Chẩn đoán bệnh lở mồm long móng (FMD)

Nguyễn Thúy Kiều|
1

Oct.30
Trường Đại Học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh
Bộ môn Công Nghệ Sinh Học
Lớp DH06SH

P

Tiểu luận: CHẨN ĐOÁN BỆNH GIA SÚC GIA CẦM

CHẨN ĐOÁN VIRUS LỞ MỒM LONG MÓNG
(FMDV) BẰNG KỸ THUẬT GENE Chẩn đoán bệnh lở mồm long móng (FMD)

Nguyễn Thúy Kiều|
2

Oct.30
ĐẶT VẤN ĐỀ
Bệnh lở mồm long móng (Foot and Mouth Disease – FMD) hiện nay vẫn đang còn gây
thiệt hại kinh tế quan trọng ở nhiều nơi trên thế giới, mặc dù nó đã được thanh toán hoặc
khống chế thành công tại nhiều nước. Bệnh gây thành dịch ở nhiều loài động vật móng
guốc chẵn, chủ yếu là trâu, bò và lợn. Bệnh lở mồm long móng được biết đến như nạn đại
dịch của các đàn bò, cừu và l
ợn tại nhiều nước từ thế kỷ XIX. Bệnh có ở khắp thế giới.

phương pháp đang được nghiên cứu và áp dụng để phát hiện kịp thời để đưa ra những
giải pháp xử lý hiệu quả.
I. TỔNG QUAN
1.1. FMD (foot and mouth disease)
Lở mồm long móng (FMD) là bệnh truyền nhiễm cấp tính nguy hiểm do virus gây ra.
Đây là bệnh được tổ chức dịch tể thế giới (Office International des Epizooties _ OIE) xếp
vào hàng đầu trong danh mục A gồm 15 bệnh truyền nhiễm nguy hiểm cho các loài móng
guốc chẵn: trâu, bò, dê, cừu, heo (Cục thú y, 1993). Năm 2001, một vụ dịch khác xảy ra
sau hơn 20 năm vắng bóng tại nước Anh, cũng gây thiệt hại cho ngành chăn nuôi và du
lịch khoảng 2 tỷ USD. Ở nướ
c ta bệnh đầu tiên được phát hiện ở Nha Trang (1898) sau
đó lang ở cả ba miền. Năm 1995 có 26 tỉnh, thành có bệnh với hàng ngàn ổ dịch (19.883
trâu, bò và 10.293 heo bệnh, chết 384 trâu bò, 5208 heo _ cục thú y Việt Nam) đã gây tác
hại lớn đến nền kinh tế cho các trại chăn nuôi (giảm 25% sức sản xuất) và nền kinh tế
nước ta. Việt Nam là nước trong vùng Châu Á được báo cáo trên bản đồ dịch tể bệnh lở
mồm long móng thế giới là vùng dịch đị
a phương (endemic) (Gleeson, 2002). Dịch lở
mồm long móng đã xảy ra trên trâu bò liên tục suốt thời gian từ 1975-2005, trên lợn
1992-2005 và gây thiệt hại nặng nề nhất vào các năm 1993, 1995, 1999, 2000. Ngoài typ
O lưu hành trong nhiều năm qua, typ A cũng đã được phát hiện năm 2004 trên trâu bò và
Chẩn đoán bệnh lở mồm long móng (FMD)

Nguyễn Thúy Kiều|
4

Oct.30
typ Asia 1 trên lợn năm 2005 ở Việt Nam. FMD là một bệnh địa phương và các type


