35

3.4.8 Thiết lập phản ứng tạo blunt-end cho sản phẩm PCR
Theo nguyên tắc của phản ứng PCR, sau khi kéo dài mạch đơn DNA, enzym
Taq polynerase sẽ gắn thêm vào cuối trình tự DNA đơn một hoặc nhiều phân tử
Adenin (polyA) để ổn định trình tự DNA, do đó sau khi phản ứng PCR xảy ra chúng ta
sẽ thu đƣợc sản phẩm là những đoạn DNA đầu dính. Do điều kiện của thí nghiệm phải
thiết lập phản ứng nối đầu bằng giữa plasmid và đoạn DNA từ sản phẩm PCR, chúng
tôi tiến hành thiết lập phản ứng tạo đầu bằng cho đoạn DNA với enzym DNA
polymerase I large fragment (Klenow).

Hình 3.1 Phản ứng tạo đầu bằng (blunt-end) cho đoạn DNA
Thiết lập phản ứng phủ đầu với các thành phần nhƣ sau:
NEbuffer 10X 2µl
DNA từ phản ứng PCR 6µl (1µg)
dNTP
s
(33µmol) 1µl
DNA fragment Klenow 1 unit (1µl)
Thêm nƣớc cho tới 20µl
Ủ phản ứng ở 25
0
C trong 15 phút, sau đó ngừng phản ứng bằng cách thêm
EDTA đến nồng độ 10mmol và ủ ở 75
0
C trong 20phút.
Thiết lập phản ứng phủ đầu bằng cho plasmid
Plasmid sau khi cắt bằng HindIII, và thực hiện phản ứng phủ đầu bằng theo qui
trình sau:
NEbuffer 10X 2µl
DNA plasmid 6µl (1µg)

không ngừng sắp xếp sản phẩm nối, sự nối bên ngoài phân tử đƣợc ngăn chặn, khi đó
chỉ có phản ứng nối giữa vector-DNA insert và phản ứng nối giữa vector-vector xảy ra.
Từ lượng của vector DNA tính ra lượng của DNA chèn

(ng)DNA chèn =

Căn cứ vào tỉ lệ về số mol giữa vector và DNA chèn rồi dựa vào đó để tính ra
lƣợng DNA cần sử dụng
Thực hiện phản ứng nối với các thành phần nhƣ sau:
T4 reaction buffer 1µl
DNA từ sản phẩm PCR 2µl (100ng)
DNA plasmid 1µl (50ng)
T4 ligase 1 unit
Thêm nƣớc cho tới 10µl
Ủ phản ứng ở 16
0
C qua đêm, tinh sạch trực tiếp sản phẩm bằng cách sử dụng
cột tinh sạch GFX thu lại bằng 3μl elution buffer.
Vector (ng) x DNA chèn (kb)

Vector (kb)

Tỉ lệ DNA chèn (bp)

Vector

X
37

3.4.10 Chuyển sản phẩm nối vào tế bào vi khuẩn E. coli DH5α khả nạp (theo

38

PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1 Các quy trình biến nạp plasmid vào tế bào vi khuẩn

Hình 4.2 Biến nạp plasmid vào tế bào vi khuẩn ở thể tích 3:0.5
(A)Biến nạp với tỷ lệ tế bào khả nạp và plasmid theo thể tích (µl) là 3:0.5 phục
hồi trong 200µl môi trường LB lỏng trong 1giờ, cấy 10 µl (nồng độ pha loãng ½)
dịch phục hồi lên đĩa môi trường LB agar/X-gal/IPTG, ủ qua đêm ở 37

Kết quả biến nạp theo quy trình 2 cho nhiều khuẩn lạc xanh hơn và khuẩn lạc
trắng ít hơn rất nhiều so với biến nạp theo quy trình 1. Nhƣ vậy cho thấy quy trình 2
hiệu quả biến nạp tốt hơn và thể tích biến nạp nhƣ vậy là hợp lí. Khuẩn lạc mọc rời
rạc, dễ cho thao tác chọn khuẩn lạc để cấy chuyền sang môi trƣờng lỏng nhân sinh
khối để li trích đƣợc plasmid.
Kết quả biến nạp theo quy trình 3 cho nhiều khuẩn lạc xanh hơn và cũng cho
nhiều khuẩn lạc trắng hơn so với biến nạp theo quy trình 2. Khuẩn lạc xanh tuy nhiều
nhƣng mọc dày rất khó cho việc chọn khuẩn lạc tăng sinh trong môi trƣờng lỏng.
Nhƣ vậy, qua kết quả chọn lọc thể biến nạp trên môi trƣờng LB agar/Amp/X-
gal/IPTG chúng tôi thấy biến nạp theo quy trình 2 là thích hợp.
4.2 Tách chiết DNA plasmid.
4.2.1 Tách chiết DNA plasmid
Bắt những khuẩn lạc xanh trên môi trƣờng đĩa và tiến hành cấy sang ống
nghiệm chứa 3ml môi trƣờng LB lỏng với nồng độ kháng sinh là 60µg/ml nuôi cấy lắc
ở 37
0
C qua đêm, chọn ống có sinh khối và tiến hành tách chiết plasmid thu đƣợc kết
quả nhƣ sau:

