Chẩn đoán virus cúm gia cầm bằng kỹ thuật nuôi cấy phôi trứng
- 1 -
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Seminar
: Chẩn đoán bệnh

CHẨN ĐOÁN VIRUS CÚM GIA CẦM BẰNG KỸ
THUẬT NUÔI CẤY PHÔI TRỨNG.

Giảng viên hướng dẫn: Sinh viên thực hiện:
PGS.TS. Nguyễn Ngọc Hải Hồ Bảo Quốc
06126117
DH06SH

Chẩn đoán virus cúm gia cầm bằng kỹ thuật nuôi cấy phôi trứng
- 3 -
B. Tổng quan
I. Thông tin chung về cúm gia cầm
1. Cúm gia cầm là gì ?
Cúm gia cầm, còn được gọi là cúm gà, là
bệnh truyền nhiễm trên động vật, chủ yếu là
loài chim, đôi khi cũng thấy trên lợn do vi-
rút cúm gia cầm týp A gây ra. Chủng vi-rút
cúm này có độc tính cao, đôi khi vượt qua
hàng rào bảo vệ lây nhiễm cho con người.
Dựa trên kháng nguyên, người ta chia cúm
gia cầm thành 16 phân nhóm H
(Haemagglutinin: H1-H16) và 9 phân nhóm N (Neuraminidase: N1-N9), trong đó
phân nhóm H5 và H7 có độc tính cao. Hiện nay chỉ có 2 vi-rút H
1
N
1
và H

giống nhau để ghi vào danh sách cho sự hiện diện của triệu chứng lâm sàn. Bố
n loại
thay đổi của tác nhân gây bệnh đã được thăm dò nguyên lí cơ bản ( Perkins and
Swayne 2003):
(i) Có lẽ (chết trong khoảng thời gian 24- 36 hours tiêm nhiễm, phần lơn trông
thấy trong loài galliforme) và dạng cấp tính của bệnh biểu lộ những thay đổi bệnh
tích không đặc thù: một sự hydropericardium rời rạc, sung huyết nhẹ trong ruột và
Chẩn đoán virus cúm gia cầm bằng kỹ thuật nuôi cấy phôi trứng
- 5 -
thỉnh thoảng có những đóm xuất huyết trên màng treo và màng ngoài của màng ói
được mô tả không nhất quán ( Mutinelly 2003a, Jones and Swayne 2004). Những
con gà đã bị tác động bởi dòng H
5
N
1
châu Á đôi lúc biểu hiện xuất huyết từng
mảng và tổng lượng chất nhầy đáng kể trong khí quản ( Elbers 2004). Tiết dịch rỉ
huyết thanh trong các khoang cơ thể và phù nề ở phổi có thể được trông thấy
không có hại gì. Những đóm chảy máu trong màng nhầy của dạ dày tuyến, nó
thường được mô tả trong phần chính của sách trong phần trước, chỉ có sự khác biệt
được gặp trong gia cầm đã nhi
ễm với dòng H
5
N
1
châu Á (Elbers 2004). Những tổn
thương mô học khác nhau gắn với kháng nguyên của virus có thể được phát hiện ở
các mô khác nhau ( Mo 1997). Virus được trông thấy đầu tiên trong màng trong
của những tế bào. Vào một giai đoạn sau đó những tế bào bị nhiễm virus được phát
hiện trong cơ tim, tuyến thượng thận và tuỵ tạng. Những tế bàp thần kinh cũng như

. Tuy nhiên, Werner và cộng sự ( công bố) đã có khả năng gây ra bệnh thần
kinh, sự thừa hưởng đến viêm não không làm mưng mủ (KlopBesch 2006), trong
5/16 chim bồ câu dùng một chủng H
5
N
1
HPAI phân lập cách đay không lâu.

