Chẩn đoán virus cúm gia cầm bằng ELISA
1

Bộ giáo dục và đào tạo
Trường đại học Nông Lâm TP. HCM

Bài tiểu luận
CHẨN ĐOÁN CÚM GIA CẦM BẰNG KỸ THUẬT ELISA

Giáo viên hướng dẫn: Nguyễn Ngọc Hải
Sinh viên thực hiện: Trần Thị Quế Chẩn đoán virus cúm gia cầm bằng ELISA
2
MỤC LỤC
Chương 1: ĐẶT VẤN ĐỀ 3
Chương 2 TỔNG QUAN
2.1 BỆNH CÚM GIA CẦM 4

cầm khắp toàn cầu.
Lịch sử nhân loại đã từng chứng kiến nhiều đại dịch cúm cướp đi sinh mạng của
hàng trăm triệu người trên thế giới mà điển hình là vào các năm 1889, 1918, 1957,
1968 cùng với những thiệt hại về kinh tế.
Do mức độ thiệt hại đáng kể, nhi
ều biện pháp phòng chống bệnh cúm gia cầm đã
và đang được áp dụng nhằm hạn chế sự lây lan và phát tán của mầm bệnh. Vì vậy
việc phát hiện, chẩn đoán virus cúm gia cầm một cách có hiệu quả, nhanh, chính
xác, rẻ tiền là một vấn đề bức thiết.
“ Chẩn đoán virus cúm gia cầm bằng kỹ thuật ELISA” là một trong những kỹ
thuật đáp ứng được những yêu cầu thực ti
ễn trên và được áp dụng rộng rãi.
Chẩn đoán virus cúm gia cầm bằng ELISA
4


Chẩn đoán virus cúm gia cầm bằng ELISA
5
Virus cúm gà có tên khoa học là avian influenza (AI) thuộc nhóm virus cúm A
của
họ Orthomyxociridae
. Đây là những retrovirus, mang vật liệu di truyền là những
đoạn phân tử RNA
, sợi đối mã (sợi âm tính), có dạng đa hình thái, kích thước 80-
120nm.
Cấu trúc bộ gene của virus gồm 8 phân đoạn, mã hóa cho các protein: PB2, PB1,
PA, HA, NP, NA, M, NS.
Các phân nhóm (subtype) của virus cúm gia cầm được xác định dựa trên cấu trúc
của các protein bề mặt HA và NA. Đến nay người ta xác định có tất cả 16 subtype
HA và 9 subtype NA được phân lập trên các loài dã cầm và gia cầm khắp nơi trên
thế giới qua nhiều giai đoạn khác nhau. Sự phối hợp của 16 loại HA và 9 loại NA
tạo nên sự đa dạng và phong phú của virus cúm.
(1) Haemagglutinin (HA)
Là một protein bề mặt, có khả năng bám trên các thụ thể t
ế bào chứa sialic
acid, giúp virus nhân lên và gây bệnh.
Có khả năng gây ngưng kết hồng cầu.
Là kháng nguyên bề mặt, kích thích cơ thể vật chủ sinh kháng thể bảo hộ HI.
Thường xuyên biến đổi tạo tính đa dạng của kháng nguyên.

Chẩn đoán virus cúm gia cầm bằng ELISA
6


nhận ra được
(2) Các biến đổi lớn có tính chuy
ển đổi (antigenic shift) xảy ra khi virus cúm
nhiễm từ loài này sang loài khác hoặc do trộn lẫn, tái tổ hợp gene của virus cúm ở
các loài khác nhau (ví dụ giữa virus cúm A ở người và virus cúm A ở gia cầm).
Khi loại biến đổi này xảy ra sẽ cho ra đời một phân type virus mới mà tác hại của
nó khó thể lường trước được. Đây cũng là một trong những yếu tố để một đại dịch
bùng phát.
2) Các biến đổi lớn có tính chuyể
n đổi (antigenic shift) xảy ra khi virus cúm nhiễm
từ loài này sang loài khác hoặc do trộn lẫn, tái tổ hợp gene của virus cúm ở các
loài khác nhau (ví dụ giữa virus cúm A ở người và virus cúm A ở gia cầm). Khi
loại biến đổi này xảy ra sẽ cho ra đời một phân type virus mới mà tác hại của nó
khó thể lường trước được. Đây cũng là một trong những yếu tố để một đại dịch
bùng phát.
Chẩn đoán virus cúm gia cầm bằng ELISA
8 2.1.2.2 Quá trình tái sản của virus:
Quá trình sao chép và tái bản RNA xảy ra trong nhân của tế bào ký chủ.
(1) Giai đoạn bám của virus trên bề mặt tế bào
Nhờ HA của virus gắn lên trên các thụ thể của tế bào ký chủ có chứa acid
sialic.
(2) Giai đoạn xâm nhập vào tế bào
Nhờ hoạt tính sialidase, NA phân cắt sialic acid ra khỏi HA và màng tế bào,
giúp virus có thể xâm nhập vào bên trong tế bào tạo nên thể nội bào
(endosome).
(3) Giai đoạn phá vỡ màng
PH acid trong nguyên sinh chất tế bào chủ

