23

chính xác 4 dòng phân lập đƣợc là Xanthomonas axonopodis pv.citri . (theo Dong Suk
Park và ctv, 2005).
XACF 5’ CGTCGCAATACGATTGGAAC 3’
XACR 5’CGGAGGCATTGTCGAAGGAA 3’
Bảng 3.4. Hỗn hợp thực hiện phản ứng PCR.

Bảng 3.4. Chu trình nhiệt phản ứng PCR

3.5.6. Điện di kiểm tra sản phẩm ly trích và sản phẩm PCR
 Dụng cụ và thiết bị

Hóa chất
- Cân kĩ thuật 4 số, ống đong - Agarose
- Lò viba - TAE 0,5X
- Khay đổ gel - Loading dye 6X
- Bồn và máy điện di - Ethidium bromide
- Máy chụp hình gel (Gel doc)
Thành phần
Nồng độ ban đầu
Nồng độ sau phản ứng
19,25
Tổng cộng 25
Các bƣớc phản ứng
Nhiệt độ
Thời gian
Giai đoạn khởi động
Chạy chu kỳ (25 chu kỳ)
Tách DNA khuôn
Ủ và bắt cặp
Kéo dài
Giai đoạn kết thúc
94
o
C

94
o
C
60
o
C
72
o
C
72

agarose xuống còn 55
0
C thì đổ vào khai điện di có cài sẳn lƣợc. Chiều dày gel
khoảng 5 mm là thích hợp.
- Sau khi gel cứng, di chuyển lƣợc ra khỏi gel và đặt khai vào bể điện di chứa
TAE 1X sau cho gel ngập trong dung dịch. Chú ý nhẹ tay tránh bọt khí.
2. Tiến hành chạy điện di
-Lấy một mẫu giấy parafilm, nhỏ những giọt loading buffer lên (mỗi giọt có thể
tích khoảng 2 l). Cho thêm 5 l DNA lên mỗi giọt loading buffer và trộn đều.
Dùng pipetman hút hỗn hợp DNA cho vào giếng của khai điện di.
-Đậy nắp gel và cho chạy điện di, dòng điện cung cấp: 100 vol, 250 mA, định
thời gian cho gel chạy (tùy vào sự duy chuyển của băng).
-Tắt điện, đem gel nhuộm Ethidium bromide và mang gel đi chụp ảnh với tia
UV thông qua phần mềm Quantity on. 25

XBDL1 XBDL2 XBDL3 XBĐ C3

PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. Phân lập, xác định gram vi khuẩn gây bệnh loét ở cây bƣởi da láng và bƣởi
đƣờng cam
Chúng tôi đã tiến hành phân lập đƣợc 4 dòng vi khuẩn trên các cây ký chủ khác
nhau và bằng dung dịch KOH 3% đã xác định đƣợc tât cả là gram âm.
Bảng 4.1. Kết quả phân lập và xác đinh gram
Địa điểm thu mẫu


Dòng vi khuẩn
PGA
YDC
XBDL1
Vàng, sáp, tròn vun
Vàng sữa, sáp, tròn vun
XBDL2
Vàng lợt, sáp, tròn vun
Vàng sữa, sáp, tròn vun
XBDL3
Vàng, sáp, tròn vun
Vàng sữa, sáp, tròn vun
XBĐC3
Vàng đậm, sáp, tròn vun
Vàng chanh, sáp, tròn vun
26

XBDL1 XBDL2 XBDL3 XBĐ C3
Hình 4.1. Sự phát triển của các dòng vi khuẩn phân lập đƣợc trên môi trƣờng
PGA ở nhiệt độ 28
o
C sau 48 giờ.

Bảng 4.3. Khả năng nhiễm bệnh của 4 dòng vi khuẩn: XBDL1, XBDL2, XBDL3,
XBĐC3 trên lá da láng.
Giống
Thời gian
xuất hiện
bệnh
Tổng số đốm
bệnh/ Tổng số
vết thƣơng
Mô tả triệu
chứng bằng
mắt thƣờng
Triệu chứng bệnh qua kính
hiển vi (độ phóng đại 4x10)
XBDL1
3 ngày
96%
Gờ nhẹ
Viền màu xanh, mọng nƣớc,
bên trong sùi nhẹ.
XBDL2
2 ngày
95%
Gờ nhẹ
Viền màu xanh đậm, mọng
nƣớc, bên trong vết bệnh sùi
lên cao.
XBDL3

