i
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
 TRẦN THỊ MINH TÚ
XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH DANH VI KHUẨN
GÂY BỆNH LOÉT TRÊN CÂY BƢỞI BẰNG
PHƢƠNG PHÁP SINH HỌC PHÂN TỬ

LUẬN VĂN KỸ SƢ
CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC
CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giáo viên hƣớng dẫn Sinh viên thực hiện
TS. LÊ ĐÌNH ĐÔN TRẦN THỊ MINH TÚ
KHÓA: 2002 - 2006

Thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 9/2006
iii
MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING
NONG LAM UNIVERSITY, HCMC
FACULTY OF BIOTECHNOLOGY
 AMPLIFICATION MOLECULAR ENGINEERING
TO IDENTY CITRUS CANKER BACTERIA

Xin chân thành cảm ơn:
- Ban Giám Hiệu trƣờng Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh đã tạo mọi điều
kiện cho tôi trong suốt thời gian học tập tại trƣờng.
- Các thầy cô trong Bộ môn Công nghệ sinh học cùng các thầy cô trực tiếp giảng
dạy luôn tận tình hƣớng dẫn, giảng dạy, giúp đỡ và động viên tôi trong suốt bốn
năm qua.
- TS. Lê Đình Đôn đã tận tình hƣớng dẫn và động viên tôi trong thời gian thực
hiện đề tài tốt nghiệp.
- TS. Bùi Minh Trí và anh Nguyễn Văn Lẫm và các anh chị phụ trách phòng Hóa
Sinh thuộc Trung tâm Phân Tích Thí Nghiệm Đại học Nông Lâm Tp. HCM đã
tận tình giúp đỡ tôi trong thời gian làm đề tài.
- Toàn thể lớp CNSH 28 đã hỗ trợ, giúp đỡ và động viên tôi trong suốt thời gian
làm đề tài.
Thành kính ghi ơn ông bà, cha mẹ đã nuôi nấng, dạy bảo con đƣợc nhƣ ngày hôm nay,
cùng những ngƣời thân trong gia đình luôn tạo mọi điều kiện và động viên con trong
suốt quá trình học tập tại trƣờng.
Chân thành cảm ơn.
Tp. HCM, tháng 08 năm 2006

Sinh viên
Trần Thị Minh Tú iv
TÓM TẮT
TRẦN THỊ MINH TÚ, Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh. Tháng 8/2006. “XÂY
DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH DANH VI KHUẨN GÂY BỆNH LOÉT TRÊN CÂY

v
Kết quả đạt đƣợc:
1. Phân lập đƣợc 4 dòng vi khuẩn, tất cả là gram âm, trên môi trƣờng YDC phân
thành 2 nhóm vàng sữa và vàng chanh..
2. Tất cả 4 dòng phân lập đƣợc đều tạo vết thƣơng sau khi chủng bệnh nhân tạo,
triệu chứng bệnh có khác nhau.
3. Kết quả sắc ký có 1 dòng (XBDL1) có sắc tố phát sáng rõ sau khi chụp UV.
4. Thực hiện thành công phản ứng PCR trên 16s-23s rDNA ITS với cặp primer
Xan1330 và Xan332 cho sản phẩm 1,1 kb.
5. Không thực hiện đƣợc phản ứng PCR trên vùng hrpW gen với cặp mồi chuyên
biệt XACR và XACF.


