BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
PHÂN LẬP NẤM Fusarium moniliforme GÂY BỆNH
LÖA VON VÀ XÁC ĐỊNH DÕNG NẤM TẠO GIBERELIN
Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Niên khoá: 2003 - 2007
Sinh viên thực hiện: DIỆP TUYẾT CHÂU
Giáo viên hƣớng dẫn Sinh viên thực hiện
TS. LÊ ĐÌNH ĐÔN DIỆP TUYẾT CHÂU
Thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 09/2007
i
LỜI CẢM ƠN
Xin chân thành cảm ơn:
Ban Giám Hiệu trường Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh đã tạo mọi
điều kiện cho tôi trong suốt thời gian học tập tại trường.
Các thầy cô trong Bộ môn Công nghệ sinh học cùng các thầy cô trực tiếp
giảng dạy luôn tận tình hướng dẫn, giảng dạy, giúp đỡ và động viên tôi trong suốt
bốn năm qua.
TS. Lê Đình Đôn không những đã tận tình hướng dẫn, dạy dỗ con trong
trong nghiên cứu khoa học mà thầy còn dạy con nhiều bài học quí giá trong cuộc
sống. Những lời thầy nói, thầy dạy là những bài học mà con sẽ nhớ mãi.
Anh Nguyễn Kinh Long, Nguyễn Văn Lẫm đã giúp đỡ, động viên, chia sẽ
những vui buồn trong suốt quá trình thực hiện đề tài.
Chị Vy, chị Kiều và chị Vân ở phòng Bảo Vệ Thực Vật (Phòng 118, 105)
khu Phượng Vỹ Trường Đại học Nông Lâm TP.HCM đã nhiệt tình giúp đỡ tôi vượt
qua giai đoạn đầu của quá trình thực hiện đề tài.
cho cây lúa phát triển cao lên là do giberelin nên chúng tôi tiến hành các nghiên cứu sau:
Phân lập và tách đơn bào tử các dòng nấm Fusarium moniliforme gây bệnh
lúa von trên các ruộng lúa ở một số tỉnh Đồng Bằng Sông Cửu Long.
Phát hiện vùng gen tef của nấm Fusarium moniliforme bằng kỹ thuật PCR.
Nuôi cấy các dòng nấm Fusarium moniliforme trong môi trường sản xuất
GA
3
và định tính GA
3
bằng TLC.
Các kết quả đạt được:
Phân lập được 20 dòng nấm Fusarium moniliforme gây bệnh lúa von.
Khuếch đại thành công vùng tef của 14 dòng nấm bằng cặp mồi ef1-ef2
bằng kỹ thuật PCR.
Trong 20 dòng nấm, chưa phát hiện được dòng nào sản xuất GA
3
trong môi
trường 20% ICI bằng TLC.
iii
SUMMARY
The title of graduation thesis is “Isolation the causal agent of bakanae
disease, Fusarium moniliforme, and identification isolates’ production of
gibberellin”. This thesis was conducted by Dr. LE DINH DON from 03/2007 to
08/2007 at Nong Lam university.
In recent years, bakanae disease has broken out and caused the loss of yields.
In order to understand clearly the fungi causing bakanae disease in different
geographic regions in Mekong Delta, we based on symptoms and morphological
characteristics to isolate 20 samples. However, one of the greatest impediments to
2.1.1 Phân bố và thiệt hại ......................................................................................... 3
2.1.2 Triệu chứng ..................................................................................................... 3
2.1.3 Tác nhân .......................................................................................................... 5
2.1.4 Hình dạng và kích thước ................................................................................. 6
2.1.5 Đặc tính sinh lý ............................................................................................... 6
2.1.6 Điều kiện phát sinh và phát triển .................................................................... 7
2.2 Đại cương về nấm Gibberella fujikuroi ............................................................. 8
2.2.1 Phân loại học ................................................................................................... 8
2.2.2 Sơ lược về Gibberella fujikuroi ...................................................................... 8
2.2.3 Sinh tổng hợp giberelin ở Gibberella fujikuroi .............................................. 9
2.3 Giới thiệu về gen tef ......................................................................................... 10
2.4 Tổng quát về giberelins .................................................................................... 11
2.4.1 Đại cương về các chất giberelins .................................................................. 11
2.4.2 Chức năng và vai trò sinh hóa ....................................................................... 13
v
2.4.2.1 GAs kích thích sự phát triển thân ở những cây lùn và cây hoa thị ............ 13
2.4.2.2 GAs điều hòa sự chuyển hóa cây con sang giai đọan trưởng thành .......... 14
2.4.2.3 GAs ảnh hưởng giai đọan bắt đầu ra hoa và sự xác định giới tính ............ 14
2.4.2.4 GAs đẩy mạnh “fruit set” ........................................................................... 14
2.4.2.5 GAs thúc đẩy sự nảy mầm của hạt ............................................................. 14
2.4.3 Ứng dụng GAs trong thương mại ................................................................. 15
