BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HCM
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
***000***
TRẦN VĂN KỲ PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH DANH TÁC NHÂN GÂY BỆNH ĐỐM LÁ
CÂY CẢI NGỌT TẠI TP. HCM BẰNG KỸ THUẬT PCR
VÀ GIẢI TRÌNH TỰ VÙNG 16S – 23S rDNA
LUẬN VĂN KỸ SƢ
CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Thành phố Hồ Chí minh
-2006-
-2006-
MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING
NONG LAM UNIVERSITY, HCMC
DEPARTMENT OF BIOTECHNOLOGY
***000*** ISOLATING AND IDENTIFYING AGENT CAUSED Brassica
chinensis L. LEAF SPOT DISEASE IN HO CHI MINH CITY
USING POLYMERASE CHAIN REACTION AND
SEQUENCING 16S – 23S rDNA REGION GRADUATION THESIS
MAJOR: BIOTECHNOLOGY
Professor Student
Ph.D, LE DINH DON TRAN VAN KY
MSc, HOANG XUAN QUANG
ii
TÓM TẮT
Đề tài nghiên cứu: “Phân lập và định danh tác nhân gây bệnh đốm lá cây cải ngọt
tại Tp HCM bằng phƣơng pháp PCR và giải trình vùng 16S – 23S rDNA” đƣợc thực
hiện từ ngày 6 tháng 2 năm 2005 đến ngày 30 tháng 7 năm 2006 tại trƣờng Đại Học
Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh, Viện Khoa Học Kỹ Thuật Nông Nghiệp Miền
Nam.
Đề tài do sinh viên Trần Văn Kỳ thực hiện dƣới sự hƣớng dẫn của TS. Lê Đình
Đôn và KS. Hoàng Xuân Quang.
Đối tƣợng nghiên cứu là vi khuẩn Xanthomonas campestris pv. campestris gây
bệnh đốm lá trên cây cải ngọt. Hiện nay, tại các vùng trồng rau ở Huyện Củ Chi, Hóc
Môn và quận 12, thành phố Hồ Chí Minh, bệnh đốm lá đang gây thiệt hại rất lớn cho
nông dân trồng rau cải ngọt. Triệu chứng điển hình của bệnh là sự xuất hiện các đốm
nhỏ có kích thƣớc 1 – 2 mm trên lá rau. Khi bệnh phát triển, các đốm bệnh lớn dần, có
thể lên kết lại dẫn đến lá rau bị vàng và chết. Bệnh làm giảm năng suất cũng nhƣ chất
lƣợng cây rau cải ngọt.
Mục đích đề tài nhằm định danh tác nhân gây bệnh bằng kỹ thuật PCR, giải trình
tự gen nhằm làm cơ sở cho các nghiên cứu phòng và trị bệnh sau này.
Các nội dung nghiên cứu bao gồm:
1. Phân lập tác nhân gây bệnh từ các mẫu bệnh thu đƣợc từ các vùng trồng rau ở
2.1. Tổng quan nghiên cứu ngoài nƣớc .................................................................. 4
2.1.1. Lịch sử phát hiện và sự phân bố. ........................................................... 4
2.1.2. Tác nhân và triệu chứng bệnh ............................................................... 5
2.1.3. Tác động kinh tế của bệnh. ................................................................... 6
2.1.4. Sinh lý, sinh thái và điều kiện phát triển bệnh. ...................................... 7
2.1.5. Hình thái, đặc điểm sinh lý, sinh hóa của vi khuẩn gây bệnh. ............... 8
2.1.6. Phƣơng pháp phân lập và dịnh danh tác nhân gây bệnh ........................ 8
2.1.7. Những nghiên cứu về phát hiện và dịnh danh tác nhân gây
bệnh bằng phƣơng pháp sinh học phân tử………………….......................10
2.2. Tổng quan nghiên cứu trong nƣớc ................................................................ 12
2.3. Vùng ITS (rDNA intergenic spacer) và gen hrpF
(hypersensitive reaction and pathogenicity). ............................................... 13
2.3.1. Gen hrpF (hypersensitive reaction and pathogenicity). ...................... 13 iv
2.3.2. Ribosome DNA (rDNA). .................................................................... 13
3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP TIẾN HÀNH ............................................... 15
3.1. Thời gian và địa điểm ................................................................................... 15