Oct.30
bọt bia. Niêm mạc miệng, môi, lợi, chân răng đỏ ửng, khô, nóng. Mụn nước bắt đầu mọc
ở bên trong má, mép, chân răng, môi, lợi, và bề mặt lưỡi. Kích thước mụn bằng hạt gạo,
hạt ngô hoặc to hơn. Mụn nước phồng lên, có màng bọc mỏng, bên trong chứa nước
trong, sau đục dần. Sau 1-2 ngày, mụn nước bị vỡ, lớp niêm mạc tróc ra để lộ mặt dưới
đỏ, chạm nhẹ vào dễ ch
ảy máu. Mụn nước thường không có mủ. Do viêm vùng miệng,
con vật có chịu, luôn lúc lắc đầu, nhai tóp tép, nước bọt sùi ra đầy mõm miệng, chảy lòng
thòng thành sợi dài.
Do có viêm mụn nước ở vùng vành móng, kẽ móng chân làm con vật khó chịu, tỏ ra đau
đớn, bồn chồn, luôn nhấc chân lên. Dễ thấy nhất là hiện tượng què, không đi cày kéo
được trong khoảng 1-2 tuần. Có trường hợp móng chân bị long hẳn ra, phổ biến nhất là ở
lợn. Triệu chứng què ở
cả đàn trâu bò gây ảnh hưởng xấu đối với vùng dựa vào sức kéo
của chúng, làm lỡ thời vụ gieo trồng, có nơi năng suất lúa bị giảm 20%.
ở con vật cái đang nuôi con, triệu chứng và bệnh tích ở bầu vú, núm vú cũng tương tự
như ở miệng và chân làm con vật giảm tiết sữa, sữa bị giảm phẩm chất. Con mẹ thường
không cho con bú vì đau, làm con non thiếu sữa. Hơn nữ
a chính con non cũng bị viêm lở
mồm như mẹ nên không bú được. Hậu quả có tới 50-80% gia súc non bị chết. Ở con vật
trưởng thành, tỷ lệ mắc bệnh trong đàn có serotyp đều gây bệnh giống nhau.
Súc vật cái mang thai nhiễm virus lở mồm long móng sẽ sẩy thai.
Biến chứng: Viên cơ tim ở súc vật non và viêm ruột (bê non, lợn <-2 tháng).
Chẩn đoán bệnh lở mồm long móng (FMD)

Nguyễn Thúy Kiều|
6

Oct.30

bị nhiễm trùng. ở đây, con người là yếu tố quan trọng làm lây lan bệnh, nhất là khi đưa
gia súc có bệnh hoặc các sản phẩm của chúng đến nơi khác. Bệnh có thể truyền qua bào
thai.
 Thời kỳ ủ bệnh
Từ 1 – 7 ngày, trung bình 3 – 4 ngày. Trong suốt thời gian từ khi có các triệu chứng đầu
tiên đến khi kh
ỏi bệnh. Nhiều trâu bò sau khi khỏi bệnh vẫn còn mang trùng và thải trùng
hàng tháng, có trường hợp tới 3 năm. Lợn có vai trò thải trùng rất lớn, gấp nhiều lần trâu
Chẩn đoán bệnh lở mồm long móng (FMD)

Nguyễn Thúy Kiều|
8

Oct.30
bò khi đang có triệu chứng, nhưng sau khi khỏi lâm sàng, lợn vẫn thải virut sau 1-2
tháng, trâu bò sau khỏi lâm sàng vẫn thải virut 6-24 tháng. Đây là đặc điểm quan trọng
trong quá trình phòng chống bệnh ở gia súc. Sức đề kháng của mầm bệnh với điều kiện tự
nhiên và thuốc sát trùng.
II. NỘI DUNG
2.1. Giới thiệu về virus gây lở mồng long móng (FMDV)
Do virus Apthovirus gây ra. Aphthovirus thuộc giống Picornaviridae. Có 7 type huyết
thanh gồm: A, O, C, SAT1, SAT2, SAT3 và Asia 1 gây bệnh có triệu chứng giống nhau
nhưng không gây miễn dịch chéo. Các typ O1, O2, O3 …, A1, A2, A3, C1, C2, C3 …
căn cứ vào sự khác biệt về gen và cấu trúc kháng nguyên. Cấu trúc của FMDV (foot and
mouth disease virus) là cấu trúc đối xứng khối 20 mặt, gồm 1 sợi RNA mạch đơn chứa
8500 nucleotide được đóng gói trong một vỏ protein được tạo thành từ 60 capsome,
không vỏ bọc. Mỗi capsomer gồm 4 lo
ại polypeptide VP (virus protein) ký hiệu
VP1(1D), VP2 (1C), VP3 (1B), VP4 (1A). 4 loại VP này đều có nguồn gốc từ VP0, VP1
ở lớp ngoài cùng, là yếu tố cấu trúc, tham gia quá trình cố định virus trên màng tế bào, có