2. Vi-rút cúm khuyếch tán và lây truyền như thế nào?
Loài thủy cầm là nguồn của tất cả các loại vi-rút cúm trong tự nhiên qua hàng thế kỷ,
kể cả týp H5 và H7 nhưng thường có độc tính thấp. Tuy nhiên chính các chủng độc
tính thấp H5 và H7 này khi truyền cho gia cầm, chúng biến đổi, đột biến gen để trở
thành chủng độc tính cao gây nên dịch.
Trong thời gian gần đây, người ta ghi nhận một số loài chim di trú có khả năng
khuyếch tán vi-rút H5N1
độc tính cao này.
3. Hiện nay dịch cúm gia cầm xảy ra như thế nào?
- Dịch cúm gia cầm bắt đầu xảy ra
vào giữa năm 2003 tại Đông Nam Á,
là dịch cúm gia cầm lớn nhất và
nghiêm trọng nhất trong lịch sử loài
người, làm chết hàng loạt các loài
chim. Tác nhân gây bệnh là vi-rút
H5N1 tồn tại dai dẳng, đã giết chết
hay khiến con người tiêu hủy ước tính
khoản 150 triệu con chim và gia cầm.
Chẩn đoán virus cúm gia cầm bằng kỹ thuật nuôi cấy phôi trứng
- 7 -
Hiện nay vi-rút này được xem là tác nhân gây dịch tại Indonesia, Việt Nam, một số
tỉnh Cambodia, Trung Quốc, Thái Lan và Cộng Hoà Nhân Dân Lào. Ngoài ra từ giữa

ệt Nam có 29 ca
và tử vong 20 (chiếm tỉ lệ 68,97 %).
- 2005: có 5 quốc gia có bệnh nhân nhiễm, tổng cộng 95 ca và tử vong 41 (chiếm tỉ lệ
43,16 %)
- Tính đến 23/08/2006: các trường hợp nhiễm vi-rút cúm H5N1 được xác định bằng
xét nghiệm được báo cáo tại 9 quốc gia với 96 ca bị nhiễm và tử vong 64 (chiếm tỉ lệ
66,67 %) trong đó không có Việt Nam.
Tóm lại, dịch cúm A (H5N1) ở người đã ghi nhận tại 10 quốc gia trên thế giới, với
232 trường hợ
p mắc bệnh và có tổng cộng 134 trường hợp tử vong (chiếm 57,9%).
- Riêng tại Việt Nam, từ ngày 14/11/2005 đến nay gần 9 tháng không ghi nhận trường
hợp mắc mới cúm A (H5N1) ở người. Tính từ trường hợp mắc cúm A(H5N1) đầu tiên
tại Việt Nam (26/12/2003) đến nay đã ghi nhận 93 trường hợp mắc tại 32 tỉnh/thành
phố, trong đó có 42 trường hợp tử vong. (xem chi tiết số liệu bảng 1)
(c) Con người bị nhiễm vi-rút cúm H5N1 trong trườ
ng hợp nào?
- Tiếp xúc trực tiếp với gia cầm bị bệnh, tiếp xúc với bề mặt hay vật dụng bị nhiễm
phân của gia cầm bị bệnh.
Chẩn đoán virus cúm gia cầm bằng kỹ thuật nuôi cấy phôi trứng
- 9 -
- Hầu hết các trường hợp xảy ra ở nông thôn, ngoại ô hay nơi có nuôi gia cầm.
- Phân và chất tiết của chim nhiễm bệnh thảy ra môi trường chứa nhiểu vi-rút cúm gây
bệnh xuống môi trường rất lớn.
- Nghiêm trọng hơn cả là người nuôi gia cầm trong vùng dịch tễ thấy gia cầm có triệu
chứng nhiễm bệnh là làm thịt, chế biến rồi dùng hay bán ra thị trường.
Nguồn tiếp xúc có nguy cơ cao là khi con người giết gia cầ
m, nhổ lông và chế biến
trước khi đem nấu chín.
5. Triệu chứng của bệnh cúm gia cầm ở người là gì?
Dựa trên các yếu tố và triệu chứng sau:

giảm (< 85 mmHg), có thể giảm nhanh (dưới 60 mmHg). Tỷ lệ PaO
2
/FiO
2
dưới 300 khi có tổn thương phổi cấp (ALI), dưới 200 khi có suy hô hấp cấp tiến triển
(ARDS).
- Chẩn đoán vi sinh vật:
o Làm RT-PCR để xác định vi rút cúm A/H5
o Phân lập vi khuẩn theo thường quy
II. Chẩn đoán bệnh trong phòng thí nghiệm
1. Sự thu thập mẫu xét nghiệm
Những mẫu xét nghiệm nên dược thu thập từ một vài xác xúc vật chết còn tươi và từ
những chim bị bệnh của một ßock. Theo lý tưởng, sự lấy mẫu
đầy đủ được nhìn lại
bằng phương pháp thống kê và sự chẩn đoán được làm trên một đế ßock. Khi thu thập
mẫu nghi nhiễm HPAI, tiêu chuẩn an toàn phải được khảo sát để tránh sự phơi bày
của những người sưu tập mẫu đến khả năng của HPAIV (Bridges 2002), Nguyên tắc
chỉ đạo được đề nghị bỡi CDC (CDC 2005).
Khi xét nghiệm virus, những bông thấm thu được từ lỗ huyệt và vùng hầ
u thông
thường cho phép một phòng thí nghiệm điều tra đầy đủ và hoàn chỉnh. Vật liệu thu
thập trên những mẫu bông nên được trộn vào trong 2-3ml mẫu đại diện của một môi
trường vận chuyển đẳng trương vô trùng bao gồm kháng sinh bổ sung và một protein
nguồn (e.g. 0,5%[ w/v] albumin huyết thanh bò, 10% huyết thanh bò hoặc một dung
dịch pha lấy ở giữa não).
Chẩn đoán virus cúm gia cầm bằng kỹ thuật nuôi cấy phôi trứng
- 11 -
Khi mổ xẻ để phân tích, mang ra ngoài dưới những điều kiện an toàn và tránh phát
tán mầm bệnh (xem trọng), những mẫu bệnh phẩm của não, khí quản/phổi, lách và cái
gì đó chứa trong ruột không được bảo quản được thu thập cho việc phân lập virus.

c phân lập bỡi sự tiêm miễn dịch của những miến gạt
ướt hoặc những mô đồng chất của trứng gà có phôi từ 9- 11 ngày tuổi, thường bằng
màng đệm túi niệu ( Woolcock 2001 ). Phụ thuộc dạng tác nhân, những phôi có thể
hoặc không thể chết với 5 ngày khảo sát , và thừơng đó là những thương tổn đặc thù
để được trông thấy trong phôi này hoặc màng túi niệu ( Mutinelli 2003b). Những quả
trứng được tiêm chủng vớ
i HPAIV bao gồm vật liệu thường chết trong vòng 48 giờ.
Sự xuất hiện của một tác nhân ngưng kết có thể được phát hiện trong tấm gạt của túi
niệu. Sự ngưng kết (HA) là một kỹ thuật vô tình yêu cầu ít nhất 10
6.0
mảnh nhỏ trong
mỗi ml. Nếu chỉ tập trung một lượng thấp virus được hiện diện trong chất để tiêm
chủng, tuỳ vào hai sự đi qua được đẩy mạnh trong những trứng được thụ tinh có thể
cần thiết cho một vài giống LPAIV, trong kiểu để sản xuất đủ virus để phát hiện bằng
HA. Trong trường hợp của HPAIV , một sự đi qua thứ hai sử dụng chất
để tiêm chủng
pha loãng có thể thuận lợi cho sự sản xuất tối ưu của sự ngưng kết.
Sự phân lập ngưng kết được mô tả kháng nguyên bằng thử nghiệm ức chế ngưng
kết (HI) sử dụng (mono-) kháng kháng huyết thanh loại phụ 16 H và cho việc kiểm
soát, kháng lại những những type khác nhau của virus trên gia cầm, những type này
cũng thể hiện hoạt động nhưng kết. Loài phụ NA có th
ể được được xác định sau đó
bởi thử nghiệm ức chế neuraminidase, mặc khác yêu cầu laọi phụ huyết thanh dặc biệt
( Aymard 2003 ). Trong trường hợp phân lập những dòng H
5
hoặc H
7
được chạm trán,
bảng liệt kê tác nhân trong động mạch gây bệnh (IVPI) cần thiết cho việc xác định để
Chẩn đoán virus cúm gia cầm bằng kỹ thuật nuôi cấy phôi trứng

thể khai báo ( Dybkear 2004, Spackman 2002). Khi sự đáp lại dương tính, một chẩn
đoán phân tử của loại tác nhân gây bệnh (LP chống lại HP) có thể thực hiện được sau
khi giải trình tự một đoạn của gen HA trải dài vùng phân tách bỡi enzyme proteoza
nội thích ứng. Hiện tại phân lập với những amino acid phức tạp có tính bazơ được
phân loại như HPAI. PCRs và những kỷ thu
ật DNA khác đang được thiết kế cho việc
phát hiện dòng H
5
N
1
châu Á (Collins 2002, Payoungporn 2004, Ng 2005). Loài phụ
Chẩn đoán virus cúm gia cầm bằng kỹ thuật nuôi cấy phôi trứng
- 14 -
Non-H
5
/ H
7
có thể được nhận diện bởi một RT-PCR hợp với tiêu chuẩn và phân tích
trình tự sau đó của đơn vị dưới HA-2 (Phípp 2004).Đó là những primer cho mỗi loài
phụ NA. Một đặc trưng đầy đủ có thể đạt được trong vòng 3 ngày, đặc biệt khi kỷ
thuật real time PCR được sử dụng (Perdue 2003, Lee and Suarez 2004). Tuy nhiên
những chip DNA được phát triển chúng có thể xúc tiến việc sắp xếp có hiệu quả hơn
các loại virus AI (Li 2001, Kessler 2005). Một s
ự chẩn đoán loại trừ thì có khả năng
thực hiện trong khoảng một ngày làm việc một mình.
Những bất lợi của những phương pháp chẩn đoán phân tử là giá thành để trả cho
việc mua những thiết bị và những thứ có thể dùng, nhưng nếu có sẵn, một vài mẫu có
thể được phân tích với ít người trong thời gian ngắn hơn cực kì so với phân lập virus
trong trứng. Tuy nhiên, không nên giữ bí m
ật rằng mỗi phản ứng PCR hoặc lai phân