2.4.3.1 Trong trồng trọt .......................................................................................... 15
2.4.3.2 Sản xuất bia ................................................................................................ 15
2.4.3.3 Tăng sản lượng mía .................................................................................... 15
2.4.3.4 Sử dụng trong chọn giống thực vật ............................................................ 16
2.5 Sắc ký lớp mỏng .............................................................................................. 16
2.5.1 Tổng quát về sắc ký lớp mỏng ..................................................................... 16
2.5.2 Ưu điểm của sắc ký lớp mỏng ...................................................................... 20
2.5.3 Một số ứng dụng thông thường của TLC ...................................................... 20
3.4.3 Phương pháp trích GA
3
................................................................................. 30
3.4.4 Định tính GA
3
bằng TLC ............................................................................. 31
Chƣơng 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .......................................................... 32
4.1 Kết quả thu mẫu bệnh lúa von ở ĐBSCL ....................................................... 32
4.2 Kết quả phân lập và tách đơn bào tử ................................................................ 33
4.3 Kết quả nhân sinh khối .................................................................................... 35
4.4 Kết quả ly trích và tinh sạch DNA của nấm ................................................... 36
4.5 Kết quả PCR .................................................................................................... 38
4.6 Kết quả định tính GA
3
bằng TLC .................................................................... 39
Chƣơng 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ............................................................... 41
5.1 Kết luận ............................................................................................................ 41
5.2 Đề nghị ............................................................................................................. 41
TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................... 42
PHỤ LỤC
vii
DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
WA: water agar.
viii
DANH SÁCH CÁC HÌNH, SƠ ĐỒ, BẢNG
Hình 2.1 Ruộng lúa ở Trà Vinh bị nhiễm bệnh lúa von .............................................. 4
Hình 2.2 Bào tử nấm trên thân lúa bệnh ..................................................................... 5
Hình 2.3 Chu kỳ gây bệnh của nấm Fusarium moniliforme ...................................... 5
Hình 2.4 Cấu tạo axít giberelic ................................................................................ 11
Hình 2.5 Cấu tạo ent-Kaurene ................................................................................... 11
Hình 2.6 Cấu tạo ent-Gibberellane............................................................................ 12
Hình 2.7 GA
3
kích thích cây bắp cải ra hoa và phát triển cao ................................. 13
Hình 2.8 Ảnh hưởng của GA
3
đến giống nho không hạt của Thompson ................. 15
Hình 2.9 Sơ đồ các bước thực hiện TLC .................................................................. 19
Hình 4.1 Ruộng lúa bị nhiễm bệnh lúa von ở Càng Long – Trà Vinh ..................... 33
Hình 4.2 Mẫu bệnh sau 3 ngày ủ trên môi trường WA ............................................ 33
Hình 4.3 Khuẩn lạc nấm Fusarium moniliforme sau 7 ngày cấy ............................. 34
Hình 4.4 Màu khuẩn lạc trên môi trường PDA sau 7 ngày cấy ................................ 34
Hình 4.5 Đại bào tử Fusarium moniliforme ............................................................. 35
Hình 4.6 Tiểu bào tử Fusarium moniliforme ........................................................... 35
Hình 4.7 Kết quả ly trích DNA theo qui trình 1 ....................................................... 36
Hình 4.8 Kết quả ly trích DNA của 20 dòng nấm theo qui trình 2 ........................... 37
Hình 4.9 Sản phẩm PCR vùng tef ............................................................................. 39
Hình 4.10 Kết quả sắc ký .......................................................................................... 40
Sơ đồ 2.1 Con đường sinh tổng hợp GA
Đông Xuân ở các tỉnh Đồng Bằng Sông Cửu Long, đặc biệt trên đồng ruộng An
Giang. Theo thống kê của chi cục BVTV An Giang trong tháng 02/2007 toàn tỉnh
có hơn 8000 ha lúa bị nhiễm lúa von trên các trà lúa đang từ đẻ nhánh đến đang làm
đòng () và đã làm giảm năng suất đáng kể.