R
L VP4 VP2VP3VP12A2B2C3A3B
1
3B
2
3B
3
3C3D3' UT
R
VP1:xanhdương
VP2: xanh lá cây
VP3: đỏ
VP4: vàng
Chẩn đoán bệnh lở mồm long móng (FMD)

Nguyễn Thúy Kiều|
10

Oct.30
pentamer, 12 pentamer liên kết nhau theo cấu trúc khối đối xứng gồm 3 trục để hình
thành 1 sợi RNA, đó là 1 virus.

Hình: Cấu trúc của FMDV. Có
3 loại protein bề mặt là VP1,
VP2, VP3. Mỗi protein hiện
diện với dạng hình thang trên bề
mặt. Ba loại protein này nhóm
lại tạo thành 1 đơn vị cấu trúc
được chỉ ở bên trái.
Chẩn đoán bệnh lở mồm long móng (FMD)

Tương đối mạnh, chịu lạnh, chịu khô đến 14 ngày (mùa hè), 6 tháng (mùa đông). Trong
đất từ 3-28 ngày. Trong nước tiểu virus tồn tại 39 ngày. Virus bền vững ở pH 7,2 và 7,6
nhưng rất mẫn cảm với pH <4 và pH >11. Ở 4
0
C virus có thể sống sót 1 năm, nhưng khi
nhiệt độ tăng lên thì thời gian sống sót còn 8-10 tuần ở 28
0
C, 10 ngày ở 37
0
C và ít hơn 30
phút ở 50
0
C. Đun nóng 70
0
C, chết sau 15 phút, 100
0
C chết ngay. Trong tủ lạnh sống được
425 ngày, trong cỏ khô sống được 8-15 tuần. Trong đất ẩm virut sống hàng năm. Xút 1%
Chẩn đoán bệnh lở mồm long móng (FMD)

Nguyễn Thúy Kiều|
13

Oct.30
diệt virus sau 10 phút, Formol 2% - 6 giờ.
Virus trong không khí còn sống tốt nhất ở ẩm độ tương đối RH > 60%.
2.2. Các phương pháp chẩn đoán
Các kỹ thuật phân tích khác nhau đã được sử dụng để phát hiện acid nucleic của virus,
kháng nguyên và sự đáp ứng miễn dịch của vật chủ gồm: kết hợp bổ thể (complement
fixation test_CFT), trung hòa virus (virus neutralization), ELISA (enzyme_linked

thể. Có thể đây là 1 kỹ thuật huyết thanh học nhạy nhất với mục đích chẩn đoán và
xác định typ.
Cả hai phương pháp trung hòa virus và ELISA cạnh tranh trong pha lỏng đều phát hiện
kháng thể kháng protein cấu trúc, protein vỏ của virus nhưng không phân biệt
được đó là
kháng thể của động vật đã tiêm vacxin hay do nhiễm virus.
Virus lở mồm long móng (FMDV) khi xâm nhiễm vào tế bào vật chủ sẽ dịch mã để tạo
nên các protein cấu trúc và protein không cấu trúc. Các protein không cấu trúc liên quan
đến hoạt động của virus và biến đổi chức năng tế bào vật chủ. Một số protein không cấu
trúc gây đáp ứng miễn dịch và tạo ra các kháng thể đặc hiệu với chúng. Vacxin chỉ chứa
hạt virus tinh sạch v
ới dung dịch đệm và chất bổ trợ nên đáp ứng miễn dịch với vacxin
chỉ tạo ra kháng thể kháng protein cấu trúc của virus. Trong trường hợp vacxin không
tinh sạch bị nhiễm protein không cấu trúc, cũng xảy ra một đáp ứng miễn dịch yếu và
ngắn ngủi đối với loại protein này, vì hàm lượng chúng rất thấp. Do đó nếu phát hiện
kháng thể kháng protein không cấu trúc ta có thể kết luận con vật bị nhiễ
m virus lở mồm
long móng (FMDV) chứ không phải do vacxin.
Một số protein không cấu trúc của virus gây đáp ứng miễn dịch: 3D, 3A/3AB/3ABC, 2C,
2B, 3C và L
pro
. Trong thời gian gần đây một số protein không cấu trúc 2C, 3B, 3AB,
3ABC đã được nghiên cứu và nhiều phương pháp có độ nhạy cao đã được phát triển.
 RT_PCR: để xác định gia súc nhiễm bệnh đồng thời xác định typ virus gây bệnh
FMD dai dẳng ở thực địa thì kỹ thuật PCR rất nhạy, nhanh, chính xác, hiệu quả sẽ
Chẩn đoán bệnh lở mồm long móng (FMD)

