1
 TIỂU LUẬN
2


I. ĐẶT VẤN ĐỀ
Trong nhiều năm gần đây, ngành chăn nuôi nước ta ngày càng chiếm vai trò quan trọng trong

đặc điểm:
- Gây chứng ăn không ngon, khó thở, sốt, sảy thai và chậm lên giống trở lại cùng với sự tăng
số heo chết lúc sinh, tăng số heo con chết trước khi cai sữa.
- Gây nên hô hấp khó khăn, chậm tăng trưởng và tăng tỷ lệ heo cai sữa chết (trên những đàn
mắc bệnh mãn tính).

1.1. Lịch sử căn bệnh:
Năm 1987, bệnh được phát hiện lần đầu tiên ở Mỹ với tên gọi “bệnh thần bí trên heo” (Mystery
Swine Disease - MSD).
3

Tháng 11 năm 1990, ổ dịch PRRS đầu tiên xảy ra ở Đức và lan tràn nhanh chóng sang các quốc
gia khác ở Châu Âu. Mùa đông năm 1990- 1991, lần lượt các quốc gia Châu Âu như Hà Lan, Bỉ,
Pháp và Tây Ban Nha đã báo cáo về hội chứng này với nhiều tên gọi khác nhau: “Bệnh tai xanh”
(Blue-eared Pig Disease), “Hội chứng hô hấp và sảy thai trên heo” ( Porcine Epidemic Abortion
and Respiratory Syndrome -PEARS), hay “Hội chứng hô hấp và vô sinh” (Swine Infertility and
Respiratory Disease - SIRD). Năm 1991, lần đầu tiên Wenvoort và cộng sự đã phân lập được căn
bệnh ở Viện thú y trung ương Lelytad – Hà Lan đã phân lập được căn bệnh và đặt tên cho loại
virus này là “Lelystad”. Năm 1992, Collins và cộng sự ở Mỹ cũng báo cáo về việc phân lập được
virus gây bệnh và sử dụng tên gọi VR-2332 để chỉ các chủng phân lập ở Bắc Mỹ. Cũng trong
năm 1992, hội nghị quốc tế và tổ chức dịch tễ thế giới (OIE) đã nhất trí đặt tên cho bệnh này là
“Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp trên heo” (porcine reproductive and respiratory
syndrome- PRRS) (Võ Thị Đan Thanh, 2006) Ở Việt Nam, bệnh được phát hiện vào năm 1997
trên đàn lợn nhập từ Mỹ (10/51 con có huyết thanh dương tính). Các nghiên cứu về bệnh trên
những trại giống lớn tại các tỉnh phía Nam cho thấy tỷ lệ lợn có huyết thanh dương tính với bệnh
rất khác nhau, từ 1,3% cho tới 68,29%. Ở các nước khác, tỷ lệ đàn trong vùng bệnh có huyết
thanh dương tính rất cao, như ở Anh là 6-75%, Mỹ là 36%,… (Phòng Dịch tễ-Cục Thú y)
1.2. Đặc điểm hình thái cấu trúc:
1.2.1. Phân loại
Virus PRRS thuộc:

• Protein GP5 có trọng lượng phân tử khoảng 25 kDA, là nguyên nhân gây ra hiện tượng
apoptosis và đóng vai trò quan trọng trong việc nhận diện thụ thể trên tế bào đích
(Nathalie và cs, 2003).
Về mặt di truyền, khi phân tích gene của các dòng virus PRRS gây bệnh khác nhau, người ta xác
định được 2 dòng virus riêng biệt: dòng Châu Âu (Lelystad) và dòng Châu Mỹ (VR-2332). Hai
dòng virus này không những khác biệt về đặc tính gây bệnh mà khác nhau về mức độ nhất định
về kiểu gene. Qua phân tích gene và theo dõi sự thay đổi trình tự Nu của các dòng PRRS, người
ta đã xác định rằng ở dòng Châu Mỹ, các ORFs 7 và 6 có tính ổn định rất cao, chúng gần như
không thay đổi trong suốt quá trình tiến hoá của dòng virus này, tuy nhiên, sự khác biệt giữa
dòng virus Châu Âu và Châu Mỹ ở 2 khung đọc mở này là rất rõ, chẳng hạn sự tương đồng về
trình tự axit amin của ORFs 7 giữa 2 dòng virus này chỉ vào khoảng 57-59% và của ORFs 6 là
70-81%. Trong khi đó, khung đọc mở ORFs 5 lại biến đổi nhiều giữa các chủng trong cùng 1
dòng Châu Mỹ và chỉ tương đồng với dòng Châu Âu khoảng 51-59%. Sự tương đồng về trình tự
axit amin quy định do các khung đọc mở ORFs 2, 3 và 4 giữa các dòng Châu Mỹ và Châu Âu
tương ứng chỉ ở từ 63,58% và 68% (Nguyễn Ngọc Hải, 2007).
5