Bệnh lúa von đã được những nhà khoa học Nhật mô tả cách đây hơn 100
năm nhưng vẫn chưa xác định rõ các loài Fusarium gây triệu chứng của bệnh lúa
von như thối gốc và ngọn, cây lúa phát triển cằn cỗi, triệu chứng thường thấy nhất
là cây lúa cao lên đột biến do nấm tạo giberelin gây ra. Các nhà nghiên cứu Nhật đã
xác định tác nhân gây bệnh là “Fusarium moniliforme” tuy nhiên hiện nay tên gọi
này bao gồm nhiều loài khác nhau bây giờ được gọi chung là phức hệ loài
2
Gibberella fujikuroi (Gibberella fujikuroi species complex). Sự hình thành giai
đoạn hữu tính Gibberella chỉ ra sự khác biệt các quần thể giao phối hay các loài
sinh học trong nhóm này (A. E. Desjardins và ctv., 2000). Từ đó, để hiểu rõ hơn về
nấm Fusarium moniliforme gây bệnh lúa von trên các ruộng lúa ở Đồng Bằng Sông
Cửu Long và nhằm xác định tác nhân làm cho cây lúa cao vống lên là giberelin nên
chúng tôi đã tiến hành đề tài nghiên cứu “Phân lập nấm Fusarium moniliforme
gây bệnh lúa von và xác định dòng nấm tạo giberelin”.
1.2 Mục tiêu và nội dung nghiên cứu
1.2.1 Mục tiêu nghiên cứu
Tiến hành các nghiên cứu để xác định các dòng nấm gây bệnh lúa von và tác
nhân làm cho cây lúa cao đột biến là giberelin từ đó là cơ sở để chọn ra các dòng
nấm tạo nhiều giberelin nhất để tiến hành nuôi cấy, lên men sản xuất giberelin.
1.2.2 Nội dung nghiên cứu
Phân lập và tách đơn bào tử các dòng nấm Fusarium moniliforme gây bệnh
lúa von trên các ruộng lúa ở một số tỉnh Đồng Bằng Sông Cửu Long.
Phát hiện vùng gen tef của nấm Fusarium moniliforme bằng kỹ thuật PCR.
Nuôi cấy các dòng nấm Fusarium moniliforme trong môi trường sản xuất
GA
4 Ghi chú: Các mũi tên chỉ cây lúa bị nhiễm bệnh.
Yamanaka và Honkura (1978) đã phân ra có 5 loại triệu chứng.
Vươn dài.
Vươn dài sau đó phát triển bình thường.
Vươn dài sau đó bị còi cọc.
Cây bị còi cọc.
Cây không phát triển.
Trên lúa bệnh phát sinh từ khi bắt đầu đẻ nhánh đến có đòng. Những cây bị
bệnh nặng sinh ra các rễ phụ ở đốt thân, đôi khi xuất hiện lớp sợi nấm màu trắng
hay màu hồng ở các đốt phía dưới, đó là khuẩn ty và bào tử của nấm, lớp mốc này
lan dần lên trên khi cây chết. Nấm có thể thành lập quả nang bầu trên cây bệnh nếu
điều kiện thuận lợi. (Nguồn )
Hình 2.3 Chu kỳ gây bệnh của nấm Fusarium moniliforme.
6
2.1.4 Hình dạng và kích thƣớc
Giai đoạn quả tử nang của Gibberella fujikuroi có hình khối cầu hay bầu dục,
mặt ngoài xù xì, có màu xanh đậm trong chứa các bào tử nang có một vách ngăn,
250 – 330 x 220 – 280 (190 – 390 x 160 – 420) m; nang có dạng hình trụ, phần
trên hơi rộng hơn, 90 – 102 x 7 – 9 (66 – 129 x 7 – 14) m, chứa 4,6 và có khi đến 8
bào tử, một dãy hay hai hàng không rõ; nang bào tử có 1 vách ngăn, khoảng
15 x 5,2 m (đa số là 14 – 18 x 4,4 – 7 m) có khi lớn 27 – 45 x 6 – 7 m (nếu nang
chỉ chứa một bào tử) (S.H.Ou, 1985).
Giai đoạn phân sinh bào tử của Gibberella fujikuroi có hai dạng bào tử là
tiểu bào tử và đại bào tử. Tiểu bào tử có hình trứng dẹt, không có hay có một vách
ngăn, thường xếp thành chuỗi, sau đó rời nhau và phân tán thành lớp bột trắng trên
nền khuẩn ty trắng vàng hay trắng hồng. Còn đại bào tử thanh mảnh, hai đầu nhọn,
hơi cong hình lưỡi liềm hay gần thẳng có một cái móc ở đỉnh, màu xanh vàng nhạt
có 3 – 5 vách ngăn (S.H.Ou, 1985).