3.1.1. Thời gian ............................................................................................. 15
3.1.2. Địa điểm .............................................................................................. 15
3.2. Vật liệu ......................................................................................................... 15
3.3. Hóa chất ........................................................................................................ 15
3.3.1. Các hóa chất dùng ly trích DNA từ vi khuẩn ...................................... 15
3.3.2. Các hóa chất dùng trong điện di .......................................................... 16
3.3.3. Hóa chất cho phản ứng PCR (do công ty Bio – Rad cung cấp) .......... 16
3.3.4. Môi trƣờng ........................................................................................... 17
3.4. Dụng cụ, thiết bị ............................................................................................ 17
3.5. Phƣơng pháp .................................................................................................. 17
3.5.1. Phƣơng pháp thu thập mẫu bệnh ......................................................... 17
TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................... 36
PHỤ LỤC .................................................................................................................. 39
vi
DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
CTAB :Cethyltrimethylammonium bromide
EDTA :Ethyleneediamine tetraacetic acid
ng : nano gram
cDNA : complementary DNA
nm : nano mol
Bảng 1.1 Sự phát triển của một số loài vi khuẩn Xanthomonas trên
môi trƣờng bán chọn lọc.....................................................................9
Bảng 3.1 Thành phần phản ứng PCR………………………………………... 20
Bảng 3.2 Chu trình nhiệt phản ứng PCR với cặp mồi Xan1330 và Xan 322…21
Bảng 3.3 Chu trình nhiệt phản ứng PCR với cặp mồi XCR và XCF……….. 21
Bảng 3.4 Lƣợng DNA tối ƣu cho phản ứng đọc trình tự………………………. 23
Bảng 3.5 Thành phần hóa chất cho mỗi phản ứng đọc trình tự……………... 24
Bảng 4.1 Danh mục các dòng vi khuẩn sử dụng trong đề tài………………... 26
viii
DANH SÁCH CÁC HÌNH
ngành rau nhờ chủng loại phong phú, sản lƣợng cao, thích nghi rộng rãi với điều kiện
thời tiết, đất đai khác nhau, dễ vận chuyển, cất giữ lâu, dễ ăn, dễ chế biến và nấu
nƣớng.
Rau là loại thực phẩm không thể thiếu trong bữa ăn hằng ngày của con ngƣời,
đặc biệt là với các dân tộc Châu Á và nhất là với ngƣời Việt Nam. Dù ở đâu – trong
nƣớc hay ngoài nƣớc – bữa ăn của ngƣời Việt Nam luôn có món rau với số lƣợng
nhiều hơn so với của các dân tộc khác. Có lẽ vì vậy mà ngƣời Việt trẻ hơn, đẹp hơn so
với ngƣời cùng lứa tuổi của các châu lục khác.
Theo sự phát triển của đời sống xã hội, nhiều nhà dinh dƣỡng học của Việt Nam
cũng nhƣ của thế giới nghiên cứu về khẩu phần thức ăn cho nguời Việt Nam đã
tính rằng hàng ngày chúng ta cần khoảng 2300 – 2500 calo năng lƣợng để sống và
hoạt động. Để có đƣợc năng lƣợng này, nhu cầu tiêu dùng rau hằng ngày trung
bình cho một ngƣời phải vào khoảng 250 – 300 g (tức là khoảng 7,5 – 9 kg/ngƣời
mỗi tháng). Còn nghiên cứu của nhà khoa học Pháp, ông Dorolle từ năm 1942 đã
tính là khoảng 360 g/ngày (tức là khoảng 10,8 kg/một tháng cho mổi ngƣời). Theo
các số liệu thống kê thì hiện nay tính bình quân chung cả nƣớc chúng ta mới sản
xuất đƣợc khoảng 4 – 5 kg/ngƣời mỗi tháng (không tính phần sản xuất tự túc trong
dân) (Nguyễn Văn Thắng và Trần Khắc Thi, 1996).
