Tạp chí NN và PTNT số 117-2007, trang 59-64

SỬ DỤNG PHƯƠNG PHÁP SINH HỌC PHÂN TỬ ĐỂ PHÁT HIỆN VÀ XÁC
ĐỊNH NẤM GÂY BỆNH MỤC GỖ BẠCH ĐÀN Eucalyptus obliqua L. Her.

Trần Thanh Trăng
Viện Khoa học Lâm nghiệp Viêt Nam
TÓM TẮT
Phương pháp phát hiện và xác định nấm gây bệnh mục gỗ bạch đàn Eucalyptus obliqua được dựa vào phân tử DNA
tách chiết từ 26 mẫu gỗ bạch đàn bị mục thu thập tại Tasmania (Australia). Ri-bô-xôm DNA được khuyếch đại (PCR)
bởi cặp mồi điền hình ITS1-F/ITS4 chỉ phát hiện được 18 mẫu có DNA. Trên bản gel cho thấy có 11 mẫu chỉ có 1 dải
DNA và 7 mẫu cho nhiều dải DNA. Vùng sao chép nội bộ (ITS) của 11 mẫu được xác định trình tự chuỗi trực tiếp và
7 mẫu có sản phẩm PCR thể hiện có nhiều loài nấm cùng xuất hiện được tách dòng. Sản phẩm tách dòng được phân
tích bằng phương pháp PCR-RFLP, đại diện của mỗi nhóm PCR-RFLP được xác định trình tự chuỗi. Để xác định các
loài nấm mục gỗ trong mẫu thí nghiệm, các chuỗi ITS được so sánh hoặc phân tích sự tiến hóa với các cơ sở dữ liệu
trên ngân hàng gen (Genbank) và các cơ sở dữ liệu cá nhân. Kết quả phân tích DNA từ các mẫu gỗ mục đã xác định
được 15 loài nấm thuộc lớp Basidiomycetes, 17 loài nấm thuộc lớp Ascomycetes và 1 loài thuộc lớp Zygomycetes.
Trong tổng số 33 loài nấm phát hiện được trong mẫu gỗ, chỉ có 13 loài thuộc lớp nấm Basidiomycetes và 7 loài thuộc
lớp nấm Ascomycetes là những loài gây mục gỗ thực sự, còn 13 loài khác là các loài thứ sinh.
Từ khóa: Bạch đàn Eucalyptus obliqua, DNA, nấm gây mục gỗ, PCR-RFLP.

I. ĐẶT VẤN ĐỀ
Bạch đàn là loài cây phổ biến tại bang Tasmania (Australia), chiếm khoảng 883.000 ha trong tổng
số 3,17 triệu ha rừng tự nhiên tại bang này, bao gồm loài E. obliqua. Gỗ bạch đàn được sử dụng để
đóng đồ gia dụng, trong công nghiệp được dùng làm nguyên liệu giấy. Tuy nhiên, một số loài nấm
gây mục gỗ tấn công cây bạch đàn sống, một số khác lại gây hại trên gỗ gia dụng, gỗ thành phẩm.
Nấm mục gỗ gây cho gỗ bị biến chất, làm mất màu, mất trọng lượng và độ bền. Xác định được
nấm bệnh và các đặc điểm sinh thái của chúng sẽ mang lại các lợi ích quản lý. Có rất nhiều loài
nấm không thể nuôi cấy trong điều kiện phòng thí nghiệm (Johannesson và Stenlid 1999) bởi vậy
một số kết quả phân lập nấm bệnh không phản ánh chính xác loài nấm gây bệnh trong mô thực vật.
Bên cạnh đó, hầu hết các loài nấm thuộc lớp Basidiomycetes, loài nấm gây mục gỗ chủ yếu, có thể