Nghiên cứu virus ở mức độ phân tử còn cho phép xác định được khả năng sản xuất và sử dụng
virus nhược độc để làm văcxin. Người ta đã ghi nhận nhiều trường hợp hội chứng PRRS trở nên
trầm trọng hơn sau khi đàn heo được tiêm vắcxin virus PRRS nhược độc vì cấu trúc gene của
virus nhược độc thay thế glycine bằng arginine ở vị trí 151 của ORFs 5 sẽ hoàn nguyên rất nhanh
bộ gene của chúng so với bộ gene của virus nguyên thuỷ ngay sau khi xâm nhập vào cơ thể vật
chủ, và như thế độc lực của chúng cũng được phục hồi (Nguyễn Ngọc Hải, 2007).

1.3. Dịch tễ học:

1.3.1. Cơ chế sinh bệnh:

6



1.3.3. Sức đề kháng của virus

Virus PRRS tồn tại được trong thời gian dài hơn 4 tháng ở -700C đến -200C nhưng khoảng 90%
khả năng gây nhiễm của virus bị mất trong vòng 1 tuần ở 40C. khả năng hồi phục của virus đã
được báo cáo kéo dài đến 20 phút ở 560C, 24 giờ ở 370C và 6 ngày ở 210C. Virus bền vững ở
pH từ 6,5 -7,5 nhưng chết nhanh khi pH < 6 hay pH >7,65 (Benfield và cs, 1999). Như vậy, virus
PRRS không bền với nhiệt độ và pH. Ngoài ra, virus dễ bị diệt bởi chất sát trùng và tia cực tím
7

(dẫn liệu Trần Thanh Phong, 1996). Các chất tẩy uế có tác dụng làm giảm khả năng lây nhiễm
của virus và các chất tan dầu mỡ như chloroform và eter đặc biệt hữu hiệu trong việc phá vỡ cấu
trúc vỏ ngoài của virus và làm ngừng sự tái sản (Trần Đức Minh).
1.3.4. Triệu chứng lâm sàng: Lợn nái giai đoạn đẻ và nuôi con: Biếng ăn, lười uống nước, mất sữa và viêm vú, đẻ sớm
khoảng 2-3 ngày, da biến màu, lờ đờ hoặc hôn mê, thai gỗ (10-15% thai chết trong 3-4 tuần cuối
của thai kỳ), lợn con chết ngay sau khi sinh (30%), lợn con yếu, tai chuyển màu xanh. Tỷ lệ chết
ở đàn con có thể tới 70% ở tuần thứ 3-4 sau khi xuất hiện triệu chứng. Rối loạn sinh sản có thể
kéo dài 4-8 tháng tr
ước khi trở lại bình thường.

Lợn đực giống: Bỏ ăn, sốt, đờ đẫn hoặc hôn mê, giảm hưng phấn hoặc mất tính dục, lượng tinh
dịch ít, chất lượng tinh kém và cho lợn con sinh ra nhỏ.

Lợn con theo mẹ: Thể trạng gầy yếu, nhanh chóng rơi vào trạng thái tụt đường huyết do không
bú được, mắt có dử màu nâu, trên da có vết phồng rộp, tiêu chảy nhiều, giảm số lợn con sống sót,
tăng nguy cơ mắc các bệnh về hô hấp, chân choãi ra, đi run rẩy



Tỷ lệ heo con chết trong tuần đầu tiên vượt quá 25%.
Tuy nhiên, để xác định đúng căn bệnh cần thực hiện các phương pháp chẩn đoán phi lâm sàng
khác (dẫn liệu của Võ Thị Đan Thanh, 2006).

