6

nhiều nƣớc và đã phát triển thành dịch ở khắp vùng châu Á nhiệt đới-Thái Bình
Dƣơng. Bệnh còn thấy ở các nƣớc châu Mỹ, châu Phi. Ở nƣớc ta bệnh hầu nhƣ phá hại
ở tất cả các vùng trồng cam quýt, gây thiệt hại đáng kể làm ảnh hƣởng tới nguồn hàng
xuất khẩu và tiêu dùng trong nƣớc.
Bệnh thƣờng bắt đầu xuất hiện ở lá non. Ban đầu vết bệnh là những chấm nhỏ
có đƣờng kính dƣới 1mm màu trắng vàng thƣờng thấy ở mặt dƣới lá. Sau đó vết bệnh
mở rộng hơn phá vỡ biểu bì mặt dƣới lá. Xung quanh vết bệnh có vầng tròn dạng giọt
dầu màu nâu hoặc xanh tối. Sau 2-3 tuần vết bệnh phát triển thành loét hình tròn màu
nâu xám. Khi vết loét già hóa gỗ rắn lại hình dạng vẫn còn hoặc không định hình. Trên
cây bƣởi vết bệnh khoảng 8mm.

Ở quả vết bệnh cũng tƣơng tự nhƣ ở lá.Vết bệnh rắn xù xì màu nâu ở giữa lõm,
mép ngoài nổi gờ lên, ở giữa vết bệnh mô chết rạn nứt. Toàn thể chiều dày của vỏ quả
có thể bị loét nhƣng không bao giờ vết loét ăn sâu vào ruột quả, bệnh nặng có thể làm
cho quả biến dạng ít nhiều.
là nó có thể sinh trƣởng thành khuẩn lạc màu vàng sáp trên miếng lát cắt củ khoai tây.
Phạm vi nhiệt độ phát triển là 5-35
o
C, thích hợp 20-30
o
C. Ở nhiệt độ 52
o
C
trong10 phút vi khuẩn chết. Vi khuẩn phát triển và hoạt động trong phạm vi pH 6,1-
8,8, thích hợp ở pH 6,6. Vi khuẩn có khả năng chịu hạn ở nhiệt cao, trong điều kiện
phòng thí nghiệm có thể tồn tại 130 ngày. Bệnh loét cam, bƣởi là bệnh hại có tính
nhiệt đới, vi khuẩn gây bệnh phát triển thích hợp trong điều kiện nhiệt độ cao, ẩm ƣớt,
sức chống hạn và lạnh cao. Vi khuẩn tồn tại trong vết lá, cành bệnh từ năm này qua
năm khác.
Theo Wolf (1916) vi khuẩn bệnh loét cam có thể tồn tại qua đông trong đất,
nhƣng Pltier và Frederich lại cho rằng vi khuẩn không thể tồn tại qua đông ở trong đất
hoặc trong lá rụng. Lee (1920) và Fulton (1925) cho rằng vi khuẩn bệnh loét cam
không đấu tranh đƣợc với tập đoàn vi khuẩn khác nên dễ dàng chết trong đất. Loucks
Hình 2.3 Triệu chứng bệnh loét
trên cành bƣởi Da Láng 8

(1930) đã chứng minh rằng vi khuẩn ở trong đất không vô trùng chỉ sống đƣợc 6-13
ngày nhƣng trong đất vô trùng có thể tồn tại đƣợc 150 ngày. Theo Rao và Hingorant ở
đất vô trùng, vi khuẩn sống đƣợc 52 ngày còn ở đất không vô trùng chỉ sống đƣợc 17