lượng nhỏ phoi gỗ đến vạch 200 µl trên ống eppendorf 1.5 ml. Tán nhỏ các vật liệu trên trong ống
eppendorf bằng chày kết hợp với nitơ lỏng. Thêm vào đó khoảng 300-500 µl chất tách chiết DNA
(Reader & Broda 1985). Ống eppendorf được ủ trong bể nước ở nhiệt độ 65
o
C trong 60 phút. Sau
đó được ly tâm với tốc độ 14,000 vòng/phút trong 15 phút. Khoảng 200 µl dịch nổi được chuyển
sang ống eppendorf mới trong có chứa 800 µl NaI 100% (trạng thái lạnh) và 7 µl glassmilk. Hỗn
hợp được làm lạnh và lắc đều trong vòng 15 phút để DNA gắn vào glassmilk, sau đó được ly tâm
với tốc độ 14,000 vòng/phút trong 10 giây. Phần kết tủa được rửa sạch bằng dung dịch đệm và cồn.
Sau đó hỗn hợp được ly tâm, tách phần kết tủa và làm khô. Phần kết tủa được hòa tan trong 25 µl
dung dịch TE (10 mM Tris HCl pH8, 1 mM EDTA), hỗn hợp được ủ trong bể nước ở 45
o
C trong
vòng 5 phút. Ống eppendorf được ly tâm ở 14,000 vòng/phút trong 2 phút, phần hỗn hợp chứa
DNA được chuyển sang ống eppendorf mới, bảo quản ở 4
o
C.
Khuyếch đại PCR: Vùng ITS 1 và 2 được khuyếch đại từ DNA vừa thu trên bằng cặp mồi được
thiết kế điển hình cho nấm ITS1-F (Gardes và Bruns 1993) và ITS4 (White et al. 1990). Trong 50
µl phản ứng PCR, 10 µl DNA được sử dụng như bản mẫu. Mỗi phản ứng PCR gồm có 1x
polymerase chất đệm (Fisher Biotec), 2 mM MgCl
2
, 0.2 mM dNTPs, 0.25 µM cho mỗi loại mồi,
và 0.08 U TTH
+
polymerase (Fisher Biotec) và 0.2 mg/ml chất BSA (Bovine Serum Albumin,
Fisher Biotec). Thông số khuyếch đại PCR như sau: bước khởi đầu tách đôi sợi DNA ở 95
o
C trong
3 phút. Sau đó là 35 chu kỳ: tách sợi DNA ở 94

BIO Laboratories, Inc. UltraClean
TM
PCR Lean-up. Phản ứng xác định trình tự chuỗi: sử dụng bộ
kít Quick Start với một số thay đổi như sau: Mỗi phản ứng xác định trình tự chuỗi DNA gồm 10
µl, trong đó sử dụng 3-5 µl DNA mẫu cùng với 3.2 pmol mồi (ITS1-F) và 2 µl DTCS Quick Start
Master Mix.
Kết tủa bằng cồn: 0.25 µl của 20 mg/ml glycogen, 2 µl của 3 M Sodium Acetate và 2 µl của 100
mM Na
2
-EDTA được bổ xung vào mỗi phản ứng. Trình tự chuỗi DNA được xác định trên hệ
thống phân tích gen và được sửa trên phần mềm Chromas Lite, phiên bản 2.0, 2004. Các chuỗi
DNA được sắp xếp trên ClustalW (Thompson et al. 1994). Sau đó các chuỗi DNA này được so
sánh sự giống nhau với các dữ liệu trên ngân hàng gen, sử dụng phần mềm BLAST (Altschul et al.
1997) trên BioManager (ANGIS 2005) và với các dữ liệu cá nhân, sử dụng phần mềm FASTA,
phiên bản 3.4 (Pearson và Lipman 1998). Ngoài ra phân tích sự tiến hóa cũng được thực hiện. Các
chuỗi DNA mẫu và DNA tham khảo được sắp xếp với nhau, biểu đồ Dendrogram được tạo trên
phần mềm ClustalW và DNA ml trên phần mềm Phylip (ANGIS 2005; Felsenstein 1998) sau đó
được xem trên phần mềm TreeView, phiên bản 1.6.6.
III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
1. Phát hiện nấm mục gỗ
Trong tổng số 26 mẫu gỗ làm thí nghiệm chỉ phát hiện được 18 mẫu gỗ có phân tử DNA của sợi
nấm bằng phương pháp PCR với cặp mồi ITS1-F/ITS4. Mười một (11) mẫu gỗ chỉ có một dải
DNA trên mỗi mẫu (Hình 1a, các làn từ 6 đến 16) được xác định trình tự chuỗi trực tiếp, còn 7
mẫu có 2 dải DNA (Hình 1a, các làn 2, 3, 4, 5, 17, 18, 19) được tách dòng và phân tích biến động
chuỗi bằng phương pháp PCR-RFLP (ví dụ Hình 1b) trước khi xác định trình tự chuỗi.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19

S45 Trực tiếp AJ415551 Fomitopsis rosea Basidiomycetes
S46 Trực tiếp AY112936 Hymenoscyphus ericae
1
Ascomycetes
S52 Trực tiếp AF508346 Bridgeoporus nobilissimus Basidiomycetes
S53 Trực tiếp AJ006682 Diplomitoporus lindbladii
2
Basidiomycetes
S60 Trực tiếp AJ006682 Diplomitoporus lindbladii