1.4.2 Chẩn đoán phi lâm sàng:

Dựa vào các triệu chứng lâm sàng và bệnh tích mô tả ở phần trên để chẩn đoán. Trong phòng thí
nghiệm, có thể dùng phản ứng Immunoperoxidase một lớp (IPMA) để phát hiện kháng thể 1-2
tuần sau khi nhiễm; phản
ứng kháng thể huỳnh quang gián tiếp (IFA) kiểm tra kháng thể IgM
trong 5-28 ngày sau khi nhiễm và kiểm tra kháng thể IgG trong 7-14 ngày sau khi nhiễm; phản
ứng ELISA phát hiện kháng thể trong vòng 3 tuần sau khi tiếp xúc, tuy nhiên chỉ xác định được
tỷ lệ nhiễm.Một phương pháp khác là chẩn đoán bằng nuôi cấy tế bào động vật sau đó dùng RT-
PCR để xác định( có thể sử dụng phương pháp nhuộm miễn dịch, hóa miễn dịch), mặc dù việc
nuôi cấy phân lập virus trên môi trường tế bào khó, tuy nhiên xác định sự hiện diện của virus từ
mẫu huyết thanh dương tính và các mẫu lâm sàng là rất cần thiết để làm cơ sở cho công tác
phòng bệnh và các nghiên cứu sau này

1.4.2.1. Phương pháp phát hiện kháng thể

1.4.2.1.1. Phản ứng IPMA (Immuno peroxidase Monolayer Assay)

Đây là phản ứng đầu tiên được sử dụng để phát hiện kháng thể kháng virus PRRS được gọi là kỹ
thuật miễn dịch peroxidase một lớp. Kỹ thuật này có thể thực hiện trên các dòng tế bào PAM,
CL2621, MARC-145. Tế bào sau khi nuôi cấy 24 giờ sẽ được gây nhiễm với PRRSV và được ủ
ở 370C trong 24 giờ. Sau đó tế bào được gây nhiễm sẽ được cố định và tác dụng với huyết thanh
mẫu, ủ khoảng 1 giờ ở 370C và được cho tác dụng tiếp tục với kháng kháng thể heo cộng hợp
HRPO (horseradish peroxidase). Nếu mẫu huyết thanh có chứa kháng thể kháng virus thì 30-
50% tế bào sẽ có màu đỏ khi cho lớp tế bào tác dụng với dung dị

1.4.2.1.4. Phản ứng ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay)

Xét nghiệm ELISA (xét nghiệm miễn dịch hấp phụ
gắn kết enzyme) có độ nhạy và độ đặc hiệu
cao và thực hiện đơn giản hơn so với IFA và IPMA, có thể phát hiện kháng thể trong vòng 3 tuần
sau khi nhiễm bệnh. Tuy nhiên hạn chế lớn nhất của phương pháp này là dễ cho kết quả dương
tính giả. Tỷ số S/P (sample/position)≥0,4 thì kết quả được ghi nhận là dương tính. Các phản ứng
IFA, SN, ELISA được sử dụng nhiều trong các phòng thí nghiệm ở miền Nam nước Mỹ
(Nguyễn Ngọc Hải, 2007).

1.4.2.2. Các phương pháp phát hiện kháng nguyên

Phương pháp FA (florescent antibody staining-kháng thể huỳnh quang) và IHC
(immunohistochemistry staining-hoá mô miễn dịch) có thể được sử dụng để phát hiện kháng
nguyên virus trong mẫu mô.
Phương pháp FA có thể thực hiện trực tiếp trên các mẫu đông lạnh. Phương pháp này cho kết
quả nhanh và chi phí thấp, tuy nhiên lại có độ nhạy và độ đặc hiệu không cao. để đảm bảo kết
quả chẩn đoán, mẫu cần được lấy và làm lạnh nhanh.
Phương pháp IHC cũng được thực hiện trên mẫu mô cắt lát, tuy nhiên phương pháp này có thể
thực hiện với các mẫu mô đã được cố định bằng formol. Điều này là khá quan trọng vì rất thuận
lợi trong việc bảo quản mẫu bệnh phẩm. IHC có độ nhạy cao hơn so với FA nhưng mất nhiều
thời gian và tốn chi phí hơn (Nguyễn Ngọc Hải, 2007).