prion). Các thành phần của trình tự rDNA từ những sinh vật có quan hệ với nhau đƣợc
đánh dấu giống nhau. Điều này có nghĩa, trình tự của những sinh vật thân cận đã đƣợc
sắp xếp chính xác, làm cho những khác biệt dễ dàng để đánh giá. Điều đó cũng có
nghĩa là chỉ một vài nhóm primer PCR là cần thiết để khuếch đại gene rDNA từ bất cứ
loài vi khuẩn nào. Trình tự của rDNA 16S đã đƣợc xác định cho nhiều loài. Sự thật,
không có bất kỳ gen nào khác đặc trƣng cho nhiều loài nhƣ vậy.
Chiều dài và trình tự của những vùng ITS của rDNA đƣợc cho rằng là vùng tiến
hóa nhanh nhất và vì vậy có thể rất biến đổi. Những universal primer đƣợc thiết kế từ
những vùng bảo tồn nằm hai đầu vùng ITS và vùng ITS có kích thƣớc nhỏ (600 – 700
bp) dễ dàng đƣợc khuếch đại bởi vì số bản sao lớn (lên tới 30000 bản trong mỗi tế bào
(Dubouzet and Shinoda, 1999) của vùng lặp lại trên rDNA. Điều này làm cho vùng
ITS trở thành một đề tài đƣợc quan tâm cho việc nghiên cứu về sự tiến hóa và phát
sinh loài (Baldwin và ctv., 1995; Hershkovitz và ctv., 1996, 1999) cũng nhƣ các
nghiên cứu về địa lý sinh vật (biogeographic) (Baldwin, 1993; Suh và ctv., 1993;
Hsiao và ctv., 1994; Dubouzet và Shinoda, 1999). (Nguyễn Thị Tiến Sỹ, 2005).
2.3.2. Vùng rDNA-ITS trên Xanthomonas ssp.
Phân tích mối quan hệ loài dựa trên vùng 16s-23s rDNA bằng cách thiết kế
cặp primer Xan1330 và Xan332 dựa trên vùng gen 16s-23s rDNA ở Xanthomonas
sp. Sản phẩm PCR thu đƣợc là đoạn có kích thƣớc 1,1 kb và đƣợc xác định là
Xanthomonas sp. (Edmilson R Gonealves và Yoko. B. Rosato, 2002). (Hình 2.3,
Hình 2.4)
2.4. Sơ lƣợc về hrpW gen
Sự tƣơng tác giữa ký sinh với ký chủ phụ thuộc vào hệ thống protein . Đặc biệt
đối với tƣơng tác vi khuẩn gram âm gây bệnh thực vật với cây ký chủ. Loại protein
này đƣợc mã hóa bởi hrp gen. Trên Xanthomonas axonopodis pv.citri ngƣời ta xác
định các loại hrp gen: hrpG, hpaA, hpaB, hrcV, hrpB1, hrpD6, hrpB2, hrcU, hrcW,
hrpB4, hrcN. Trên X. a. pv.citri các hrp gen này nằm thành cụm trừ hrpW. (Marcos
C. Alergria và ctv, 2004). Dựa vào đặc tính của hrp gen là đặc trƣng cho từng loài gây
bệnh nên ngƣời ta thiết kế primer chuyên biệt cho phản ứng PCR phát hiện nhanh,
Hình 2.5 Sơ đồ hình cây thể hiện mối tƣơng quan giữa các dòng
Xanthomonas sp. dựa trên vùng 16s-23s rDNA ITS (Edmilson R
Gonealves và ctv, 2002).

Hình 2.4. Cấu trúc vùng 16s-23s rDNA ITS của Xanthomonas sp.
Trình tự primer Xan1330 và Xan332 đƣợc thiết kế trên vùng 16s-23s
(Edmilson R Gonealves và ctv, 2002).
Xan 1330 5’GTTCCCGGGCCTTGTACACAC 3’
Xan 322 5’ GGTTCTTTTCACCTTTCCCTC 3’

11

Ngƣời ta dựa vào trình tự hrpW gen của X. a. pv. citri (Genbank Accession No.
AE008923) thiết kế cặp primer XACR, XACF chuyên biệt phát hiện nhanh chính nó.
Sản phẩm PCR thu đƣợc là đoạn có kích thƣớc 561 bp (Dong Suk Park và ctv, 2006)
XACR 5’CGTCGCAATACGATTGGAAC 3’
XACF 5’CGGAGGCATTGTCGAAGGAA 3’
2.5. Những cứu về bệnh loét cam quýt trên Thế Giới và Việt Nam
2.5.1. Trên Thế Giới