Nhƣng tác dụng của rau không phải là bảo đảm số calo chủ yếu trong khẩu phần
dinh dƣỡng mà là cung cấp đủ chất xơ (xenlulo) để kích thích hoạt động của nhu mô
ruột và các sinh tố (vitamin) cho cơ thể.
Ở phía nam nƣớc ta, cải ngọt đƣợc trồng nhiều ở các tỉnh nhƣ: Tp HCM, Đồng Nai,
Lâm Đồng, Long An. Cùng các loại rau khác, cải ngọt đã mang lại nhiều lợi ích thiết
thực cho đời sống con ngƣời nhƣ cung cấp rau tƣơi, bổ sung nguồn dinh dƣỡng, chất
xơ cũng nhƣ các loại vitamin. Trong một vài năm trở lại đây, do tốc độ đô thị hóa diễn 2
ra nhanh, các khu công nghiệp tập trung số lƣợng lớn công nhân, do vậy nhu cầu
lƣợng rau xanh hàng ngày rất lớn. Chính vì vậy, cây cải ngọt (Brassica chinensis L.)
3
1.2.2. Yêu cầu
- Thu thập mẫu bệnh phẩm tại các vùng trồng rau Củ Chi, quận 12, Hóc Môn.
- Phân lập vi sinh vật từ mẫu bệnh phẩm.
- Chủng bệnh trên cây rau cải trồng trong nhà lƣới.
- Chọn lọc các dòng vi khuẩn gây bệnh trong số các dòng thu thập đƣợc dựa
vào kết quả chủng bệnh.
- Ly trích DNA và thực hiện phản ứng PCR định danh tác nhân gây bệnh.
- Đọc trình tự vùng 16S – 23S rDNA.
Chƣơng 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Tổng quan nghiên cứu ngoài nƣớc
2.1.1. Lịch sử phát hiện và sự phân bố
khu vực nhƣ: Queensland, Nam Úc, Tây Úc. Ngoài ra, bệnh cũng đƣợc ghi nhận là đã
có mặt Cook Islands, Fiji New Caledonia, New Zealand, Norfolk Island, Papua New
Guinea, Tonga. 5
Nhƣ vậy, chúng ta thấy rằng đây là bệnh phân bố khá rộng rãi, hầu nhƣ chúng
có mặt ở hầu hết các quốc gia trên thế giới.
2.1.2. Tác nhân và triệu chứng bệnh
Theo Lowell L. Black (2000), bệnh do vi khuẩn Xanthomonas campestris pv.
armoraciae gây nên. Bệnh xuất hiện trên tất cả các loại cây trồng thuộc họ thập tự và
một số giống cải hoang.
Triệu chứng chính của bệnh là đốm trên lá thật, đôi khi bệnh cũng xuất hiện trên lá
mầm, bông, cuống lá và bắp của cây cải bắp. Các đốm nhỏ xuất hiện trên bề mặt lá do
sự xâm nhiễm qua lỗ khí khổng của vi khuẩn hoặc rìa mép lá do quá trình xâm nhiễm
qua lỗ thủy khổng. Vết bệnh ban đầu là các lỗ nhỏ sũng nƣớc, về sau khi triệu chứng
bệnh điển hình, đƣờng kính vết bệnh có thể lên đến 3 mm và có dạng hình tròn.
Bao quanh vết bệnh là vành màu nâu sáng, khi bệnh già ở giữa có vùng hoại tử màu
trắng. Vết bệnh trên gân, cuống lá thƣờng có dạng sọc đen dài.
Youfu Zhao và ctv (2000, 2002) đã phân lập các vi khuẩn gây bệnh đốm lá trên các
cây trồng họ thập tự ở Oklahoma (cải bắp, cải rổ, cải củ, cải thìa) là Xanthomonas
campestris pv. armoraciae, Xanthomonas campestris pv. campestris, Pseudomonas
syringae pv. maculicola. Trong đó hai loài vi khuẩn Xanthomonas campestris
pv. armoraciae, Xanthomonas campestris pv. campestris là những tác nhân quan
trọng. những vi khuẩn này cùng tồn tại và phát triển trên đồng ruộng.