Nguyễn Thúy Kiều|
15


16

Oct.30
Sở dĩ RT- PCR nhận biết được bệnh nhanh như vậy vì nhờ việc kết hợp PCR với cặp mồi
1F/1R khả năng xác định các type O, A, C và ASIA- 1 gây bệnh của virus lở mồm long
móng diễn ra rất nhanh. Theo TS. Tô Long Thành, khi tiến hành dùng RT- PCR nhất thiết
phải làm trên 14 mẫu RNA vào cùng một thời điểm. Từ đây, chúng ta tiến hành theo dõi
các thay đổi của bệnh lý trên phác đồ điều trị. Trong thời gian này chỉ cần một trong số

các mẫu có sự thay đổi lên, xuống bất thường là chúng ta đã có thể xác định được nguồn
bệnh.
2.3. Chẩn đoán bằng RT-PCR
2.3.1. Nguyên tắc
PCR là kỹ thuật invitro dùng để khuếch đại một trình tự DNA dựa trên nguyên tắc của
một phản ứng sinh hóa nhờ hoạt động của enzyme polymerase.
Về nguyên tắc, bước đầu tiên của phản ứng RT-PCR là quá trình phiên mã ngược từ
khuôn mẫu mRNA để t
ạo ra sợi đơn cDNA. Một primer oligodeoxynucleotide sẽ gắn vào
mRNA và sau đó chúng sẽ được kéo dài nhờ một enzyme phiên mã ngược có hoạt tính
polymerase để tạo thành bản sao cDNA, bản sao này sau đó sẽ được khuếch đại nhờ vào
phản ứng PCR ở bước thứ hai.
2.3.2. Nguyên liệu
DNA quan tâm, enzyme tổng hợp DNA chịu nhiệt, 2 đoạn mồi nucleotide, 4 loại dNTP,
dung dịch đệm cho phản ứng, Mg
2+
.
 Các enzyme sử dụng cho phiên mã ngược
Sự phát hiện enzyme phiên mã ngược năm 1970.
Chẩn đoán bệnh lở mồm long móng (FMD)


hoạt động ở 37-42
0
C. Trong những trường hợp này phải sử dụng reverse
transcriptase chịu nhiệt thermoscript
TM
RT hoạt động ở 42-65
0
C.
 Các primer trong phiên mã ngược
Chẩn đoán bệnh lở mồm long móng (FMD)