Basidiomycetes
S66 Trực tiếp AF486129 Sporendocladia foliicola Ascomycetes
S69 Trực tiếp AF486129 Sporendocladia foliicola Ascomycetes
S70 Trực tiếp AJ415551 Fomitopsis rosea Basidiomycetes
S71 Trực tiếp AY220542 Ganoderma sp.3 Basidiomycetes
AJ006677 Skeletocutis amorpha Basidiomycetes
AJ 416069 Oligoporus placentus Basidiomycetes
S21 Tách dòng
AY805585 Cadophora malorum Ascomycetes
AY491667 Serpula lacrymans Basidiomycetes
AY618685 Sporothrix sp. Ascomycetes
AY786143 Togninia minima
3

Ascomycetes
AY781213 Zygomycete sp. Zygomycetes
AF062787 Oidiodendron pilicola Ascomycetes
S23 Tách dòng
AY606305 Phialocephala dimorphospora Ascomycetes
AF486120 Mycelium radicis-atrovirens Ascomycetes

3
Togninia minima: têm mới = Phaeoacremonium aleophilum;
4
Ophiostoma grandicarpum: tên mới =
Ceratocystis grandicarpa;
5
Phlebia uda: tên mới = Mycoacia uda.
Kết quả bảng 1 cho thấy có 15 loài nấm thuộc lớp Basidiomycetes, các loài nấm thuộc lớp này
được coi là các loài nấm chính gây bệnh mục gỗ (Rayner and Boddy 1988) và 17 loài được xác
định thuộc lớp nấm Ascomycetes và 1 loài thuộc lớp Zygomycetes. Schwarze và cộng sự (2000)

4
cho rằng các loài nấm thuộc lớp Ascomycetes này cũng có khả năng gây ra bệnh mục gỗ, thường
gây bệnh mục gỗ mềm (Soft rot). Tuy nhiên không phải tất cả các loài nấm được xác định từ các
mẫu gỗ mục trong bảng 1 đều là nguyên nhân chính dẫn đến gỗ bị mục. Đối với nhóm nấm thuộc
lớp Basidiomycetes như là Tricholoma, đối với nhóm nấm thuộc lớp Ascomycetes, ví dụ
Penicillium spinulosum, Aspergillus restrictus và thậm trí một loài thuộc lớp Zygomycetes hoàn
toàn không có khả năng gây ra bệnh mục gỗ. Sự hiện diện của chúng hoàn toàn là thứ sinh, tức là
gỗ sau khi đã bị các loài khác gây mục chúng mới xuất hiện. Sử dụng các chuyên khảo của
Jasalavich và đồng tác giả (2000), Allmér và đồng tác giả (2006), David và đồng tác giả (2005) để
loại bỏ các loài nấm thứ sinh, gây mốc và danh mục các loài nấm gây mục gỗ bạch E. obliqua
được trình bày ở bảng 2.
Bảng 2. Các loại nấm gây mục chính
Loài nấm Lớp nấm Kiểu mục
Bridgeoporus nobilissimus Basidiomycetes Mục nâu
Crinipellis perniciosa
Basidiomycetes Mục nâu
Diplomitoporus lindbladii
1
Basidiomycetes Mục nâu

Hymenoscyphus ericae: tên mới = Rhizoscyphus ericae
Kết quả từ bảng 2 cho thấy có 8 loài thuộc lớp Basidiomycetes gây ra bệnh mục gỗ màu nâu
(Brown rot). Nấm gây bệnh mục gỗ màu nâu phân hủy cellulose và hemicellulose rất nhanh ở giai
đoạn mới bắt đầu thâm nhập vào gỗ. Thành tế bào bị các-bon hóa, dẫn đến gỗ bị mất độ bền.
Chúng thường gây bệnh trên cây sống, gỗ đã được chặt hạ. Bên cạnh đó, có 5 loài cũng thuộc lớp
Basidiomycetes gây ra bệnh mục gỗ màu trắng (White rot). Nấm gây bệnh mục gỗ màu trắng chủ
yếu phân hủy lignin, nhưng cũng có khả năng phân hủy tất cả các thành phần của thành tế bào.
Chúng thường làm cho gỗ mất màu và có màu trắng, làm cho gỗ mất độ bền, mất trọng lượng và tỷ
trọng. So với nấm gây bệnh mục gỗ màu nâu, nấm gây bệnh mục gỗ màu trắng phân hủy gỗ chậm
hơn. Và có 7 loài thuộc lớp nấm Ascomycetes gây ra bệnh mục gỗ mềm. Nấm gây bệnh mục gỗ
mềm phân hủy thành tế bào ngoài của gỗ theo chiều dọc và thường xuất hiện ở giai đoạn cuối của
quá trình mục gỗ. Trong số các loài nấm ở bảng trên (Bảng 2), có 5 loài nấm gây mục gỗ
(Diplomitoporus lindbladii, Fomitopsis rosea, Oligoporus placentus, Postia balsamea,
Ganoderma sp.) cũng được Hopkins (2006) tìm thấy trên các mẫu gỗ bạch đàn E. obliqua thu tại
bang Tasmania.