Nấm không có bào tử chống chịu, có hay không có hạch nấm hình cầu, màu
xanh đậm, kích thước 80 – 100 m.
Số vách ngăn của bào tử, việc thành lập tiểu bào tử, đại bào tử và hạch nấm
của nấm gây bệnh cũng rất thay đổi.
2.1.5 Đặc tính sinh lý
Theo S.H.Ou (1985) nấm dễ nuôi cấy trên nhiều loại môi trường, thường
dùng dung dịch của Richard và Knop. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự phát triển của
sợi nấm được nhiều người nghiên cứu, nhiệt độ tối ưu cho nấm phát triển là
Nếu nhiễm nặng hạt sẽ có màu đỏ và mạ mọc lên sẽ bị lùn. Các hạt nảy mầm sẽ
sinh ra cây mạ bị von. Từ những cây mạ bị bệnh, bào tử nhờ gió và nước lan truyền
xâm nhiễm cho cây khác. Nấm phát triển trong cây phá hủy tế bào cây, đồng thời
những chất do chúng tiết ra tạo nên triệu chứng điển hình của cây lúa bị bệnh. Một
số hạt giống không bị biến màu vỏ cũng có thể mang nguồn nấm. Trên hạt giống
bảo quản khô ráo nấm tồn tại tới 3 năm.
Ngoài ra nấm còn tồn tại trong đất, tuy thời gian không lâu. Một thí nghiệm
ở Thái Lan (Kanjanosoon, 1965) cho thấy đất sau khi lây nhiễm nấm cho số cây
bệnh là 93%, sau đó tỉ lệ bệnh giảm dần, tới 90 ngày chỉ còn 0,7% và sẽ không có
cây bệnh nếu để sau 6 tháng. Đại bào tử hay khuẩn ty vách dày của nấm cũng sống
được 4 tháng trong đất (S.H.Ou, 1985).
Trên hạt và thân lúa nhiễm, nấm có thể sống 4 – 10 tháng ở nhiệt độ phòng,
nếu trữ lạnh ở 7 C nấm có thể sống hơn 3 năm.
8
2.2 Đại cƣơng về nấm Gibberella fujikuroi (giai đoạn vô tính là
Fusarium moniliforme)
2.2.1 Phân loại học
Ngành: Ascomycota
Ngành phụ: Pezizomycotina
Lớp: Sordariomycetes
Lớp phụ: Hypocreomycetidae
Bộ: Hypocreales
Họ: Nectriaceae
Giống: Gibberella
Loài: Gibberella fujikuroi complex
2.2.2 Sơ lƣợc về Gibberella fujikuroi
Năm 1931, Wollenweber đặt tên cho giai đoạn vô tính của nấm gây bệnh lúa
von là Fusarium moniliforme (Sheldon) và giai đoạn hữu tính là Gibberella
fujikuroi (Saw.) Wr. (B. Tudzynski, 1999)
12
-7-aldehyde dưới sự xúc tác của các
enzyme cytochrome P450 monoxygenases.
Bước 3: qua nhiều bước GA
12
-7-aldehyde sẽ tổng hợp thành GA
3.
(Nguồn www.aseanbiodiversity.info)
10
2.3 Giới thiệu về gen tef (translation elongation factor 1- )
Theo A.R.Pokalsky và ctv (1989), gen tef là gen mã hóa cho protein EF-1 .
EF-1 là một chuỗi polypeptide có vai trò quan trọng trong sự kéo dài chuỗi
polypeptide ở sinh vật nhân thật (eukaryotes). EF-1 xúc tác việc gắn nhóm
aminoacyl tRNAs vào vị trí A của ribosome, phản ứng này đòi hỏi GTP. EF-1 có
(Lincoln Taiz và ctv., 2002)
Sau đó, năm 1956 ở Anh, J MacMillan lần đầu tiên đã tách thành công được
giberelin từ hạt đậu Phaseolus vulgaris. Từ đó đến nay, người ta đã tách được
những giberelin khác nhau trên nhiều loài cây.
Ví dụ: Ở cây lúa chứa 14 loại giberelins, hạt ngô chứa 12 giberelins và
lúa mì chứa 5 giberelins (Đào Văn Hoằng, 2005).
Đặc điểm cấu trúc của tất cả giberelins có điểm chung là chúng được chuyển
hóa từ ent-kaurene: Hình 2.4 Cấu tạo axít giberelic.
Hình 2.5 Cấu tạo ent-Kaurene.