Nguyễn Thúy Kiều|
18

Oct.30
Mồi là những trình tự oligonucleotide có khả năng bắt cặp chuyên biệt với đầu 5’ hay đầu
3’ của đoạn DNA cần khuếch đại. Mồi là yếu tố quan trọng quyết định tính đặc hiệu của
phản ứng PCR. Mồi cũng đóng vai trò khởi động hoạt động của DNA polymerase khi đã
ở trạng thái bắt cặp ở đầu 3’ (Mc Pherson và Moller, 2000). Có 3 loại mồi
9 Mồi chuyên biệt (gene specific primer_GSP): có th
ể giúp giảm hiện tượng bắt cặp
không chuyên biệt và tăng hiệu suất tổng hợp DNA bổ sung. Mồi chuyên biệt gene
được thiết kế giống mồi ngược antisense của PCR. Để phân biệt sản phẩm khuếch
đại từ cDNA hay từ DNA bộ gene, mồi chuyên biệt nên được thiết kế nằm trong
đoạn exon, khi đó sản phẩm PCR từ cDNA sẽ ngắn hơn sản phẩm khuếch đại t
ừ
DNA bộ gene nhiễm vào. Primer này sẽ lai lên các vị trí có chọn lọc trên một trình
tự đặc biệt của mRNA. Tuy nhiên khi sử dụng primer làm mồi cho quá trình phiên
mã ngược thì cặp primer sử dụng cho phản ứng PCR sau đó cần được thiết kế sao
cho primer trên sợi antisense sẽ bắt cặp ở phía trên đối với vị trí của

 Mg
2+
: nồng độ Mg
2+
là thông số quan trọng trong phản ứng RT-PCR và PCR nó
xác định dựa trên lượng RNA tổng số và loại reverse transcriptase sử dụng. Nếu
M-MLV RT, nên dùng 3mM Mg
2+
cho 1µg RNA tổng số và dùng 5mM Mg
2+
cho
1-5µg RNA tổng số. Nếu dùng AMV RT, nồng độ Mg
2+
tối ưu là 8mM. Nếu nồng
độ Mg
2+
thấp sẽ ứu chế hoạt động enzyme nên làm giảm hiệu quả kéo dài mạch.
Nếu nồng độ quá cao thì Mg
2+
sẽ ức chế sự biến tính hoàn toàn sản phẩm trong
mỗi chu kỳ, làm giảm số lượng bản sao của sản phẩm cuối cùng. Dư thừa Mg
2+

dẫn đến bắt cặp sai của mồi với DNA mẫu nên sẽ khuếch đại không chuyên biệt
cho sản phẩm không đặc hiệu và làm giảm độ chính xác của phản ứng PCR. Nồng
độ Mg
2+
tối ưu phải được xác định cho từng loại phản ứng qua nhiều thử nghiệm
(Mc Pherson và Moller, 2000).
 Nhiệt độ bắt cặp: t

+
hay K
+
.
Dãy nhiệt độ cần khảo sát bắt đầu từ nhiệt độ nhỏ hơn T
m
5
0
C và tăng dần thêm 2
0
C (Mc
Pherson và Moller, 2000).
2.3.3. Các bước thực hiện PCR
• Giai đoạn 1: biến tính (denateration), nhiệt độ 94-95
0
C trong 30-60s.
• Giai đoạn 2: bắt cặp (annealation), nhiệt độ 40-70
0
C.
• Giai đoạn 3: kéo dài (elongation), nhiệt độ 72
0
C trong 1-2 phút.
Một phản ứng PCR bình thường không vượt quá 40 chu kỳ là tốt nhất. Trong phản ứng
PCR, sản phẩm được tạo ra theo cấp số nhân trên cơ sở những sản phẩm ban đầu nên nếu
số chu kỳ khuếch đại quá lớn sẽ làm cho sản phẩm càng bị sai lệch so với sản phẩm ban
đầu.

2.3.4. Quy trình chẩn đoán
 Lấy mẫu
Mẫu huyết thanh, bệnh phẩ

trong 10-15 giây và giữ ở nhiệt độ phòng trong 3 phút.
- Li tâm 15 phút , 200000 vòng.
- Chuyển 500 μl pha lỏng vào 1 ống vô trùng chứa 1 μl glycogen (20 mg/ml) và
thêm 500 μl iso-propyl-alcohol (propan-2-ol). Trộn hỗn hợp trong vài giây.
- Giữ ở nhiệt độ phòng trong 10 phút, sau đó đem li tâm trong 10 phút, 20000 vòng.
- Loại bỏ phần lỏng nổi ở trên và thêm 1ml ethanol 70%. Trộn hỗn hợp trong vài
giây.
Chẩn đoán bệnh lở mồm long móng (FMD)