2.3. Sơ lƣợc vùng rDNA-ITS ................................................................................ 8 vii
2.3.1. Giới thiệu vùng rDNA ................................................................................. 8
2.3.2. Vùng rDNA-ITS trên Xanthomonas ssp. ................................................... 9
2.4. Sơ lƣợc về hrpW gen ..................................................................................... 9
2.5. Những cứu về bệnh loét cam quýt trên Thế Giới và Việt Nam ................... 11
2.5.1. Trên Thế Giới ............................................................................................. 11
2.5.2. Tại Việt Nam ............................................................................................. 12
2.6. Quy trình định danh Xanthomona sp. . .......................................................... 12
2.6.1. Quy trình định danh Xanthomonas sp. theo phƣơng pháp
nuôi cấy, thực hiện phản ứng sinh hóa ................................................................. 12
2.6.2 Quy trình định danh theo phƣơng pháp phân tử .......................................... 13
2.7 Phƣơng pháp PCR .......................................................................................... 13
Phần 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP ....................................................... 16
3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu ................................................................. 16
3.2. Nội dung nghiên cứu ..................................................................................... 16
3.3 Vật liệu nghiên cứu ......................................................................................... 16
3.4. Phƣơng pháp tiến hành .................................................................................. 17
3.4.1 Phân lập, nuôi cấy trên 2 môi trƣờng PGA và YDC, xác định
Gram âm hay Gram dƣơng các dòng vi khuẩn gây bệnh loét trên cây bƣởi ........ 17
3.4.2. Chủng bệnh nhân tạo .................................................................................. 18
3.4.3. Thực hiện sắc ký bản mỏng định danh vi khuẩn ........................................ 18
3.4.4. Phƣơng pháp ly trích DNA tổng số của vi khuẩn ...................................... 20
3.4.5. Khuếch đại vùng 16s-23s rDNA ITS và vùng hrpW gen .......................... 21
3.4.5.1 Khuếch đại vùng 16s-23s rDNA ITS dòng vi khuẩn phân lập
ix
DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình Trang
Hình 2.1. Triệu chứng bệnh loét trên lá bƣởi Da Láng .................................................. 6
Hình 2.2. Triệu chứng bệnh loét trên trái bƣởi Da Láng ............................................... 6
Hình 2.3. Triệu chứng bệnh loét trên cành bƣởi Da Láng ............................................. 7
Hình 2.4. Cấu trúc vùng 16s-23s rDNA ITS trên Xanthomonas ssp ........................... 10
Hình 2.5. Sơ đồ hình cây thể hiện mối tƣơng quan giữa các dòng Xanthomonas ssp.
dựa trên vùng 16s-23s rDNA ITS ................................................................................ 10
Hình 3.1(a) Tấm sắc ký vừa nhỏ dung dịch sắc tố ..................................................... 19
Hình 3.1(b). Tấm sắc ký ngâm methanol trong bình hút ẩm ...................................... 19
Hình 4.1. Sự phát triển của các dòng vi khuẩn phân lập đƣợc trên môi trƣờng PGA
nhiệt độ 28
o
C ................................................................................................................ 25
Hình 4.2. Sự phát triển của các dòng vi khuẩn phân lập đƣợc trên môi trƣờng YDC ở
nhiệt độ 28
o

và bƣởi Đƣờng Cam ..................................................................................................... 25
Bảng 4.3. Khả năng nhiễm bệnh của 4 dòng
XBDL1, XBDL2, XBDL3, XBĐC3 ........................................................................... 27

xi
DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ITS : Internal Transcribed Spacer – vùng dịch mã trong nhân
DNA : Deoxyribonucleotide Acid
rDNA : ribosome DNA
PCR : Polymerase chain reaction – phản ứng chuỗi Polymerase
PGA : Potato Glucose Agar
STT : Số thứ tự
ng : nano gram
µM : micro mol
TE : Tris EDTA
µg : micro gram
µl : micro lit
TAE : Tris Acetic EDTA
bp : base pair
dNTP : deoxyribonucleotide triphosphate

trên mặt trái làm mất vẻ thẩm mỹ nên rất khó tiêu thụ trên thị trƣờng. Ngoài ra, vi
khuẩn còn gây bệnh trên cành, lá làm ảnh hƣởng đến sự sinh trƣởng và phát triển của
cây. Không chỉ gây hại trên cây bƣởi mà vi khuẩn Xanthomonas sp. gây hại hầu hết
các loại cây có múi từ mức độ nhẹ đến nặng.
Để xác định rõ dòng vi khuẩn gây bệnh này chúng tôi thực hiện đề tài “Xây
dựng quy trình định danh vi khuẩn gây bệnh loét trên cây bƣởi bằng phƣơng
pháp sinh học phân tử”. Từ đó, chúng tôi có thể tìm ra phƣơng pháp phòng và trị
bệnh đạt hiệu quả nhằm khôi phục lại giống bƣởi Đƣờng Da Láng mang lại hiệu quả
kinh tế cao.
1.2. Mục đích
- Xây dựng quy trình định danh vi khuẩn gây bệnh loét trên cây có muối (cây
bƣởi).
- Phân loại tính độc của chủng gây bệnh.
2