28

XBDL2; (d) chủng dòng XBDL3; (e) chủng dòng XBĐC3. Tổng số vết
thương là 50

ix
4.3. Sắc ký định danh vi khuẩn gây bệnh
Tiến hành sắc ký bản mỏng trên các dòng: XBDL1, XBDL2, XBDL3, XTĐC3
và một dòng đối chứng âm là Erwinia sp. Mục đích của chạy sắc ký bản mỏng là để
khẳng định các dòng phân lập đƣợc là Xanthomonas sp.
Kết quả khi chƣa chụp UV: đối chứng âm không ra, dòng XBDL1, XBDL2,
XBDL3, XBĐC3 đều có vệt màu vàng.
Kết quả khi chụp UV: chỉ có một dòng XBDL1 phát sáng rõ rệt nhất, các dòng
XBDL2, XBDL3, XBĐC3 chỉ có vệt mờ nhƣng giá trị Rf >0.45 theo mục 3.4.3 Rf=0.45
mới khẳng định đƣợc đó là Xanthomonas sp. Nhƣ vậy, dựa vào kết quả sắc ký không thể
kết luận dòng XBDL1, XBDL2, XBDL3, XBĐC3 là Xanthomonas sp. Để có thể định
danh đƣợc bốn dòng XBDL1, XBDL2, XBDL3, XBĐC3 chúng tôi thực hiện khuếch đại
vùng 16s-23s rDNA ITS với cặp mồi Xan1330 và Xan332 (M.H.R Khoodoo và ctv,
2005).

Hình 4.5. DNA tổng số ly trích theo quy trình 3.4.4 (Sambrook và ctv, 2001
đã có cải tiến).
Ghi chú: 1 dòng XBDL1, 2 dòng XBDL2, 3 dòng XBDL3, 4 dòng XBĐC.
Nhận xét: Qua hình 4.5 cho thấy quy trình ly trích theo mục 3.4.4 (Sambrook và
ctv, 2001 đã có cải tiến) đã ổn định, nhƣng kết quả chƣa sạch. Ngoài DNA tổng số còn
có DNA bị gãy, phần tạp nhiễm trong quá trình ly trích tạo thành vệt sáng cuối giếng.
Các dòng XBDL1, XBDL3 là bị tạp nhiễm nhiều nhất. Để thực hiện phản ứng PCR,
DNA tổng số phải đƣợc pha loãng xuống.
4.5. Thực hiện PCR với cặp mồi Xan1330 và Xan 332 trên vùng ITS
Tiến hành phản ứng PCR theo 3.4.5.1 thu đƣợc kết quả nhƣ hình 4.6
Hình 4.6.cho thấy sản phẩm PCR của 4 dòng phân lập đƣợc có cùng kích thƣớc
với dòng Xanthomonas sp đã đƣợc phân lập và định danh trên cây cải ngọt. Dòng
1.1kb
1 2 3 4 5
Hình 4.6. Sản phẩm PCR đoạn 16s-23s rDNA ITS
Ghi chú: 1- sản phẩm PCR của Xanthomonas sp đã
được định danh.
sử dụng sản phẩm này như đối chứng dương;
2- sản phẩm PCR của dòng XBDL1
3-sản phẩm PCR của dòng XBDL2

Dựa trên kết quả phân tích và thực hiện các thí nghiệm có thể đƣa ra những
bƣớc cơ bản để định danh dòng vi khuẩn gây bệnh loét trên cây có múi dựa trên kỹ
thuật sinh học phân tử. Các bƣớc cơ bản đó là :(Hình 4.7)
xii Giải trình tự sản phẩm PCR, đối
chiếu kết quả trên http://
www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST
Tiến hành PCR trên vùng hrpW gen với
cặp mồi chuyên biệt XACR và XACF
cho phép xác định nhanh Xanthomonas
axonopodis pv. citri
( Dong Suk Park và ctv, 2006)
Hình 4.7. Các bƣớc cơ bản để định danh dòng vi khuẩn gây bệnh loét trên cây
có múi dựa trên kỹ thuật sinh học phân tử.