Nguyễn Thúy Kiều|
22

Oct.30
- Li tâm 10 phút, 20000 vòng.
- Cẩn thận di chuyển phần lỏng nổi phía trên ra và không làm mất kết tủa ở đáy của
ống.
- Để khô tự nhiên ở nhiệt độ phòng trong 2-3 phút.
- Tạo dịch huyền phù bằng cách thêm 20 μl nước cất không chứa enzyme phân giải
acid nucleic (Nuclease-free water).
- Giữ mẫu RNA đã được li trích trong đá nếu phản ứng RT được thực hiện hoặc trữ
ở -70°C.
Có thể dùng bộ
kit chuyên dùng hoặc các TRIzol để ly trích mẫu. RNA tổng số được
trích với thuốc thử TRIzol® từ những tế bào nhiễm virus nổi trên bề mặt (trong môi
trường BHK-21) theo sự hướng dẫn của nhà sản xuất. Miếng gạc họng, mũi được
thấm với 1ml PBS (phosphate-buffered saline) trước khi ly trích RNA. Mẫu huyết
thanh được li trích mà không cần bất kì thao tác bằng tay nào. Như một sự lựa chọn,
pha loãng 10 lần trong PBS của những chất đồng chấ
t từ những mô, cơ quan phân tích
được li trích.

A, C và SAT2. Trình tự của primer NK72 dùng để xác định virus FMD được dùng
cho tất cả các nghiên cứu về trình tự RNA trong phòng thí nghiệm.
Đoạn mồi trình tự nucleotide (5’-3’) – chiều dài sản phẩm (bp)
Positive sense (+)
O-1C
124
(ARS4) ACCAACCTCCTTGATGTGGCT 1301bp
O-1C
564
AATTACACATGGCAAGGCCGACGTG 861bp
O-1C
609
(Ovp3) TAGTGCTGGTAAAGACTTTGAGCT 816bp
A-1C
562
TACCAAATTACACACGGGAA 863-866bp
A-1C
612
TAGCGCCGGCAAAGACTTTGA 813-816bp
C-1C
536
TACAGGGATGGGTCTGTGTGTACC 877-883bp
C-1C
616
AAAGACTTTGAGCTCCGGCTACC 797-803bp
As1-1C
505
TACACTGCTTCTGACGTGGC 908-914bp
As1-1C
616

RNA polymerase 3D) và bao gồm vị trí giới hạn Ahd I (Ahd I restriction site) được
bảo tồn cao trong số các thể phân lập mà có thể sử dụng như một bước xác nhận
thêm trong chẩn đoán nhanh tiếp theo sự khuếch đại. Không có phản ứng chéo
được phát hiện với thể phân lập SVDV (swine vesicular disease Virus), VSV
(vesicular stomatitis virus) và BVDV (Bovine viral diarrhea virus).
Sử dụng primer A và B để khuếch đại m
ột đoạn 290bp của gene 3Dpol tương ứng với C-
terminus của protein. Kết quả của RT-PCR với những thể phân lập khác nhau từ tất cả 7
serotype của FMDV chỉ tạo ra 1 băng duy nhất với kích thước mong muốn được quan sát
tương ứng với những thể phân lập FMDV. Không có sản phẩm khuếch đại được quan sát
trong mẫu từ SVDV (swine vesicular disease virus), VSV (vesicular stomatitis Virus)
hoặc BVDV (Bovine viral diarrhea virus) chỉ ra rằng primer A và B không có phản ứng
chéo với genome của nh
ững virus có quan hệ lâm sàn này.
Primer A (5´-CACACGGCGTTCACCCA(A/T)CGC-3´)
Primer B (5´-GACAAAGGTTTTGTTCTTGGTC-3´)
Thông số của chu trình được ủ đầu tiên ở 48
0
C trong 30 phút và 95
0
C trong 10 phút, sau
đó 35 chu kỳ gồm có 94
0
C trong 30 giây, 60
0
C trong 45 giây và 72
0
C trong 45 giây, và
sau cùng ủ ở 72
0