1.3. Yêu cầu
- Thành thạo các thao tác phân lập, nuôi cấy, chủng bệnh nhân tạo trong phòng
thí nghiệm.
- Thực hiện đƣợc phƣơng pháp sắc ký bản mỏng định danh vi khuẩn.
- Thành thạo phƣơng pháp ly trích DNA vi khuẩn.
- Tính toán, thiết lập đƣợc phản ứng PCR, hạn chế tối đa tạp nhiễm.
1.4. Giới hạn của đề tài
- Chỉ xác định đƣợc chủng vi khuẩn gây bệnh loét trên cây bƣởi Da Láng,
bƣởi Đƣờng Cam là Xanthomonas sp.
- Chƣa giải đƣợc trình tự sản phẩm PCR đoạn 16s-23s rDNA ITS, chƣa thực
hiện đƣợc phản ứng PCR trên hrpW để định danh chính xác chủng vi khuẩn
gây bệnh ở mức độ loài.

đƣợc trồng ở nƣớc ta: bƣởi Da Láng, bƣởi Năm Roi, bƣởi Lông Cổ Cò, bƣởi Đƣờng
Cam, bƣởi Da Xanh, bƣởi Lông Hồng.Các vùng trồng bƣởi nổi tiếng ở nƣớc ta nhƣ
Đồng Nai và các tỉnh Đồng Bằng Sông Cửu Long.
2.1.2. Giá trị cây ăn quả có múi ở thế giới và trong nƣớc
Cây ăn quả có múi nhƣ cam, quýt, bƣởi là một trong những loại quả cao cấp
đƣợc nhiều ngƣời ƣa chuộng và đƣợc sản xuất ở nhiều nƣớc trên thế giới. Giá trị dinh
dƣỡng cây ăn quả có múi rất cao. Trong thành phần thịt quả có chứa 6-12% đƣờng,
chủ yếu là sacaroza. Hàm lƣợng vitamin C trong quả là 40-90% mg/100g tƣơi. Các
loại axit hữu cơ chứa trong thịt quả là 0,4-1,2%, trong đó có nhiều axit có hoạt tính
sinh học cao. Trong quả còn chứa các chất khoáng và dầu thơm. Tinh dầu đƣợc cất từ
vỏ quả, lá, hoa đƣợc dùng trong công nghiệp thực phẩm. Đặc biệt là chanh yên, một
tấn quả có thể đạt đƣợc 67 lít tinh dầu, tinh dầu ca quýt có giá trị khá cao trên thị
trƣờng quốc tế.
Ở nhiều nƣớc trên thế giới, từ những thời xa xƣa, ngƣời ta đã biết dùng các
thuộc chi Citrus làm thuốc chữa bệnh. Ở thế kỷ thứ XVI, các thầy thuốc Trung Quốc,
Ấn Độ đã dùng quả cam quýt để phòng ngừa bệnh dịch hạch, chữa trị bệnh phổi và
bệnh chảy máu dƣới da.
Ở nƣớc ta ngƣời dân đã dùng cây, lá, hoa, quả các loại cây ăn có múi để phòng
và chữa bệnh từ thời xa xƣa. Lê Quý Đôn vết trong sách “ Vân đài loại ngữ” “Quýt
4

vàng là thƣợng phẩm, quýt đỏ, quýt vá, quýt cát là hạ phẩn, vỏ quýt có tính khoan
trung hạ khí”, vỏ quýt có tên dƣợc liệu là “ trần bì” đƣợc sử dụng nhiều trong một số
bài thuốc y học cổ truyền.
Giá trị kinh tế, cây ăn quả có múi là cây lâu năm chóng cho thu hoạch, cây cam
quýt có thể sống và chóng cho thu hoạch quả trong vòng 25-30 năm vẫn cho năng suất
cao, đạt từ 100-250 kg quả/1cây trong một vụ.(Đƣờng Hồng Dật, 2000).