PA,M2), di chuyển đến màng nguyên sinh chất, nơi các protein HA. NA và M2
đang tập kết dđể đóng gói hình thành h
ạt virus.
(7) Giai đoạn đâm chồi và phóng thích ra khỏi tế bào
NA đóng vai trò quan trọng trong việc phóng thích virus ra khỏi màng tế bào.
Protein làm gia tăng sự gắn kết của màng nguyên sinh chất và sự đâm chồi của
hạt virus.

2.1.2.3 Sức đề kháng đối với tác nhân vật lý và hóa học
Chẩn đoán virus cúm gia cầm bằng ELISA
10
Các virus cúm gia cầm có sức đề kháng yếu, không tồn tại lâu ngoài môi
trường. Các yếu tố vật lý như sức nóng, pH quá thấp hoặc quá cao, điều kiện
khô hạn có thể bất hoạt virus cúm gia cầm. Dễ bị vô hoạt bởi các dung môi hữu
cơ và chất tẩy rửa.
2.1.2.4 Độc lực của virus:
Dựa trên các chỉ số của tỷ lệ gây bệnh , tỷ lệ
chết trên đàn gà gây bệnh…
Độc lực của virus cúm gia cầm quyết định bởi 2 yếu tố chính: protein màng
glycosylated HA (Hemagglutinin) và NA (neuraminidase).
Thường được chia thành 3 nhóm độc lực: độc lực cao (HPAI – High
Pathogenic Avian Influenza), độc lực trung bình (MPAI – Medium Pathogenic
Avian Influenza) và độc lực thấp ( LPAI – Low Pathogenic Avian Influenza).

2.1.3 BỆNH DO VIRUS CÚM GIA CẦM GÂY RA
2.1.3.1 Đặc điểm dịch tễ
a. Loài cảm nhiễm
Chim hoang là vật tàng trữ mầm bệnh quan trọng nhất nhưng rất hiếm khi xuất
hi
ện bệnh lâm sàng do khả năng đề kháng tự nhiên

Kháng thể HI có thể ngăn cản hoàn toàn sự bài thải của virus ra bên ngoài,
trong khi kháng thể Ni chỉ làm giảm sự bài thải của virus.
Miễn dịch cuả các protein bên trong có thể rút ngắn giai đọan nhân lên và bài
thải ra ngoài của virus.
2.1.3.5 Chẩn đoán:
a.Chẩn đoán lâm sàng: dựa vào dịch tễ, triệu chứng và bệnh tích của bệnh
b.Chẩn đoán phòng thí nghi
ệm: hỗ trợ và kết luận nguyên nhân gây ra bệnh
chính xác
Phát hiện virus:
Phát hiện protein hoặc RNA của virus trực tiếp từ mẫu mô: Miễn dịch mô gắn
kết enzyme sử dụng kháng thể đơn dòng, miễn dịch huỳnh quang (FA) trên
mẫu mô phết kính, ELISA, RT-PCR và real-time PCR…
Phân lập virus trên trứng gà có phôi 9-11 ngày tuổi bằng cách tiêm xoang niệu
mô, trên tế bào thường trực (cell line) như MDCK và Vero hoặc tế bào sơ cấp
như CEF và thận gà.
Chẩn đoán virus cúm gia cầm bằng ELISA
12
Phát hiện kháng thể: Sử dụng các phản ứng huyết thanh học như ELISA,
AGID, HI, miễn dịch huỳnh quang.
2.1.3.6 Phòng chống bệnh cúm gia cầm
Ngăn ngừa và kiểm soát bệnh
Giám sát bệnh chặt chẽ để phát hiện sớm và báo cáo dịch.
Tăng cường an toàn sinh học tại các trại chăn nuôi gia cầm.
Kiểm soát vận chuyển gia cầm và sản phẩm.
Thay đổi phương thứ
c chăn nuôi.
Tiêu hủy nhanh gia cầm bị bệnh và có nguy cơ bị bệnh.
Chủng ngừa: tiêm vaccine