(1)
(2)
(3a)

xiii
Phần 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
5.1. Kết luận
- Đã phân lập đƣợc 4 dòng vi khuẩn gây bệnh theo mục 3.4.1.
- Phƣơng pháp chủng bệnh nhân tạo theo mục 3.4.2 thể hiện tất cả các dòng
phân lập đƣợc đều có khả năng gây bệnh, có thể sử dụng trên các đối tƣợng là cây có
múi.
- Thực hiện đƣợc phƣơng pháp sắc ký bản mỏng theo quy trình 3.4.3. Tuy
nhiên, kết quả không nhƣ mong muốn chƣa thể khẳng định các dòng đƣợc phân lập là
Xanthomonas sp. Nhƣng sản phẩm PCR trên vùng 16s-23s rDNA ITS với cặp mồi

2. Đƣờng Hồng Dật, 1976. Sổ tay bệnh hại cây trồng tập1. NXB Nông Thôn, Việt
Nam.
3. Hồ Huỳnh Thùy Dƣơng, 1998. Sinh học phân tử. Nhà xuất bản Giáo Dục.
4. Nguyễn Thị Tiến Sỹ, 2005. Sử dụng kỹ thuật RFLP khảo sát sự da dạng di
truyền của nấm Rhizoctonia solani phân lập từ nhiều cây ký chủ khác nhau,
luận văn tốt nghiệp bộ môn Công Nghệ Sinh Học trƣờng Đại Học Nông Lâm
tp.HCM
5. GS.TS Trần Thế Tục, 1998. Giáo trình cây ăn quả, NXB Nông Nghiệp, Hà
Nội, Việt Nam.
6. Vi Thị Thanh Hƣờng, 2005. Nghiên cứu tác nhân và biện pháp phòng trừ
bệnh loét trên cây bưởi ở xã Tân Bình - huyện Vĩnh Cửu -tỉnh Đồng Nai, luận
văn tốt nghiệp khoa Nông Học trƣờng Đại Học Nông Lâm tp.HCM.
7. Vũ Triệu Mân và Lê Lƣơng Tề, 1998. Giáo trình bệnh cây nông nghiệp,
NXB Nông Nghiệp, Hà Nội, Việt Nam.
.
Tiếng Anh

8. Dong Suk Park, Jae Wook Hyun, Young Jin Park, Jung Sun Kim, Hee Wan
Kang, Jang Ho Hahn, Seung Joo Go, 2006, Sensitive and specific detection of
Xanthomonas axonopodis pv.citri by PCR using pathovar specific primers
based on hrpW gene sequences; Microbiological Research 161:145-149.

xv
9. Elmilson .R. Goncalves and Yoko B. Rosato, 2002. Phylogenetic analysis of
Xanthomonas species based upon 16S-23S r DNA intergenic spacer
sequences, International Journal of Systematic and Evolutionary
Microbiology, 52: 355-361.


Phần 7. PHỤ LỤC
1. Môi trƣờng PGA (Potato Glucose Agar)
Trong 1lit
Khoai tây 200g
Glucose 20g
Agar 18-20g
2. Môi trƣờng YDC (Yeast extract Dextrose Calcium carbonate)
Yeast extract 10g
Dextrose 20g
Calcium carbonate 20g
Agar 15g
3. Môi trƣờng SX
Tinh bột (khoai tây) 10g
Beef extract 1.0g
Ammonium chloride 5.0g
Dipotassium phosphate 2.0g
Methyl violet 2B 2ml
Agar 15.0g
Sau khi hấp khử trùng thêm Cycloheximide 5ml
4. Môi trƣờng SM
KH
2
PO
4
1.0g
Na
2
HPO
4

Nutrient aga r 23.0g
Tinh bột 15.0g
Aga r 15.0g
Sau khi hấp tiệt trùng thêm vào: Cycloheximide 5ml
Nitrofurantin 1.0ml
Vancomycin 1.0ml
6. Môi trƣờng XTS
Nutrient aga r 23.0g
Gluco se 5.0g
Sau khi hấp tiệt trùng thêm vào Cycloheximide 2.0ml
Gentamycin 0.5ml
Cephalexin 1.0ml

7. Môi trƣờng MD-5
D-cellobiose 10.0g*
K
2
HPO
4
3.0g

xviii
Na
2
H
2
PO

Agar 15.0g
Sau khi hấp tiệt trùng thêm vào Tobramycin 1.0ml
Ampicillin 0.5ml
Vancomycin 0.5ml
Cycloheximide 5.0ml
9. M ôi tr ƣ ờng TWEEN
Pepton 10.0g
Potassium bromide 10.0g
Calcium cloride 250.0mg
Aga r 15.0g
Sau khi hấp tiệt trùng thêm vào Tween 80 10.0g
Cephalexin 25.0mg
5-Fluorouracil 6.0mg

xix
Tob ramycin 0.4mg
Cyclohexinmide 75.0mg