được
giữ lại làm những dòng tế bào giống phục vụ cho các nghiên cứu trên tế bào.

- Hệ thống lọc vô trùng và hệ thống trypsin hoá
- Dụng cụ thuỷ tinh và nhựa: đựng môi trường và nước cất
- Kính hiển vi soi ngược
- Một số máy móc khác như : autoclave, máy đếm tế bào, máy chụp hình, máy
ly tâm,
Kỹ thuật vô trùng
Có tầm quan trọng rất lớn trong nuôi cấy tế bào động vật.
- Xử lý chai nhựa nuôi cấy tế bào
- Xử lý chai thuỷ tinh
- Vô trùng khu vực thao tác
- Vô trùng bề mặt khu vực làm việc : dọn sạch bằng cồn 70
o
, lau cồn các dụng
cụ, sắp xếp dụng cụ, làm xong dọn dẹp nơi thao tác, sát trùng buồng sấy vô
trùng bằng tia cực tím trước mỗi lần thao tác.
Môi trường và những yếu tố cần thiết cho nuôi cấy
Yêu cầu: tế bào trong ống nghiệp gần giống trong động vật sống
Các yếu tố quan trọng
- Nền: tạo bề mặt đặc biệt để tế bào bám
- Môi trường: đủ dưỡng chất cho tế bào phát triển (Carbonhydrate, Glucose,
Amino acid, muối đẳng trương, Bicarbonate, Vitamin, Hormone, Phenol Red,
). Chất bổ sung vào môi trường : huyết thanh 10%
Điều kiện nuôi cấy

- Nhiệt độ: 37
o
C. Nhiệt độ thấp hơn 37
o
C, tỷ lệ phát triển giảm, tế bào chưa bị tổn
thương. Nhiệt độ từ 39-40

- Ủ môi trường trong tủ ấm trước khi cấy chuyển: do môi trường ở nhiệt độ
phòng không hẳn là nhiệt độ thích hợp cho tế bào
- Tách tế bào khỏi bề mặt tăng trưởng bằng trypsin trong 15 phút, hút bỏ môi
trường, rửa lớp tế bào bằng 5ml PBSA
- Cho 3ml trypsin, để lọ tế bào trong tủ ấm 5 phút. Bất hoạt trypsin bằng 5ml môi
trường phát triển, rút cho vào ống ly tâm
- Ly tâm 2000vòng/phút trong 5 phút, đổ bỏ phần nước trên. Cho 3ml môi trường
phát triển, trộn đều, hút vào lọ nuôi cấy đã có sẵn 4ml môi trường phát triển.
- Đưa lọ vào tủ ấm 37
o
C / 5% CO
2

Thu hoạch tế bào
- Dùng trypsin ở 37
o
C
- Để bình nuôi cấy vào tủ lạnh.
- Cho trypsin ở 37
o
C vào, tế bào co tròn, bong ra khỏi bề mặt nuôi cấy.
b. Chẩn đoán virus lở mồm long móng bằng kỹ thuật nuôi cấy tế bào
Chọn mẫu
Lấy mẫu ở đường hô hấp, dịch họng, hay đường tiêu hoá, biểu mô nghi ngờ nhiễm virus.
Thời gian lấy mẫu nên là lúc mới biểu hiện các triệu chứng, hay lúc mới chết, không nên
lấy mẫu lúc con vật đã chết được một thời gian.
Cách bảo quản

19
Xét nghiệm chẩn đoán nhiễm virut phụ thuộc rất nhiều vào chất lượng của bệnh phẩm, vì

phẩm vào từ từ, tránh làm bong lớp tế bào ra.
Thu hoạch tế bào.
Kết quả

20
• Để xác định virus có gây bệnh tích tế bào hay không, dùng phương pháp nhuộm tế
bào (dùng kháng thể đơn dòng gắn huỳnh quang) thực hiện trực tiếp trên môi
trường tế bào.
• Nếu có virus, khi quan sát trên kính hiển vi, do virus bắt màu sẽ thấy phát huỳnh
quang màu xanh.
2.4.2 Các kỹ thuật chẩn đoán khác
- Chẩn đoán bằng kỹ thuật gen.
- Chẩn đoán bằng kỹ thuật Elisa.
- Phương pháp xét nghiệm miễn dịch.
- Phương pháp xét nghiệm trung hoà huyết thanh.
- Chẩn đoán bằng kỹ thuật PCR, RT-PCR, …
3. KẾT LUẬN
Bệnh lở mồm long móng là một bệnh truyền nhiễm rất nguy hiểm, lây lan nhanh trên gia
súc thuộc bộ guốc chẵn. Bệnh là mối nguy hại lớn đối với ngành chăn nuôi gia súc trong
nước, ảnh hưởng lớn đến lợi ích kinh tế, xã hội, môi trường. Bệnh có triệu chứng lâm sàng
khó phân biệt sớm được với các bệnh mụn nước khác như: Swine Vesicular Disease
(SVD), Vesicular Stomatitis (VS), and Vesicular Exanthema (VE). (15). Do đó, việc chẩn
đoán bệnh nhanh và chính xác là rất cần thiết, nhằm có biện pháp phòng trừ thích hợp,
đồng thời giảm mức độ thiệt hại do lây nhiễm bệnh xuống mức thấp nhất. Nuôi cấy tế bào
có độ chính xác cao, là phương pháp duy nhất thu nhận virus cho các nghiên cứu tiếp theo,
tuy nhiên phương pháp này đòi hỏi người thao tác có chuyên môn cao, cần nhiều thiết bị
hiện đại,
4. TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Marvin J. Grubman
*

Jong Hyeon Park1, Yong Joo Kim1, Yi Seok Joo1, Hee Jong Song2. Identification and
antigenic site analysis of foot-and-mouth disease virus from pigs and cattle in Korea. J.
Vet. Sci. (2005), 6(2), 117–124
15. />fever-virus-csfv 22