Kỹ thuật ELISA được chia thành 2 loại: ELISA trực tiế
p nhằm tìm kiếm kháng
nguyên (ELISA capture hoặc ELISA sandwich) và ELISA gián tiếp nhằm tìm
kiếm kháng thể (indirect hoặc ELISA cạnh tranh = competitive ELISA).
Sự liên kết giữa kháng nguyên_kháng thể được phát hiện bằng cách thêm cơ chất
của một phản ứng tạo màu được xúc tác bởi enzyme. Enzyme thường dùng để
đánh dấu là : peroxidase, beta_galactoxidase, alkaline phosphatase,
Mẫu dương tính là có sự hiện diện của kháng nguyên hay kháng thể trong mẫu
đượcc giữ lại trên khay xét nghiệm và cho phản ứng tạo màu khi thêm cơ
chất.
Khả năng ứng dụng của ELISA
Ưu điểm quan trọng nhất của phương pháp ELISA là độ nhạy cao, có thể phát hiện
được phức hợp nhỏ kháng nguyên- kháng thể, cho phép phát hiện sớm tác nhân
gây bệnh ở giai đoạn sớm khi mầm bệnh mới xâm nhiễm (cho phép phát hiện
lượng kháng nguyên virus nhỏ hơn 1ng/ml).
Chẩn đoán virus cúm gia cầm bằng ELISA
14

Dùng để phát hiện nhiều loại protein, nhận diện virus, vi khuẩn, và một số hợp
chất phân tử lượng nhỏ trong nhiều mẫu sinh học khác nhau.
ELISA thuận tiên cho chẩn đoán xét nghiệm một số lượng mẫu lớn.
2. Chẩn đoán virus cúm gia cầm bằng kỹ thuật ELISA:
Lấy mẫu và bảo quản mẫu:
Dùng tăm bông lấy mẫu dịch khí quản hoặc mẫu phân ở lỗ huyệt gia cầm sống
hoặc chết. Sau đó tăm bong được cho vào môi trường vận chuyển vô trùng chứa
kháng sinh để ức chế vi khuẩn phát triển. Một số loại bệnh phẩm khác: mô (gan,
lách, thận, tụy, não…) đặt vào túi plastic vô trùng. Để kiểm tra virus trong các cơ
quan thu thập và bảo quản riêng các mô đường ruột và đường hô hấp.
Nếu thực hiện xét nghiệm mẫu trong vòng 48 giờ sau khi thu thập thì bả
o quản ở

Nếu kháng nguyên không hiện diện trong mẫu thì không có sự hiện màu.
Các bước tiến hành:
(1) Người ta gắn kháng thể đã biết trước lên giá thể.
(2) Cho dung dịch mẫu chẩn đoán và đối chứng được cho vào các giếng.
(3) Ủ trong điều kiện nhiệt độ và thời gian nhất định (tùy theo bộ kit của nhà sản
xuất)
(4) Rửa.
(5) Bổ sung kháng thể đặc hiệu với kháng nguyên cần xác định có gắn enzyme
đánh dấu.
(6) Ủ trong điều kiện nhiệt độ và thời gian nhất định (tùy theo bộ kit của nhà sản
xuất)
(7) Rửa mẫu.
(8)Cho cơ chất tương ứng với enzyme.
(9) Dung dịch dừng phản ứng.
(10) Đọc và so màu.
Chẩn đoán virus cúm gia cầm bằng ELISA
16
Direct ELISA: nhanh, tránh được phản ứng chéo của kháng thể thứ cấp với các
thành phần trong mẫu. Tuy nhiên direct ELISA đòi hỏi sự đánh dấu tất cả các
kháng thể được sử dụng=> tốn thời gian, chi phí. Thêm vào đó một số kháng thể
có thể không phù hợp với việc đánh dấu trực tiếp. Phương pháp trực tiếp thường
thiếu sự khuyế
ch đại tín tín hiệu thêm vào mà có thể đạt được với việc sử dụng
kháng thể thứ cấp.
b. Phát hiện kháng thể: có thể phát hiện kháng thể trong vòng 1 tuần sau khi
nhiễm
Bản chất kháng nguyên của cúm gia cầm phụ thuộc chính vào hai yếu tố H và N vì

(8) Bổ sung cơ chất tương ứng với enzyme.
(9) Dung dịch dừng phản ứng.
(10) Đo OD và thực hiện phản ứng so màu.