thái, sự gây hại, triệu chứng và các biện pháp đối phó.
Năm 2005, Vi Thị Thanh Hƣờng, trƣờng Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ
Chí Minh đã nghiên cứu các tác nhân và biện pháp phòng trừ biện pháp phòng trừ
bệnh loét trên bƣởi ở xã Tân Bình - huyện Vĩnh Cửu - tỉnh Đồng Nai. Tác giả đã phân
lập đƣợc một số dòng vi khuẩn gây bệnh nhƣng chƣa định danh đƣợc. Đồng thời, tác
giả cũng xác định một số loại thuốc hóa học phòng trừ bệnh loét.
2.6. Quy trình định danh Xanthomona sp. .
2.6.1. Quy trình định danh Xanthomonas sp. theo phƣơng pháp nuôi cấy, thực
hiện phản ứng sinh hóa
1. Sử dụng môi trường chọn lọc để phân lập dòng gây bệnh (Bảng 2.1)
2. Xác định dựa vào sắc tố vàng Xanthomonadin.
(Phƣơng pháp thực hiện sẽ nêu ở phần 3.4.3 phƣơng pháp và vật liệu)
3. Thực hiện thí nghiệm sinh hóa và quan sát hình thái (Bảng 2.2)
a) Khả năng phát triển trong môi trƣờng YS ở 35
o
C trong 10-12 ngày.
b) Kiểm tra sự tạo nhầy, màu sắc của khuẩn lạc trên môi trƣờng GYCA hoặc
YDC trong 2-3 ngày.
c) Kiểm tra khả năng phân hủy protein: là thử nghiệm khả năng phân hủy
casein trong dịch sữa có chứa chất chỉ thị bromcresol purple đã khử trùng.
Dịch sữa và khuẩn đƣợc ủ 27
o
C quan sát phản ứng phân hủy.
d) Kiểm tra thủy phân asculin: phản ứng dƣơng tính khi dịch đổi màu nâu
tối (môi trƣờngYS lỏng + ferric ammonium citrate 0,05% và asculin 0,1%,
pH 6,8).
e) Kiểm tra khả năng thủy phân gelatin.
f) Kiểm tra khả năng tạo urease.
g) Kiểm tra tạo axit từ carbohydrates.


khuẩn gây bệnh ở mức loài. (M. H. R Khoodoo và ctv, 2005).
14

Bảng 2.1. Môi trƣờng sử dụng phân lập một số loài X. campestris Bảng 2.2. Đặc tính sinh hóa của Xanthomonas sp. Loài
Môi trƣờng
campestris
carotae
translucens
phaseoli

_
+
+
_
Thủy phân asculin
+
_
+
+
_
Phân hủy gelatin
V
+
v
_
_
Phân hủy protein
+
_
_
_
_
Khả năng tạo
Urease
_
_
_
_
+
Tạo axit từ:


15

2.7 Phƣơng pháp PCR
Phƣơng pháp PCR ( Polymerase Chain Reaction) là một công cụ khá mới trong sinh học
phân học phân tử, do Karl Mullis và những cộng sự phát minh năm 1985 và đã liên tục hoàn thiện
và phát triển trong thời gian gần đây. Kỹ thuật PCR cho phép khuếch đại một đoạn DNA mong
muốn lên nhiều lần để phục vụ cho nhiều mục đích khác nhau. Nguyên tắc cơ bản của phƣơng
pháp PCR chủ yếu dựa vào khả năng tự nhân đôi, biến tính và hồi tính của DNA.
*Nguyên tắc của phƣơng pháp PCR
Dựa trên khả năng biến tính và hồi tính của DNA cùng với sự phát hiện ra enzyme Taq-
polymerase (1 loại DNA polymerase chịu nhiệt), ngƣời ta thiết lập đƣợc hàng loạt các phản ứng
nhân đôi DNA in vitro trong một thời gian ngắn. Khi ta làm biến tính (đun nóng) để đoạn DNA
tách ra thành 2 mạch đơn và cung cấp 2 mồi chuyên biệt gồm mồi xuôi và mồi ngƣợc bắt cặp bổ
sung với 2 đầu đoạn DNA cần nhân lên thì Taq-polymerase sẽ tổng hợp nên 2 sợi DNA mới.
Nhƣ vậy nếu phản ứng nhân đôi DNA đƣợc lập lại liên tục nhiều lần thì ta sẽ thu đƣợc một lƣợng
khuếch đại rất lớn DNA cần nghiên cứu.
Phản ứng PCR gồm nhiều chu kỳ, mỗi chu kỳ có 3 giai đoạn:
- Giai đoạn 1: là giai đoạn biến tính (denaturation), nhiệt độ đƣợc nâng lên 93- 100
o
C. Ở
nhiệt độ này tất cả các mạch xoắn kép của DNA đều đƣợc tách ra.
- Giai đoạn 2: là giai đoạn bắt cặp (hybridization), nhiệt độ của phản ứng đƣợc hạ xuống
thấp hơn nhiệt độ nóng chảy-Tm của các mồi (là nhiệt độ mà tại đó 2 mạch của sợi đôi DNA tách
ra hoàn toàn) cho phép các mồi bắt cặp với DNA khuôn mẫu. Mức nhiệt độ dao động khoảng 40-
70
o