Vi khuẩn Xanthomonas campestris pv. campestris thuờng gây triệu chứng cháy lá
chữ V (V – shape), đôi lúc cũng có triệu chứng đốm lá, nếu xâm nhiễm qua lỗ thủy
khổng. Vi khuẩn Xanthomonas campestris pv. armoraciae gây triệu chứng đốm lá.
Đối với bệnh đốm lá do vi khuẩn Pseudomonas syringae pv. maculicola gây triệu
chứng đốm lá, vết bệnh thƣờng không định hình, kích thƣớc vết bệnh khoảng 2 mm,
Bệnh đốm lá vi khuẩn họ thập tự phân bố rộng rãi, gây hại nhiều loại cây trồng có
giá trị kinh tế cao. Ở Oklahoma, hàng năm có khoảng 600 ha rau bị bệnh tấn công.
Bệnh làm giảm năng suất và chất lƣợng của một số loại rau ăn lá họ thập tự. Từ 1994
đến 1996 bệnh làm thiệt hại hoàn toàn những cánh đồng trồng cải rổ, cải xanh, củ cải ở
bang này (Youfu Zhao và ctv, 2000).
Theo CPC (2001), bệnh đốm lá họ thập tự là bệnh quan trọng gây tổn thất đáng
kể về năng suất cũng nhƣ chất lƣợng. Bệnh là đối tƣợng nguy hiểm cho cây trồng họ
thập tự ở các bang phía bắc nƣớc Mỹ. Trong những năm 1960 và 1970, bệnh gây hại
rất nặng rên cánh đồng trồng cải bắp của bang Texas. Năm 1972 và 1973, bệnh đã gây
thành dịch cho các khu vực Đông – Bắc, và các bang phía tây nƣớc Mỹ, khoảng 70%
cây con lấy từ típ ƣơm cây đều bị nhiễm bệnh, sự thiệt hại này ƣớc tính là khoảng 7
1 triệu USD. Ở Canada, trong vụ Đông 1979 – 1980, bệnh gây tổn thất khoảng 60%
sản lƣợng cải bắp.
Ở miền nam tỉnh Buenos Aires – Argentina, tỷ lệ bệnh đốm lá cây canola (Brassica
napus) trung bình koảng 59%, những năm bệnh nặng, tỷ lệ bệnh khoảng 90% và làm
thất thoát khoảng 20% năng suất (S. Geatan, N. Lopez, 2005).
Các loài gây bệnh thuộc giống Xanthomonas spp. Là vi khuẩn gây tổn thất kinh tế
nặng nề nhất trên các cây trồng họ thập tự nhƣ cải bông, cải bắp, cải xanh
(J.G. Vicente và ctv, 2006).
2.1.4. Sinh lý, sinh thái và điều kiện phát triển bệnh.
Vi khuẩn Xanthomonas campestris pv. armoraciae tồn tại trong tàn dƣ cây trồng ở
trong đất, nhƣng không sống trong đất sau khi tàn dƣ cây trồng bị phân hủy. Vi khuẩn
cũng có thể tồn tại trên cây cỏ, hạt giống. Bệnh phát triển mạnh khi có ẩm độ lá cao
(trên 85%), khoảng nhiệt độ thích hợp để bệnh phát triển tƣơng đối rộng 20 – 30
o
C.
Trong điều kiện thời tiết có sƣơng hoặc mƣa liên tục kết hợp với nhiệt độ cao là điều
chứng bệnh xuất hiện chậm. Triệu chứng bệnh không thể hiện rõ khi nhiệt độ dƣới
18 – 20
o
C. Vi khuẩn có thể sống sót trên bề mặt lá đến 73 ngày sau khi lá đƣợc chủng
bệnh bằng phƣơng pháp phun (Schultz và Gabrielson, 1986). Vi khuẩn có thể lây lan
từ cây này qua cây khác nhờ gió, mƣa và công cụ lao động.
2.1.5. Hình thái, đặc điểm sinh lý, sinh hóa của vi khuẩn gây bệnh
Các loài vi khuẩn gây bệnh thuộc giống Xanthomonas thƣờng có phản ứng Gram
âm, háo khí, tế bào hình gậy (0,4 – 0,7 x 0,7 – 1,8 μm), tiêm mao đơn cực, không sản
sinh nitrates, phản ứng catalase dƣơng tính, tạo axít yếu từ các nguồn carbonhydrate.