41


Hình 4.3 Sản phẩm tách chiết
plasmid trên gel agarose 1% (lần 1)
DNA
plasmid
3.0kb
Hình 4.4 Sản phẩm tách
chiết plasmid trên gel
agarose 1% (lần 2)
42

Những điểm cần lƣu ý khi chiết tách plasmid
Khi thêm dung dịch II chỉ đảo ngƣợc eppendorf khoảng 5-6 lần sau đó phải
thêm dung dịch III ngay để trung hòa dung dịch II.
Khi thêm dung dịch III vào phải ly tâm ngay nếu không DNA của bộ gen sẽ
phục hồi cấu trúc vì vậy trong sản phẩm plasmid chiết tách sẽ có lẫn DNA của bộ gen.
Ở bƣớc 7 và 8 trong quy trình tách chiết, sau khi ly tâm xong phải lấy ra nhẹ
nhàng và cẩn thận hút phần dịch nổi bên trên không đƣợc hút xuống phần bên dƣới.
4.2.2 Tách chiết DNA plasmid bằng Aurum
TM
Plasmid Mini Kit
Tách chiết plasmid bằng Kit cho hiệu quả tách chiết cao hơn, lƣợng plasmid thu
đƣợc nhiều hơn, tinh sạch hơn, thao tác đơn giản, nhanh. Sản phẩm tách chiết không
cần phải qua bƣớc tinh sạch để sử dụng cho các bƣớc tiếp theo trong quá trình cloning.


trên gel agarose 1%

43 Kết quả ở hình trên cho thấy plasmid đã cắt hoàn toàn đúng kích thƣớc, vector
đã đƣợc mở vòng tại vùng MCS trở thành dạng thẳng, nhƣng chỉ có sản phẩm tách
chiết plasmid ở mẫu đối chứng 1 là đƣợc cắt. Do đó chúng tôi tiến hành phản ứng cắt
lần 2 để kiểm tra hoạt tính cắt của enzyme EcoRV thu đƣợc kết quả nhƣ sau:

Mẫu (1) và (2) sản phẩm tách chiết plasmid đã không bị cắt bởi enzyme EcoRV
trong khi mẫu (3), (4) đƣợc cắt hoàn toàn.
Vì vậy chúng tôi tiến hành phản ứng cắt với enzyme HindIII để kiểm tra sản
phẩm tách chiết có phải là plasmid mong muốn hay không thì thu đƣợc kết quả nhƣ
sau:

trên gel agarose 1% (lần 2)
(DC): sản phẩm đã cắt bằng EcoRV ở
lần 1; (1), (2): sản phẩm cắt bằng
EcoRV; (3), (4): sản phẩm cắt bằng
RsaI.
44

Plasmid đã cắt hoàn toàn và đúng nhƣ kích thƣớc của plasmid đối chứng. Do đó
có thể suy ra rằng, trong quá trình làm thí nghiệm plasmid đã bị hƣ site cắt EcoRV trên
vùng MCS hoặc enyme EcoRV bị giảm hoạt tính nên không thể nhận biết đƣợc vị trí
site cắt EcoRV trên vùng MCS.
Vì vậy để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo chúng tôi quyết định chọn sản
phẩm cắt bằng HindIII, phủ đầu bằng để thực hiện phản ứng nối.
Một số điều cần chú ý khi thực hiện phản ứng cắt
RE sẽ giữ đƣợc hoạt tính trong một dung dịch đệm chứa 50% glycerol nếu luôn
luôn đƣợc bảo quản ở -20
0
C. Khi tiến hành phản ứng thủy giải, chỉ lấy RE ra vào phút
chót sau khi đã đủ các thành phần khác và giữ trong đá trong thời gian càng ngắn càng
tốt trƣớc khi cất trở lại vào -20
0
C.
Nên tiến hành phản ứng trong một thể tích càng nhỏ càng tốt để tạo thuận lợi
cho sự tiếp xúc enzyme-cơ chất. Tuy nhiên để đảm bảo RE không vƣợt quá 1/10 thể
tích phản ứng vì glycerol ức chế hoạt động enzyme.
4.4 Tinh sạch đoạn DNA và plasmid sau khi cắt bằng HindIII
4.4.1 Tinh sạch đoạn DNA
Trong đề tài này, chúng tôi thực hiện chèn đoạn DNA từ sản phẩm PCR vào
plasmid vì vậy chúng tôi tiến hành phản ứng tạo đầu bằng cho đoạn DNA sau đó tinh
sạch đoạn DNA trên.