1.4.2.3 Phát hiệ
n gen của virus PRRS

Kỹ thuật PCR được phát triển để phát hiện RNA của virus PRRS trong các mẫu bệnh phẩm. Kỹ
thuật này không những có độ đặc hiệu và độ nhạy cao mà thời gian cần thiết thực hiện xét
nghiệm cũng ngắn hơn so với phương pháp nuôi cấy tế bào vì thế nó được sử dụng khá rộng rãi
trong chẩn đoán phát hiện virus. Nhiều dạng khác nhau của PCR được sử dụng, hầu hết chúng

Stevenson (1999) thì không phải tất cả virus PRRS đều phát triển ở cả hai loại tế bào này mà
PAM nhạy cảm với virus hơn so với CL2621, đặc biệt khi mẫu được dùng là huyết thanh. Còn
Han-Kook Chung và cs (2002) cho rằng PRRSV chủng Châu Mỹ phát triển tốt hơn trên MARC-
145, ngược lại PRRSV chủng Châu Âu lại phát triển nhanh hơn trên PAM.
Trong Tiểu luận Chẩn đoán PRRSV bằng kỹ thuật nuôi cấy tế báo này, chúng ta sẽ tìm hiểu
kỹ về phương pháp chẩn đoán PRRSV bằng cách phân lập trên môi trường tế bào MARC-145 và
xác định bằng RT-PCR.

2. Chẩn đoán PRRSV bằng cách phân lập trên môi trường tế bào MARC-145 và xác
định bằng RT-PCR 2.1. Tổng quan về nuôi cấy tế bào
Nuôi cấy tế bào là kỹ thuật duy trì và phát triển các t
ế bào ở ngoài cơ thể sống nhưng vẫn thực
hiện đầy đủ các chức năng biến dưỡng và chức năng chuyên biệt của tế bào. Quá trình nuôi cấy
tế bào cho phép mỗi tế bào đóng vai trò như những tế bào độc lập, nó có thể phân chia nhờ quá
trình nguyên phân và quần thể tế bào tiếp tục phát triển cho đến khi bị giới hạn bởi bề mặt nuôi
cấy hay sự cạn kiệ
t dinh dưỡng. Kỹ thuật nuôi cấy tế bào được tiến hành lần đầu tiên vào năm
1907 bởi Harrison. Ngày nay kỹ thuật này đã được ứng dụng rộng rãi trong y học và thú y học để
nghiên cứu tác động của các chất lên tế bào hay nghiên cứu virus để phân lập, giám định, chuẩn
độ virus, xác định tính chất huyết thanh học, quan sát hình thái siêu cấu trúc của virus và đặc biệt
là sản xuất vaccine. Quá trình nuôi cấy thường gồm những tế bào thuộc cùng mộ
t loại.
11

2.1.1. Thành phần dinh dưỡng của môi trường nuôi cấy tế bào

Môi trường nuôi cấy tế bào phức tạp và giàu chất dinh dưỡng để tạo điều kiện tốt nhất cho sự


2.1.2. Điều kiện nuôi cấy

Hầu hết tế bào trong môi trường nuôi cấy sinh trưởng tốt ở nhiệt độ 370C và pH 7,4. Nếu ở nhiệt
độ thấp hơn một chút so với 370C thì tốc độ sinh trưởng sẽ giảm xuống nhưng tế bào không bị
phá hủy. Tuy nhiên nhiệt độ cao hơn, từ 39- 400C sẽ phá huỷ tế bào. Do vậy, việc đảm bảo rằng
nhiệt độ không tăng trong tủ cấy là rất quan trọng (Butler, 2004).