vàng Xanthomodin đặc trƣng).
4. Nhân sinh khối, ly trích DNA tổng số các dòng vi khuẩn phân lập đƣợc.
5. Dùng phản ứng PCR trên 16s-23s rDNA ITS với cặp primer Xan1330 và
Xan332 để kiểm tra phƣơng pháp định danh đã thực hiện. Đồng thời tiến tới
giải trình tự sản phẩm PCR định danh ở mức độ loài.
6. Thực hiện phản ứng PCR trên vùng hrpW gen với cặp mồi chuyên biệt XACR
và XACF cho phép xác định nhanh Xanthomonas axonopodis pv. citri.
3.3 Vật liệu nghiên cứu
Tiến hành thu thập mẫu bệnh cây bƣởi Da Láng, bƣởi Đƣờng Cam tại huyện
Vĩnh Cửu, tỉnh Đồng Nai. Mẫu bệnh đƣợc thu thập tại vƣờn, trữ trong thùng mát,
mang về phòng, tiến hành phân lập.
3.4. Phƣơng pháp tiến hành
3.4.1 Phân lập, nuôi cấy trên 2 môi trƣờng PGA và YDC, xác định Gram âm hay
Gram dƣơng các dòng vi khuẩn gây bệnh loét trên cây bƣởi
 Dụng cụ và thiết bị  Hóa chất và vật liệu
- Autoclave - Đƣờng glucose
- Bếp điện - CaCO
3

17

- Tủ cấy vô trùng - Yeast extract
- Đĩa peitri - Khoai tây
- Becher 100ml - Agar
- Cồn 96%, và cồn 70% - Que cấy
- Đèn cồn
 Phân lập vi khuẩn gây bệnh, nuôi cấy trên 2 môi trƣờng PGA và YDC,

- Cách đặt tên cho các dòng vi khuẩn phân lập được
Dựa trên cây ký chủ thu thập mẫu lá và trái. Ví dụ: dòng vi khuẩn XBDL1 đƣợc
hiểu là dòng Xanthomonas sp., BDL là tên ký chủ bƣởi Da Láng, số 1 là dòng
vi khuẩn trên lá, số 2 là dòng trên cành, số 3 là dòng vi khuẩn trên trái.
3.4.2. Chủng bệnh nhân tạo
Chủng bệnh nhân tạo trong phòng: hái lá, quả bƣởi không bị nhiễm bệnh, rữa
thật sạch dƣới vòi nƣớc chảy. Khi lá, quả bƣởi ráo nƣớc ta tiến hành chủng bệnh. Dùng
kim nhọn gây vết thƣơng dƣới lá, sau đó dùng pipet hút dịch khuẩn (khuẩn lạc đặc
trƣng pha với nƣớc cất vô trùng) nhỏ lên vết thƣơng. Giữ lá trong hộp nhựa đủ độ ẩm.
3.4.3. Thực hiện sắc ký bản mỏng định danh vi khuẩn
 Dụng cụ và thiết bị  Hóa chất và vật liệu

- Bình hút ẩm - Methanol 100%

- Epffendorf 1,5 ml - Nutrient
- Micropipette 1000µl - Agar
- Bếp điện
- Tấm sắc ký
- Máy ly tâm
 Phƣơng pháp sắc ký bản mỏng
Nhiều vi khuẩn có sắc tố vàng thƣờng đƣợc phân lập từ cây hoặc đất.
Xanthomonas cũng có sắc tố vàng. Do đó, việc dựa vào màu khuẩn lạc trên môi trƣờng
để xác định đó là Xanthomonas thì khó. Tuy nhiên, ngƣời ta vẫn có thể xác định đƣợc
Xanthomonas dựa vào phƣơng pháp sắc ký bản mỏng.
Các bƣớc tiến hành:
1. Cấy khuẩn lạc trên môi trƣờng nutrient agar (môi trƣờng không có
cacbonhydrate vì sẽ tạo chất nhầy cản trở quá trình sắc ký).
19
3.4.4. Phƣơng pháp ly trích DNA tổng số của vi khuẩn
 Hóa chất và vật liệu
- Hỗn hợp phenol: chloroform: isoamyl alcohol (25:24:1)
- Hỗn hợp chloroform: izoamyl alcohol (24:1)
- Isopropanol
Vệt sắc tố sau khi nhỏ lên
tấm sắc ký
(a)
20