Chẩn đoán virus cúm gia cầm bằng ELISA
18

Indirect ELISA to detect specific antibodies

Indirect ELISA: kháng thể thứ cấp (được đánh dấu) được sử dụng rộng rãi với
nhiều kháng thể sơ cấp (vd: all mouse monoclonal antibodies – tất cả kháng thể
đơn dòng ở chuột). Việc sử dụng kháng thể thứ cấp gia tăng độ nhạy của phản ứng
(do khuyếch đại tín hiệu thêm vào).
Một số ví dụ về bộ kit phát hiệ
n kháng thể
1. Kit ELISA phát hiện kháng thể kháng virus cúm typ A (Avian influenza virus
antibody test kit, Idexx laboratories, USA).
Thành phần
9 AI coated plate: đĩa 96 giếng đã gắn kháng nguyên của virus cúm.
9 AI positive control: huyết thanh dương tính với virus cúm chuẩn .
9 Negative control: huyết thanh âm tính với virus cúm chuẩn.
9 (goat) Anti-chicken/Turkey: HRPO conjugate: cộng hợp gắn horseradish-
peroxidase từ dê chống lại kháng thể gà hoặc gà tây.
9 Sample diluent buffer (SDB): dung môi để pha loãng mẫu huyết thanh xét
nghiệm.
9 TMP (Tetremethylbenzidine) subtrate.
Chẩn đoán virus cúm gia cầm bằng ELISA
19
9 Stop solution: dung dịch dừng phản ứng.
Chuẩn bị

(8) Thêm 100 microlit dung dịch dừng phản ứng vào các lỗ giếng.
(9) Đo OD và đánh giá kết quả sau 15 phút.
2. Kit ELISA phát hiện kháng thể kháng virus cúm –kháng HA ( Influenza A,
Avian, H5, Hemagglutinin Antibody (HA) BioAssay™ ELISA Kit (Bird Flu).
ELISA cạnh tranh (competitive ELISA).
ELISA phát hiện kháng thể kháng HA trong mẫu huyết thanh .
Nguyên tắc: Dựa trên pha rắn. Nếu kháng nguyên kháng HA hiện diện trong
mẫu sẽ cạnh tranh với kháng thể đơn dòng kháng HA cộng hợp với
horseradish peroxidease (anti-HA “mAb” HRP) với kháng nguyên đã chuẩn bị
sẵn gắn với bề mặt rắn trong giếng. Nếu không có kháng thể kháng HA hiện
diện trong mẫu, anti-HA “mAb” HRP sẽ gắn với HA có trong giếng và những
HPR-conjugate không gắn sẽ bị loại bỏ trong quá trình rửa. Cơ chất tạo màu
Chromogen A and B solutions được cho vào giếng, Chromogens không màu bị
thủy phân (hydrolyzed) bởi HPR-conjugate (đã gắn vào giếng) tạo thành sản
phẩm có màu xanh ( a blue colored product). Màu xanh này chuyển thành màu
vàng khi dừng phản ứng với sulfuric acid. Không màu hoặc biểu hiện màu ít
(no or low corlor) => ch
ứng tỏ sự hiện diện của kháng thể kháng HA trong
mẫu.
Protocol
Tiền xử lý mẫu với buffer ly giải virus (pre-treat the samples with virus lysis
buffer)
Cho mẫu vào, 100 ul.
Ủ, 60 phút.
Rửa 5 lần.
Cho HRP-conjugate, 100 ul.
Ủ, 30 phút
Rửa 5 lần.
Cơ chất tạo màu 50ul A + 50 ul B.
Chẩn đoán virus cúm gia cầm bằng ELISA


Việc chẩn đoán virus cúm gia cầm bằng phương pháp ELISA giúp cho việc phát
hiện và phân loại virus nhanh chóng và dễ dàng hơn. Đây là một phương pháp khá
đơn giản, đặc hiệu, nhạy và nhanh. Đồng thời ta có thể xét nghiệm được một số
lượng mẫu lớn. Phát hiện cúm gia cầm bằng ELISA giúp tầm soát nguồn bệnh tốt
hơn. Do đó phương pháp này được ứng dụng rỗng rãi trong thực tế nhất là khi đại
d
ịch cúm bùng phát trên diện rộng.
Chẩn đoán virus cúm gia cầm bằng ELISA
23
TÀI LIỆU THAM KHẢO

Chẩn đoán virus cúm gia cầm bằng ELISA
24