2.1.3. Sự tạp nhiễm và cách hạn chế

Nguyên nhân chính của sự thất bại trong nuôi cấy tế bào là sự tạp nhiễm. S
ự tạp nhiễm thường
do tiệt trùng dụng cụ không đạt yêu cầu và thường bắt nguồn từ sự tiếp xúc của con người như là
từ bàn tay, hơi thở, tóc. Môi trường và thiết bị ngày nay được cung cấp sẵn nhằm hạn chế tới
12

mức tối đa những nguy cơ tạp nhiễm này. Nguy cơ này cũng có thể được giảm bớt hơn nữa bởi
sự quan tâm cẩn thận tới từng chi tiết khi tiến hành nuôi cấy. Nhằm giảm bớt các nguồn tạp
nhiễm, cần chú ý các điểm sau:
• Rửa tay với xà phòng diệt khuẩn trước và sau quá trình có liên quan đến cấy tế bào. Có
thể dùng găng tay nhựa.
• Hạn chế những con đường tới phòng thí nghiệm khi thí nghiệm đang tiến hành.
• Làm sạch bề mặt làm việc trước và sau mỗi quá trình nuôi cấy.
• Dùng không gian tiệt trùng (ví dụ tủ cấy tiệt trùng) cho tất cả các thao tác.
• Dùng ống nghiệm nuôi cấy bằng plastic được tiệt trùng và chỉ dùng một lần.
• Mua môi trường và huyết thanh từ nhà cung cấp đáng tin cậy để đảm bảo rằng sự tạp
nhiễm không phát sinh từ nguồn này (Butler, 2004).

2.2. Tổng quan về phương pháp RT-PCR


• Tủ cấy; tủ ấm CO2.
• Kính hiển vi soi ngược.
• Máy ly tâm.Ống ly tâm vô trùng.
• Lọ nuôi cấy tế bào 25cm2.
13

• Pipette.

2.3.1.2. Vật liệu dùng cho nuôi cấy tế bào MARC- 145

- Dòng tế bào và gốc virus chuẩn do AAHL (Australian Animal Health Laboratory) cung cấp.
- Môi trường phát triển: trong 100ml môi trường gồm:
• EMEM (Egle Minimun Essential Medium): 86,25 ml
• Huyết thanh thai bò (FBS): 8ml.
• Glutamine 2,92%: 1ml.
• Na Pyruvate 100mM: 1ml.
• LAH (Lactalbumin hydrolysate) 25%: 2ml.
• Sodium Bicarbonate 7%: 1ml.
• Kháng sinh (trong 1ml dung dịch có 40000UI Penicillin, 40000μg Streptomycin): 0,25ml.
• Kháng nấm (trong 1ml có 500μg Amphotericin B): 0,5ml
• Môi trường duy trì: giống môi trường phát triển nhưng chỉ dùng 2% huyết thanh thai bò.
• PBSA (Phosphate buffer saline solution A).
• Trypsin X.
• Thuốc nhuộm Trypan Blue 0,22%.

2.3.1.3. Thiết bị và dụng cụ dùng cho phản ứng PCR

• Tủ cấy vô trùng.
• Máy ly tâm (Mikro Z2K/ Sigma 3K30C).
• Tủ -700C (Sanyo Ultra Low).


2.3.1.5. Vật liệu và hoá chất cho điện di sản phẩm RT-PCR

• Agarose (Biorad).
• TBE 0.5X (Tris HCl, acid boric, Na2EDTA, nước cất hai lần khử ion đã hấp khử trùng).
• Loading dye (Bromophenol blue, sucrose, TE).
• Ladder 100bp.
• Ethidium bromide.

2.3.2. Phương pháp lấy mẫu

• Huyết thanh: cố định heo, lấy máu khoảng 4- 5ml tại tĩnh mạch cổ (heo cai sữa), tĩnh
mạch tai (heo nái). Sau đó cho vào bình đá vận chuyển về phòng thí nghiệm và chắt lấy
huyết thanh vào eppendorf vô trùng.
• Hạch phổi, phổi (chỉ lấy ở heo chết sau khi sinh và heo sau cai sữa): lấy mẫu hạch phổi,
phổi cho vào bao nylon sạch, buộc chặt và cho vào bình đá vận chuyển về phòng thí
nghiệm.
Mẫu sau khi lấy được chuyển về phòng thí nghiệm và được xử lý tiến hành phân lập virus ngay.
Nếu mẫu chưa được phân lập ngay sẽ đem bảo quản ở -70
0
C