tăng từ 22 triệu tấn lên đến 48 triệu tấn, tăng cao nhất là cam, quýt đỏ rồi đến chanh
yên, bƣởi chùm và chanh. Trong vòng 15 năm tính từ năm 1970 đến năm 1984, sản
lƣợng cam tăng bình quân là 51%, quýt 7,5%, chanh 4,7%, bƣởi chùm là 4,3%/ năm.
Tổng sản lƣợng cam quýt trên thế giới trong những thập niên 90 của thế kỷ XX bình
quân hàng năm là 60-70 triệu tấn với tổng diện tích là 2,5 triệu ha, tập trung ở các
nƣớc có khí hậu á nhiệt đới và một phần nhiệt đới ở các vĩ độ cao hơn 20-22
o
C bắc và
nam bán cầu.
Hiện nay có 75 nƣớc trồng cam quýt trên thế giới đƣợc chia thành 4 khu vực :
Châu Mỹ, các nƣớc Địa Trung Hải, các nƣớc Châu Phi và các nƣớc Châu Á. Những
nƣớc trồng nhiều cam quýt nhất là Mỹ 9,6 triệu tấn /năm, Braxin 7,2 triệu tấn/ năm,
Tây Ban Nha 1,7 triệu tấn / năm.
Nhật Bản cung cấp10% sản lƣợng cam quýt trên thế giới với 2,7 triệu tấn vào
những năm 20 của thế kỷ XX, trong đó chủ yếu là quýt Unshiu, loại quýt này chiếm
49,2% tổng sản lƣợng quả cam quýt của Nhật. (Đƣờng Hồng Dật, 2000).
Thống kê năm 1967 của FAO cho biết tổng sản lƣợng về trái có múi là
28.902.000 tấn, trong đó cam và quýt chiếm 23.434.000 tấn tức 81% và bƣởi (cộng với
bƣởi chùm ) chỉ có 2.286.000 tấn tức 7,9% chƣa bằng 1/10 cam, quýt. Dẫn chứng là
Mỹ chỉ sản xuất bƣởi chùm (Citrus paradis ), không sản xuất bƣởi (Citrus grandis) đã
chiếm tới 1.161.000 tấn tức 70,7% tổng số bƣởi và bƣởi chùm. Trong khi cả châu Á
trong đó có hai nƣớc lớn nhất là Ấn Độ và Philippin, trong cả bƣởi và bƣởi chùm chỉ
sản xuất 59.000 tấn tức 2,6%. Hiện nay, sản lƣợng trái có múi cả thế giới đã vƣợt quá
50 triệu tấn, gần gấp đôi năm 1967, song tỷ lệ trên đây không thay đổi nhiều và phần
của bƣởi còn thấp hơn nữa.(Vũ Công Hậu, 1996).
2.2. Bệnh loét cam Xanthomonas citri (Hasse-Dowson)
2.2.1. Triệu chứng bệnh
Bệnh loét hại cam quýt ở tất cả các bộ phận của cây trên mặt đất, làm rụng lá,
quả, cây cằn cọc chóng bị tàn. Ở vƣờn ƣơm, khi bị bệnh nặng cây con dễ chết. Quả bị
bệnh có phẩm chất kém không thể xuất khẩu và cất trữ đƣợc. Nhiều nƣớc trồng cam,

Hình 2.1 Triệu chứng bệnh loét
trên lá bƣởi Da Láng

Hình 2.2 Triệu chứng bệnh loét
trên trái bƣởi Da Láng 7

Ở cành vết bệnh cũng tƣơng tự nhƣ ở lá nhƣng sùi lên tƣơng đối rõ ràng, ở giữa
vết bệnh không lõm xuống hoặc lõm xuống không rõ rệt. Vết bệnh còn xuất hiện ở gai
cũng giống nhƣ ở cành cây.