IU/ml, streptomycin 2 mg/ml và fungizone 0,025mg/ml). Lấy miếng gạt ra ngoài
trước khi tim chủng. Sau đó, mẫu đối chứng dương tính trong nhóm đầu tiên tiêm
chủng 200 µl avian influenza virus HA 10
7,5
. Nhóm thứ hai tiêm chủng 200 µl PBS 1x
cho đối chứng âm. Nhóm cuối cùng tiêm chủng 200 µl thể vẩn bước đầu của nồng độ
virus. Thể vẩn từ 3 nhóm được ly tâm 3000 vòng trong 30 phút trong máy ly tâm lạnh
(4
o
C) để lắng những mảnh mô và tất cả vi khuẩn, chất lỏng sạch trong được thu thập,
sau đó chất lỏng được lọc bằng màng lọc (0,45µm). Khi nhóm đối chứng dương và âm
mỗi thứ lấy 3ml vật liệu tiêm chủng cho vào ống siêu li tâm, và nhóm cuối cùng cho
thể vẩn bước đầu của nồng độ virus chia vào 10 phần giống hệt nhau.
Cho dung dịch pha loãng tiếp nhau (10
-1
, 10
-2
, 10
-3
, 10
-4
, 10
-5
, 10
-6
, 10
-7
, 10
-8
, 10

-3
, 10
-4
, 10
-5
, 10
-6
, 10
-7
, 10
-8
, 10
-9
)
tiến trình giống như đề cập ở trên được sử dụng.
4.1.1.3. Vật liệu
• Những quả trứng gà đặc biệt sạch với mầm bệnh (SPF), 9-11 ngày tuổi
• Vật soi trứng
• Ethanol 70%
• Kim nhọn
• 22 Máy đo
• Ống tiêm 1ml, 1/
1
/
2

• Cái thoi dùng để tạo lỗ thủng trên quả trứng
• Keo hồ hoặc men trám
• Chất để tiêm chủng
• Khay để trứng

cái lỗ thủng trong những quả trứng bằng một giọt keo dáng. Ấp những quả
trứng ở nhiệt độ 38-39
o
C và độ ẩm 60%- 70% thời gian 5 ngày.
Chẩn đoán virus cúm gia cầm bằng kỹ thuật nuôi cấy phôi trứng
- 18 -
3. khảo sát những quả trứng đã được tiêm chủng
Trứng được tiêm chủng được soi đến 5 ngày. Ghi nhận những quả trứng bị chết
và ghi chép thời gian làm cho phôi chết. Những quả trứng chết trong ngày đầu
tiên được quan tâm như không đặc biệt và không cần để ý đến. Vứt bỏ những
phôi này. Những quả trứng chết trong những ngày sau đó thí có khả năng thừa
hưởng virus cúm gia cầm.( hình 2)

HPAI chết trong 1-2 ngày
LPAI chết sau 2-4 ngày
Thuận lợi:

- Nguyên tắc vàng: Phương pháp được
tiến cử bởi WHO, OIE
- Chính xác : Độ chính xác cao nhất
- Hữu ích : cho phép những nghiên cứu tiếp sau.
Bất lợi :
- Tốn thời gian : thường mất hơn 1 ngày
- Sự an toàn phòng thí nghiệm : BLS-3
- Chất lượng cao hơn của mẫu
- Những tác nhân khác nên được loại trừ
- Sự nhiễm chéo