Khuẩn lạc có màu vàng, nhầy, lồi và bóng trên môi trƣờng NGA và YDC agar.
Đối với các loài Xanthomonas, khuẩn lạc có thể mọc và phát triển ở nhiệt độ 35
o
C,
hóa lỏng gelatin, không tạo urease, sản sinh axit từ arabinose, glucose và manose
(N.W. Schaad, 1998).
2.1.6. Phƣơng pháp phân lập tác nhân gây bệnh
Theo Youfu Zhao (2000), đối với bệnh đốm lá họ thập tự do vi khuẩn thuộc giống
Xanthomonas, việc ly trích vi khuẩn tốt nhất từ các đốm lá mới bị nhiễm bệnh.
Sát trùng bề mặt bằng sodium hypochlorite 0,25% trong 30 giây, đốm bệnh đƣợc cắt
nhỏ trong giọt nƣớc tiệt trùng và cấy zích zắc dịch khuẩn lên môi trƣờng nutrient agar
(NA). Đĩa cấy ủ trong 28
o
C, sau 3 – 5 ngày đem quan sát khuẩn lạc. Chọn các khuẩn
lạc màu vàng, mọc tách rời để nghiên cứu.
Theo CPC (2001), vi khuẩn gây bệnh thực vật giống Xanthomonas có thể đƣợc
phân lập từ rìa vết bệnh (phần tiếp giáp giữa mô bệnh và mô khỏe ). Vi khuẩn đƣợc
cấy trên môi trƣờng Yeast dextrose calcium carbonate (YDC), Beef peptone agar + 5%
water soluble starch.
Để đánh giá sự đa dạng di truyền các dòng vi khuẩn Xanthomonas
campestris gây bệnh đốm lá trên cây họ thập tự, Youfu Zhao và ctv (2000) đã sử dụng
kỹ thuật rep-PCR với BOX primer BOXAIR [5’ –
campestris
carotae
Translucens
phaseoli
pruni
vesicatoria
oryzae
malvacearum
M
anihotis
Begoniae
pelamgonii
fragaria
Môi trƣờng
–
–
–
V
–
–
V
–
+
V
+
SM
+
V
–
+
+
V
–
V
+
–
V
+
–
(+)
V
+
MXP
–
–
–
V
+
–
+
+
(+)
+
+
XCS
V
–
+
V
+
(+
)
ND
+
V
+
+
+
Tween Bảng 1.1 Sự
phát triển của một số loài vi khuẩn
sau khi phân lập đƣợc tiến hành phân tích sinh hóa; chủng bệnh bằng phƣơng pháp
châm kim tạo vết thƣơng, lây nhiễm trên lá mầm, phun dịch khuẩn trên cây trƣởng
thành. Acit béo đƣợc methyl hóa, ly trích và phân tích bằng máy sắc ký khí. Vi khuẩn
đƣợc xác định bằng kỹ thuật ELISA gián tiếp sử dụng kháng thể đơn dòng đặc hiệu.
Các dòng vi khuẩn sau khi xác định đƣợc tiến hành phân tích genomic fingerprinting
bằng kỹ thuật rep – PCR với primer
BOXAIR (5’ – CTACggCAAggCgACgCTgACg – 3’)
và REP – PCR dùng cặp primer:
REP 1R (5’ – IIIICgICgICATCIggC – 3’)
REP 2I (5’ – ICgICTTATggCCTAC – 3’).
Young Jin Park và ctv (2004) đã thực hiện nghiên cứu phát hiện vi khuẩn
Xanthomonas campestris pv. campestris bằng kỹ thuật PCR dựa trên cặp primer
XCF (5’ – CGATTCGGCCATGAATGACT – 3’) và
XCR (5’ – CTGTTGATGGTGGTCTGCAA – 3’) đƣợc thiết kế từ gen hrpF
của vi khuẩn Xanthomonas campestris pv. campestris để khuếch đại đoạn DNA có 12
kích thƣớc 535 bp. Nhóm nghiên cứu đã tiến hành thực nghiệm chứng minh tính
chuyên biệt và đặc hiệu của primer XCR, XCF bằng cách thực hiện phản ứng PCR
với nhiều thành phần hóa chất mà máy luân nhiệt khác nhau. Ngoài ra, kỹ thuật
DNA dot – blot cũng đƣợc thực hiện nhằm kiểm chứng sự hiện diện của gen hrpF
trong vi khuẩn, qua đó rút ra kết luận về sự bảo toàn của gen này.