.
2.2.2. Đặc điểm gây bệnh của chủng vi sinh vật gây bệnh (X. a. pv. citri)
Vi khuẩn có hình gậy ngắn, kích thƣớc khoảng 1,5-2 x 0,5-0,75µm, hai đầu tròn
có một lông roi ở đầu, có thể nối liền thành chuỗi, có vỏ nhờn nhuộm gram âm, háo
khí. Độ dài genome khoảng 5 Mbp. Sinh trƣởng dễ dàng trên môi trƣờng agar –

ngày nhƣng trong đất vô trùng có thể tồn tại đƣợc 150 ngày. Theo Rao và Hingorant ở
đất vô trùng, vi khuẩn sống đƣợc 52 ngày còn ở đất không vô trùng chỉ sống đƣợc 17
ngày. Cũng từ hai tác giả trên thời gian sống của vi khuẩn ở những lá cây chết rụng
xuống đất khoảng 6 tháng. (Lê Lƣơng Tề và Vũ Triệu Mân, 1999).
Vào mùa mƣa trời ẩm ƣớt vi khuẩn từ trong vết bệnh cũ hoạt động, truyền
lan đi trong mƣa, gió hoặc côn trùng, chim. Vi khuẩn cũng có thể truyền dễ dàng
qua quần áo, nông cụ. Vi khuẩn rơi trên quả, lá, cành sẽ xâm nhập qua vết thƣơng,
khí khổng.
Đặc điểm xâm nhiễm gây bệnh: bệnh phát sinh do 3 yếu tố cơ bản tác động lẫn
nhau quyết định là “cây ký chủ- vi khuẩn gây bệnh-điều kiện ngoại cảnh môi trƣờng”
(Lê Lƣơng Tề và Vũ Triệu Mân, 1999).
Dựa triệu chứng bệnh và sự biến chủng của vi khuẩn có các loại bệnh loét sau:
- Loại Asiatic (Canker A), do Xanthomonas axonopodis pv.citri, bắt nguồn từ
châu Á, phân bố rộng, khả năng gây bệnh rất mạnh.
- Loại B, do Xanthomonas axonopodis pv. aurantifolii , bắt nguồn từ Nam Mỹ,
gây bệnh chủ yếu trên chanh nhỏ, cam chua, bƣởi.
- Loại C, cũng do Xanthomonasdis axonopodis pv. aurantifolii nhƣng gây bệnh
trên chanh nhỏ và cam chua.
- Loại A* đƣợc phát hiện ở Oman, Saudi Arabia, Iran và Idian chỉ gây bệnh trên
chanh. (http://en.wikipedia.org/wiki/Citrus_canker).
2.3. Sơ lƣợc vùng rDNA-ITS
2.3.1. Giới thiệu vùng rDNA
Những gen mã hóa rRNA đƣợc tìm thấy trong vùng rDNA. Sản phẩm của
những gen này (rRNA) kết hợp với những phân tử protein hình thành những ribosom
có chức năng tổng hợp protein. Gen rDNA 16S mã hóa một phân tử RNA hình thành
tiểu đơn vị ribosom nhỏ của vi khuẩn điển hình (thành phần protein của tế bào). Trình
tự của gen này thích hợp là một mô hình phổ biến để nghiên cứu sự tiến hóa và phân
loại vi khuẩn. Gene rDNA đƣợc tìm thấy ở hầu hết các dạng sống (ngoại trừ virus và
9


C. Alergria và ctv, 2004). Dựa vào đặc tính của hrp gen là đặc trƣng cho từng loài gây
bệnh nên ngƣời ta thiết kế primer chuyên biệt cho phản ứng PCR phát hiện nhanh,
10

chính xác loài gây bệnh. Phƣơng pháp phát hiện nhanh bằng primer chuyên biệt này
nhanh, chính xác hơn các phƣơng pháp nuôi cấy.