2.3.3.Phương pháp nuôi cấy tế bào MARC- 145

2.3.3.1.Hồi phục tế bào :
Tế bào được trữ dưới dạng đông lạnh ở trong nitơ lỏng, khi muốn sử dụng thì phải hồi phục lại tế
bào. Các bước hồi phục tế bào:
• Lấy lọ đựng tế bào từ bình nitơ lỏng ra, ngâm vào nước ấm 370C, chờ đến khi nước đá
tan hết thì lấy ra.
• Dùng pipette chuyể

• Đưa hỗn hợp thuốc nhuộm và tế bào này lên buồng đếm bằng cách chạm đầu hút có
chứa hỗn hợp vào chỗ tiếp giáp giữa buồng đếm và lamella.
• Chỉ đếm những tế bào còn sống (màu vàng nhạt, có điểm sáng ở giữa), không đếm
những tế bào chết (bắt màu xanh). Vùng đếm là 4 ô vuông lớn (ký hiệu L).  Cách tính kết quả :

Trong đó: C: số tế bào trong 1ml. n: số tế bào trong 4 ô vuông. d: nồng độ pha loãng.
16

• Cho lượng tế bào cần cấy chuyển vào trong lọ nuôi cấy mới đã có 8-10 ml môi trường
phát triển.
• Đưa lọ tế bào vào ủ ấm 370C có bổ sung 5%CO2.
• Theo dõi cứ 3 giờ một lần sự phát triển của tế bào đầy bề mặt nuôi cấy lọ 25cm2 với
những lượng tế bào 7.105 và 106.
Kết quả được xử lý bằng phần mềm staTGraphics Ver. 7,0.
2.3.4.Phương pháp phân lập virus

Virus PRRS được phân lập theo sơ đồ 3.1. 2.3.4.1 Phương pháp xử lý mẫu để phân lập virus
Mẫu hạch phổi, phổi được nghiền trong dung dịch đệm phosphat PBS (cứ 1gam bệnh phẩm
nghiền trong 5ml PBS). Sau đó, ly tâm huyễn dịch 5000vòng/phút trong 15 phút. Hút phần nước
trong cho vào eppendorf vô trùng và bảo quản trong tủ -700C. Huyết thanh và mẫu sau khi được
xử lý sẽ lọc qua lưới lọc 0,2μm trước khi đưa vào môi trường tế bào.

2.3.4.2. Phương pháp gây nhiễm tế bào lần thứ nhất vớ
i các mẫu đã xử lý

nhiễm.
18
Để thực hiện phản ứng phiên mã ngược và khuếch đại đoạn cDNA sau phiên mã ngược với độ
nhạy và độ đặc hiệu cao, chúng tôi thực hiện kỹ thuật RT-PCR một bước nhằm hạn chế sự lây
nhiễm.
2.4. Kết quả:
2.4.1. Kết quả sau 2 lần gây nhiễm:

19
20

Như vậy, sau 2 lần gây nhiễm trên môi trường tế bào MARC-145, có 3 mẫu có biểu hiện bệnh
tích tế bào, chiếm tỷ lệ 27,27% (3/11) là 2 mẫu hạch phổi và 1 mẫu phổi.
2.4.2. Kết quả RT-PCR:

III. KẾT LUẬN
21


Việc gây bệnh tích tế bào và kết quả RT-PCR dương tính dã xác định sự hiện diện của virus
trong mẫu xét nghiệm. Điều này cũng cho thấy môi trường tế bào MARC-145 là môi trường

9. Benfield D.A., Collins J.E., Dee S.A., Halbur P.G., Joo H.S., Lager K.M., Mengelling
W.L., Murtaugh M.P., Rossow K.D., Stevenson G.W., and Zimmerman J.J., 1999.
Porcine reproductive and respiratory syndrome. In disease of swine, 8th edition.
Ed.Straw B.E., D’Alleire S.D., Mengelling W.L., Taylor D.J Iowa State University
Press, Ames- Iowa, USA. p.201- 220

10. Tài liệu Internet
http://www.aahc.com.au/ausvetplan/index.htm.
http://www.agraroldal.hu

http://www.animal-health-online.de