- Ethanol 100 % và 70 %
- Dung dịch đệm ly trích DNA
Tris (trisma bazơ): chất đệm, giữ ổn định pH tránh
tổn hại DNA
EDTA (Ethylenediamine tetraacetate) : tạo phức Mg
++
, gây bất hoạt enzyme
phân hủy DNA trong quá trình tách chiết
SDS: (sodium dodecy sulphate) 20 % : phá vỡ và tẩy sạch màng tế bào,
màng nhân để phóng thích DNA
Dung dịch CTAB (Cetultrimethylammonium bromide): dùng để kết tủa
polysaccharide và tạp chất khác
- 10g CTAB (Cetultrimethylammonium bromide)
- 100ml NaCl 0,5 M
Dung dịch đệm TE (Tris-EDTA) pH 8
Bảng 3.1. Thành phần dung dịch đệm TE
Thành phần

1. Thu sinh khối vi khuẩn bằng cách ly tâm 10 000 vòng/ 5 phút/ 4
o
C. Rửa sinh
khối vi khuẩn đƣợc với 1ml nƣớc cất 2 lần vô trùng, đánh tan bằng vortex.
21

2. Hòa tan sinh khối vi khuẩn thu đƣợc trong 567µl dung dịch TE, đánh tan
bằng vortex, thêm 30µl dung dịch SDS10%, đánh tan bằng vortex. Sau đó ủ ở
37
o
C khoảng 1-2 h.
3. Cho thêm vào 100µl dung dịch NaCl5M hòa tan thật kỹ bằng vortex.
3. Thêm 80µl dung dịch CTAB/NaCl, pha trộn (đánh tan bằng vortex), ủ 65
o
C
trong 10 phút.
4. Chiết xuất dung dịch DNA với phenol/ chloroform/ isoamyl alcohol
(25:24:1).Hòa hỗn đều bằng cách lắc tay, ly tâm 14 000 vòng/ 10 phút/ 4
o
C.
5. Thu hết dung dịch bên trên cho vào ống ly tâm mới.
6. Thêm 780µl dung dịch hỗn hợp chloroform / isoamyl alcohol (24:1).Hòa lẫn
đều bằng lắc tay, ly tâm 12 000 vòng/10 phút/4
o
C.
7. Thu lấy dịch bên trên cho vào ống ly tâm mới. Kết tủa DNA với isopropanol,
ủ -20

22

- Micropipette 10µl, 100µl và các loại đầu típ tƣơng ứng
- Máy luân nhiệt
- Tủ vô trùng

3.4.5.1 Khuếch đại vùng 16s-23s rDNA ITS dòng vi khuẩn phân lập với cặp
mồi Xan1330 và Xan332 (M.H.R Khoodoo và ctv, 2005)
Xan 1330 5’GTTCCCGGGCCTTGTACACAC 3’
Xan 322 5’ GGTTCTTTTCACCTTTCCCTC 3’
Bảng 3.2. Hỗn hợp thực hiện phản ứng PCR.
Bảng 3.3 Chu trình nhiệt phản ứng PCR.cc

3.4.5.2 Khuếch đại đoạn hrpW gen dòng vi khuẩn phân lập với cặp mồi
XACF và XACR
Sử dụng bặp mồi XACR, XACF khuếch đại vùng hrpW gen trên Xanthomonas
axonopodis pv.citri có kích thƣớc 561bp. Đây là trình tự mồi chuyên biệt để xác định
Thành phần
Nồng độ ban đầu
Nồng độ sau phản ứng
Thể tích (µl)


18,05
Tổng cộng 25
Các bƣớc phản ứng
Nhiệt độ
Thời
gian
Giai đoạn khởi động
Chạy chu kỳ (25 chu kỳ)
Tách DNA khuôn
Ủ và bắt cặp
Kéo dài
Giai đoạn kết thúc
94
o
C

94
o
C
58
o
C
72
o
C
72