2.5. Những cứu về bệnh loét cam quýt trên Thế Giới và Việt Nam
2.5.1. Trên Thế Giới
Năm 2002, Edmilson R.Goncalves và ctv đã tiến hành phân tích mối quan hệ di
truyền giữa 17 loài Xanthomonas sp. bằng thực hiên phản ứng PCR và đọc trình tự
sản phẩm PCR.Phản ứng đƣợc thực hiện với cặp mồi Xan1330 và Xan332 đƣợc thiết
kế trên đoạn 16s-23s rDNA ITS.
Năm 2003, C. J. Vernière và ctv đã nghiên cứu sự phát triển và biểu hiện triệu
chứng bệnh của X. a. pv. citri trên cây có múi. C. J. Vernière và cộng sự đã kết luận
rằng để giảm bệnh loét nhà nông phải hạn chế tạo vết thƣơng cho cây, sự tăng trƣởng
quá nhiều chồi non và sự tăng trƣởng của quần thể X. a. pv. citri. Hệ thống chắn gió là
biện pháp hạn chế sự lan tràn bệnh hiệu quả nhất. Các tác nhân sinh học khác nhƣ ấu
trùng của côn trùng chít hút cũng là phƣơng tiện truyền bệnh nguy hiểm. Khả năng
nhiễm bệnh của ký chủ có liên quan đến giai đoạn phát triển của cây.
Năm 2003, Jung-Gun- Kim và ctv, đã mô tả đặc tính của vùng gây bệnh hrp của
X. a. pv. glycines Vùng này gồm vùng hrp gen, vùng hcr gen và vùng hca gen.Trong
đó vùng hrp và hcr mã hóa cho loại protein đóng vai trò quan trọng trong quá trình
xâm nhiễm của vi khuẩn X. a. pv. glycine. Đặc tính của vùng hrp gen này là chứa
nhiều gen độc, thành phần G+C thấp.
Năm 2006, Dong Suk Park và ctv, đã thực hiện thành công phƣơng pháp PCR
với mồi chuyên biệt trên hrpW gen để phát hiện nhanh và chính xác X. a. pv.citri, là
loài gây bệnh loét trên cây có múi tại châu Á.
2.5.2. Tại Việt Nam
Năm 2002, Nguyễn Thị Thu Cúc -Phạm Thị Hoàng Oanh, trƣờng Đại Học Cần
Thơ, có nghiên cứu về dịch hại trên cam, quít, chanh, bƣởi. Nghiên cứu này tập hợp
12

hầu hết các thông tin về dịch hại phổ biến tại Việt Nam. Trong nghiên cứu này, tổng

g) Kiểm tra tạo axit từ carbohydrates.

13

4. Kiểm tra tính gây bệnh
Khẳng định độc tính dòng phân lập đƣợc bằng cách chủng nhân tạo. Ký chủ
đƣợc chủng hoàn toàn là cây sạch bệnh. Tạo vết thƣơng trên cây ký chủ. Sau đó nhỏ
dòng vi khuẩn đã kiểm tra các bƣớc trên lên vết thƣơng. Đặt cây ký chủ đã chủng vào
điều kiện tối ƣu cho bệnh phát triển. Thông thƣờng thì ở nhiệt độ 27
o
C-30
o
C, trong
vòng 7 ngày sau khi chủng thì thấy triệu chứng bệnh.
2.6.2 Quy trình định danh theo phƣơng pháp phân tử
Dựa trên quy trình định danh bằng phƣơng pháp nuôi cấy và kiểm tra sinh hóa
nhƣng bổ sung thêm một số phƣơng pháp sinh học phân tử để định danh chính xác ở
mức loài. Quy trình gồm các bƣớc sau:
1. Phân lập và kiểm tra hình thái, sinh hoá trên các môi trƣờng khác nhau nhƣ
NA, YGA, YDC, KB.
2. Tiến hành kiểm tra dòng phân lập đƣợc bằng phản ứng ELISA để kiểm tra và
phân loại dựa trên độc tính gây bệnh.
3. Kiểm tra sự oxy hóa nguồn cacbon (khả năng tạo axit từ đƣờng cacbon).
4. Kiểm tra khả năng gây bệnh của dòng phân lập bằng phƣơng pháp chủng
nhân tạo.
5. Thực hiên phản ứng PCR với cặp primer đƣợc thiết kế trên vùng 16s-23s
rDNA ITS.