(Lincoln Taiz và ctv., 2002) 12 Sau khi axít giberelic đã được tìm hiểu khá rõ, các nhà thực vật học bắt đầu
khảo nghiệm nó trên nhiều loài cây khác nhau. Có những phản ứng kì lạ được thấy
ở sự tăng trưởng của những cây lùn và thực vật hoa thị (rosette plants), đặc biệt ở
cây đậu Hà Lan lùn (Pisum sativum), cây ngô lùn (Zea mays) và nhiều cây hoa thị.
(Lincoln Taiz và ctv., 2002)
13
loại GAs trong cây nhưng chỉ có một vài GAs có hoạt tính như một hormon, tất cả
những loại khác ở dạng tiền chất hay dạng bất hoạt.
2.4.2 Chức năng và vai trò sinh hóa (Lincoln Taiz và ctv., 2002)
Mặc dù GAs được phát hiện đầu tiên là nguyên nhân gây ra bệnh lúa von
nhưng những GAs nội sinh cũng ảnh hưởng đến nhiều quá trình phát triển của cây.
Ngoài sự kéo dài của thân, GAs còn kích thích quá trình nảy mầm của hạt bao gồm
phá vỡ trạng thái ngủ nghỉ của hạt. Trong quá trình sinh sản của thực vật, giberelin
có thể ảnh hưởng đến sự chuyển từ giai đoạn còn non sang giai đoạn trưởng thành
cũng như bắt đầu ra hoa, xác định phái tính của hoa.
2.4.2.1 Giberelins kích thích sự phát triển thân ở những cây lùn và cây hoa thị
Giberelin được dùng đẩy mạnh sự kéo dài của đốt ở nhiều loài cây. Tuy
nhiên kích thích mạnh nhất được tìm thấy ở những cây lùn và cây hoa thị (rosette
plant) cũng như những cây họ hòa thảo. GA
3
ngoại sinh gây ra sự kéo dài thân ở những cây
lùn bên cạnh đó chúng làm thân cây ốm yếu,
giảm kích thước lá và lá có màu xanh nhạt.
Dùng giberelin giúp thân cây hoa thị
phát triển trong những ngày ngắn và sự phát
triển thân bình thường được điều hòa bởi
giberelin nội sinh. Ngoài ra nhiều cây hoa thị
ngày dài đòi hỏi điều kiện lạnh cho sự phát triển
của than, ra hoa và đòi hỏi này được khắc phục
bởi việc dùng giberelin.
GA cũng đẩy mạnh sự kéo dài của đốt ở
nhiều cây, đặc biệt cây hoa thị do vậy giberelin được dùng để kích thích ra hoa ở
một vài cây.
Ở cây có hoa lưỡng tính thì sự xác định giới tính hoa được điều hòa bởi
giberelin. Tuy nhiên, nó cũng bị ảnh hưởng bởi những nhân tố môi trường như
quang chu kì, dinh dưỡng và các nhân tố này có thể được trung hòa bởi giberelin.
2.4.2.4 Giberelins đẩy mạnh “fruit set”
Dùng GAs có thể gây ra “fruit set” (quả bắt đầu tăng trưởng sau khi thụ
phấn) và sự tăng trưởng của một vài quả mà auxin không có tác dụng.
Ví dụ: giberelin kích thích “fruit set” ở cây táo (Malus sylvestris).
2.4.2.5 Giberelins thúc đẩy sự nảy mầm của hạt
GAs cần cho một hay nhiều bước trong quá trình nảy mầm của hạt. Giberelin
đánh thức quá trình ngủ nghỉ của hạt để bắt đầu nảy mầm. Khi hạt được ngâm vào
nước giberelin được giải phóng, đánh thức và kích thích hạt nảy mầm. Ngoài ra
giberelin còn kích thích sự tạo nhiều hydrolases, đặc biệt -amylase, kích thích tổng
hợp chất truyền tín hiệu RNA cho các men, qua đó nó tác động lên men di truyền.
Như vậy tác dụng sinh học của giberelin rất đa dạng tùy thuộc vào từng loại
giberelin cũng như loài cây.
15 2.4.3 Ứng dụng GAs trong thƣơng mại (Lincoln Taiz và ctv., 2002)
2.4.3.1 Trong trồng trọt
Sử dụng GAs chủ yếu để làm tăng chiều dài cuống của nho không hạt.
Giberelin kích thích cuống phát triển dài hơn vì vậy làm cho quả phát triển lớn hơn
và đẩy mạnh sự kéo dài của quả.
Hỗn hợp benzyladenine (cytokinin) và GA
4
+ GA
7
3
Không xử lý GA
3
Copyright: Tài liệu đại học ©