Mẫu đối chứng dương và huyết thanh virus bệnh Newcastle.
Phương pháp
Dùng khay dùng một lần đáy chữ V. Phân phối 50µl dịch túi niệu từ mỗi mẫu
cho vào trong một đĩa vi chuẩn độ tố
t. Dùng một tip riêng biệt cho mỗi mẫu. Kể
cả chứng âm và chứng dương kiểm soát những mẫu dịch túi niệu trên một trong
những cái đĩa. Phân phối 50µl PBS vào trong mỗi đĩa. Thêm 25 µl 1% red
blood cell vào mỗi đĩa. Mở nhẹ những tấm của đĩa để trộn. Đặt một vỏ bọc lên
trên đĩa. Để cho đĩa đứng 45 phút tại phòng nhiệt. khảo sát và ghi chép kết quả.
6. Đọc kết quả
a)
Giải thích kết quả
HI âm tính: Một cái nút nhọn của những tế bào máu màu đỏ tại đáy của V-
Chẩn đoán virus cúm gia cầm bằng kỹ thuật nuôi cấy phôi trứng
- 20 -
botton well.
HI dương tính: một hình ảnh mờ mờ của những tế bào máu đỏ, không nút hoặc
một nút rất nhỏ của những tế bào máu đỏ tại đáy của V-botton well.
Đó sẽ thể hiện sự kháng ngưng kết hồng cầu và chứa đựng một đơn vị kháng
ngưng kết hồng cầu.
Nếu virus gây bệnh Newcastle (NDV) thì xét nghiệm ngưng kết hồng cầu là âm
tính. Sau đó, chứng thự
c bằng kiểu phụ với xét nghiệm nhanh trực tiếp bởi việc
sử dụng vet smart
®
test.
b) Xét nghiệm nhanh bằng sử dụng vet smart
®
test
Bộ kit xét nghiệm vet smart

loãng của nồng độ virus. Kết quả dương tính trong xét nghiệm nhanh dùng để
có khả năng thể hiện ghi nhận kết quả. ( Cho việc phân lập virus và phát hiện
virus bằng việc sử dụng những quả trứng gà có phôi)

Chẩn đoán virus cúm gia cầm bằng kỹ thuật nuôi cấy phôi trứng
- 22 -
C. Kết luận
- Chẩn đoán virus cúm gia cầm bằng kỷ thuật nuôi cấy phôi trứng cho kết quả chính
xác nhất
- Phương pháp chẩn đoán bằng kỷ thuật nuôi cấy phôi trứng tốn nhiều thời gian.
- Trong phương pháp chẩn đoán bằng kỷ thuật nuôi cấy phôi trứng việc đảm bảo
những quả trứng sạch là rất quan trọng.
- Để khắc phục những nhược đ
iểm của phương pháp chẩn đoán bằng kỹ thuật nuôi
cấy phôi trứng cần kết hợp với các phương pháp khác như : sinh học phân tử, huyết
thanh học,… Chẩn đoán virus cúm gia cầm bằng kỹ thuật nuôi cấy phôi trứng
- 23 -

ài liệu tham khảo
A. Đặt vấn đề 2
B. Tổng quan 2
I. Thông tin chung về cúm gia cầm 3
1.Cúm gia cầm là gì? 3
2. Vi-rút cúm khuyếch tán và lây truyền như thế nào? 7
3. Hiện nay dịch cúm gia cầm xảy ra như thế nào? 7
4. Cúm gia cầm ảnh hưởng đến sức khoẻ con người 8
(a) Sự lan rộng và tồn tại lâu dài của dịch cúm gia cầm gây ra 2 mối nguy cơ lớn đối với sức khoẻ
con người 8
(b) Các trường hợp cúm gia cầm H5N1 xảy ra trên con người 9
(c) Con người bị nhiễm vi-rút cúm H5N1 trong trường hợp nào 9
5. Triệu chứng của bệnh cúm gia cầm ở người là gì? 10
(a) Yếu tố dịch tễ 10
(b) Lâm sàng 10
(c) Cận lâm sàng 11
II. Chẩn đoán bệnh trong phòng thí nghiệm 11
1. Sự thu thập mẫu xét nghiệm 11
2. Sự vận chuyển mẫu xét nghiệm 12
3. Phát hiện trực tiếp sự tiêm nhiễm của AIV 13
4. Phân lập và nhận dạng virus 16
4.1. Phân lập virus băng tiêm miễn dịch trong nhữ
ng quả trứng gà có phôi 16
4.1.1. Quá trình vật liệu cho chẩn đoán virus 16
4.1.1.1. Miếng gạt lấy mẫu ở lỗ huyệt 16