2.2. Tổng quan nghiên cứu trong nƣớc
Cho đến nay, những nghiên cứu về bệnh đốm lá họ thập tự nói chung và cây cải
ngọt nói riêng còn khá ít. Theo Lê Lƣơng Tề và Vũ Triệu Mân (1999), bệnh đốm lá
súp lơ là do vi khuẩn Pseudomonas syringae pv. maculicola gây nên. Bệnh đƣợc phát
hiện lần đầu tiên ở Mỹ vào năm 1911. Triệu chứng bệnh trên các lá thật thƣờng là các
đốm nhỏ, tròn, góc cạnh, màu nâu tím hoặc đen. Trên lá mầm xuất hiện các đốm trong
giọt dầu, mép lá uốn cong. Đƣờng kính vết bệnh từ 1 – 3 mm.
13
trên cải bắp, cải bông vùng Củ Chi, Hóc Môn, Bình Chánh. Bệnh cũng thƣờng xuất
hiện trong vụ đông – xuân, khoảng từ tháng 11 – 2.
Trong giống Xanthomonas spp. có một loài gây bệnh đốm lá cải bông đƣợc phát
hiện trong năm 1998 ở vùng rau Vĩnh Lộc B, Bình Chánh, Tp. HCM. Triệu chứng
bệnh ban đầu là các đốm nhỏ vàng sáng ở các lá thấp gần mặt đất, các đốm này trông
gần giống với đốm do bọ nhảy gây hại. Bệnh thƣờng nặng hơn vào giai đoạn cuối vụ.
Tỷ lệ bệnh giai đoạn phát triển thân lá khoảng 21%, nhƣng ở giai đoạn ra bông , bệnh
có thể lên tới 50% (Mai Thị Vinh, 1998).
Nhìn chung, số công trình nghiên cứu về tác nhân cũng nhƣ các đặc tính sinh học,
sinh lý, sinh hóa, dịch tễ học của bệnh đốm lá cải ngọt nói riêng và bệnh đốm lá cây họ
thập tự nói chung ở Việt Nam còn khá ít.
2.3. Vùng 16S – 23S rDNA ITS (rDNA intergenic spacer) và gen hrpF
(hypersensitive reaction and pathogenicity)
2.3.1. Gen hrpF (hypersensitive reaction and pathogenicity)
Để xâm nhập và gây bệnh trên cây kí chủ, các loài vi khuẩn thƣờng có hệ thống
riêng tiết ra các loại enzyme (pectinases, cellulases, proteases) và các chất độc (Beattie
và Lindow, 1994). Ngoài ra còn có sự tham gia của hệ thống các gen hrp. Gen này
hiện diện trong hầu hết các loài vi khuẩn Gram âm ngoại trừ Agrobacterium
(Lindgren, 1986). Gen này tạo cho vi khuẩn khả năng xâm nhập và nhân sinh khối
trong cây nhiễm (susceptible plant), đồng thời tạo phản ứng siêu nhạy cảm
(hypersensitive reaction) ở cây kháng (resistant plant). Phản ứng siêu nhạy cảm là một
đáp ứng phòng vệ của cây kí chủ, thể hiện bằng sự hoại tử ở mô bị nhiễm (Klement,
1982). Tổ hợp gen này bao gồm 21 gen và 2 gen điều tiết là hrpX, hrpG nằm bên
ngoài. Các gen hrp mã hóa các protein hrp. Các protein này là thành phần của hệ
thống phóng tiết loại III (type III secretion system) cho phép tiết ra các loại protein
gây độc (Van Gijsegem, 1993 và Van den Ackerveken, 1996).
2. 3.2. Ribosome DNA (rDNA)
Copyright: Tài liệu đại học ©