5
Xác định nấm mục gỗ bằng phân tích biểu đồ Dendrogram dựa trên phân tích chuỗi ITS của phân
tử DNA được thể hiện ở hình 2.

0.1
AY569451 Ganoderma weberianum
LF159 Ganoderma sp.
AY569450 G. cupreum
AJ627585 G. mastoporum
AY593864
AY593865
AY220542 Ganoderma sp. GB-1
AY220540 Ganoderma sp. BJ-8
16453C3


Hình 2. Biểu đồ Dendrogram phân tích chuỗi ITS của nấm gây mục gỗ, mẫu S71.
Nhóm ngoài
Ganoderma weberianum và các chuỗi ITS tham khảo được tải từ Genbank và thư viện tham khảo cá nhân của trường
Đại học Tasmania (các chuỗi ITS từ thể quả Ganoderma: E7587, 16722A, 167311B, 16732C, 16453C1, 16453C2,
16453C3, 16452D1 và sợi nấm gây mục gỗ: LF157, LF159, LF400, LF569). Thanh bar: biến động chuỗi tương đương
với 10%.
Qua hình 2 cho thấy chuỗi ITS của loài nấm gây mục gỗ của mẫu S71 nằm cùng nhóm với các
chuỗi ITS của các mẫu thể quả Ganoderma và các mẫu Ganoderma khác tải từ Genbank với độ
biến động chuỗi dưới 1%. Như vậy việc định loại tên nấm gây mục gỗ bằng kỹ thuật DNA rất
chính xác và không phụ thuộc vào sự sinh ra bào tử của các loài nấm, một đặc điểm rất cần thiết để
định loại bằng phương pháp hình thái học.

Applification to the identification of mycorrhizae and rusts. Molecular Ecology 2: 113-118.
7. Glen, M., Tommerup, I. C., Bougher, N. L. and O’Brien, P. A. (2002) Are Sebacinaceae
common and widespread ectomycorrhizal associates of Eucalyptus species in Australian forests?
Mycorrhiza 12: 243-247.
8. Hopkins, A. J. M. (2006) The taxonomy and ecology of wood decay fungi in Eucalyptus obliqua
trees and logs in the wet sclerophyll forests of southern Tasmania. PhD thesis, University of
Tasmania, Australia.
9. Jasalavich, C. A., Ostrofsky, A. and Jellison, J. (2000) Detection and identification of decay
fungi in spruce wood by Restriction Fragment Length Polymorphism analysis of amplified genes
encoding rRNA. Applied and Environmental Microbiology 66: 4725-4734.
10. Johannesson, H. and Stenlid, J. (1999) Molecular identification of wood inhabiting fungi in an
unmanaged Picea abies forest in Sweden. Forest Ecology and Management 115: 203-211.
11. Mitchell, J. I., Roberts, P. J., and Moss, S. T. (1995) Sequence or structure? A short review on
the application of nucleic acid sequence information to fungal taxonomy. The Mycologist 9: 67-75.
12. Mohammed, C. L. and Yuan, Z. Q. (2002) Report for Project No. C1990677: Ecologically
Sustainable Forest Management: Fungal and Invertebrate Biodiversity. ARC SPIRT Project 1999-
2002, Hobart, Australia.

7
13. Nobles, M. K. (1948) Studies in forest pathology VI. Identification of cultures of wood-rooting
fungi. Canadian Journal of Forest Research 26: 281-431.
14. Pearson, W. R. and Lipman, D. J. (1998) Improved Tools for Biological Sequence Analysis.
Proceedings of the National Academy of Science, USA 85: 2444-2448.
15. Rayner, A. D. M. and Boddy, L. (1988) Fungal Decomposition of Wood: Its Biology and
Ecology. John Wiley and Sons Ltd., Chichester, UK.
16. Raeder, U. and Broda, P. (1985) Rapid preparation of DNA from filamentous fungi. Letters in
Applied Microbiology 1: 17-20.
17. Schwarze, F. W. M. R., Engels, J. and Mattheck, C. (2000) Fungal Strategies of Wood Decay
in Trees. Springer, Berlin, Germany.
18. Thompson, J. D., Higgins, D. G and Gibson, T. J. (1994) CLUSTALW: improving the