buffer phải nhỏ ở giữa cột, từng giọt một, khi rửa hoặc thêm capture buffer nhỏ trên
thành của cột, cân eppendorf trƣớc khi để gel cắt vào, gel phải đƣợc cắt vụn ra sau khi
cân, sau quá trình ủ 60
o
C agarose phải tan hết, sử dụng agarose có nhiệt độ nóng chảy
thấp (low melting agar).
Chuẩn bị trƣớc khi tinh sạch: máy điện di cần đƣợc rửa sạch, bảng gel cần đƣợc
rửa sạch, sử dụng dung dịch dệm TAE riêng, sau mỗi lần chạy điện di thay buffer mới.
Sử dụng ethidium bromide loãng hơn ½ nồng độ thƣờng, phải đựng hộp riêng, phải
thay mới khi nhuộm mẩu, tính toán số mẩu trƣớc khi chạy điện di, đổ gel tƣơng ứng số
mẫu và giữ trong buffer.
4.4.2 Tinh sạch plasmid
Plasmid sau khi dùng enzyme HindIII cắt mở vòng mới tinh sạch.
Kết quả điện di cho thấy sản phẩm sau khi tinh sạch đã loại hết tạp trong sản
phẩm. Hình 4.10 Kết quả điện di sản phẩm
tinh sạch đoạn DNA bằng phƣơng pháp
cắt gel và thu hồi lại bằng cột GFX
(1), (2): sản phẩm PCR kích thước
900bp; (3): ladder 100bp.
Hình 4.11 Kết quả điện di sản phẩm
tinh sạch đoạn DNA bằng phƣơng pháp
cắt gel và thu hồi lại bằng cột GFX
(1): sản phẩm PCR kích thước 223bp;
(2), (3): sản phẩm PCR kích thước
900bp.

46

TS
DC
Hình 4.12 Kết quả điện di sản
phẩm tinh sạch trên gel agarose1%
(DC) plasmid cắt bằng HindIII chưa
tinh sạch; (TS) plasmid cắt bằng
HindIII tinh sạch bằng cột GFX.
Hình 4.13 Biến nạp plasmid tái tổ hợp
(A) Biến nạp plasmid đã chèn đoạn 223bp; (B) Biến nạp plasmid
đã chèn đoạn 900bp; (C) Biến nạp plasmid chưa tái tổ hợp.
C
A
B
47

Kết quả trên có thể là đã biến nạp hoàn toàn plasmid tái tổ hợp vào vi khuẩn
hoặc những khuẩn lạc màu trắng trên là do các tế bào vi khuẩn bị đột biến kháng
kháng sinh tạo thành.
Còn trên đĩa đối chứng xuất hiện cả khuẩn lạc màu xanh và trắng.
4.6 Tách chiết plasmid tái tổ hợp
Chọn lọc những khuẩn lạc trắng, mọc rời rạc cấy sang môi trƣờng LB
lỏng/ampicillin (60µg) nhân sinh khối qua đêm tiến hành tách chiết theo qui trình ở
mục 3.4.6.1. Chạy điện di chỉ thu đƣợc toàn genome của vi khuẩn.
Còn kết quả li trích plasmid của khuẩn lạc xanh trên đĩa đối chứng thì thu đƣợc
DNA plasmid.
Nhƣ vậy biến nạp plasmid tái tổ hợp vào vi khuẩn E. coli DH5α chƣa thành công.
Điều này có thể là do nồng độ plasmid sau khi cắt và nối sử dụng để biến nạp là chƣa phù
hợp, vì chúng tôi đã không thể tính toán đƣợc nồng độ plasmid hao hụt sau khi thực hiện
phản ứng cắt và nối. Hoặc cũng có thể thời gian sốc nhiệt quá ngắn nên plasmid không thể
biến nạp vào tế bào vi khuẩn.

(theo quy trình của Sambrook và cộng sự, 1989 có sửa đổi)
Bắt những khuẩn lạc màu xanh từ đĩa petri cấy sang môi trƣờng LB lỏng có
chứa kháng sinh. Chọn những ống có vi khuẩn phát triển tiến hành chiết tách plasmid
theo quy trình sau
Bƣớc 1: Hút dịch vi khuẩn từ mỗi ống cho vào mỗi eppendorf 1.5 ml, ly tâm để
thu sinh khối ở 10000 vòng/phút trong 5 phút ở 20
0
C
Bƣớc 2: Hút bỏ dịch bên trên, hút dịch vi khuẩn từ các ống nghiệm tƣơng ứng
cho vào, ly tâm 10000 vòng/phút, trong 5 phút ở 20
0
C, lặp lại cho đến
khi hết dịch nuôi cấy trong ống nghiệm.
Bƣớc3: Cho 150 ml dung dịch I vào mỗi eppendorf chứa sinh khối, vortex đến
khi sinh khối vi khuẩn tan ra hết.
Bƣớc 4: Thêm 200 ml dung dịch II, đảo nhanh eppendorf 5-6 lần, sau đó thêm
tiếp 150 ml dung dịch III, đảo nhanh eppendorf 5-6 lần.
Bƣớc 5: Ly tâm 12000 vòng/phút trong 10 phút ở 20
0
C. Thu hết dịch nổi cho
vào eppendorf mới tƣơng ứng.
Bƣớc 6: Cho vào mỗi eppendorf chứa dịch nổi vừa mới thu đƣợc 1µl RNAse, ủ
ở 37
0
C trong1 giờ.
Bƣớc 7: Cho vào mồi eppendorf 300µl phenol/chloroform/isoamylalcohol
(25:24:1) vortex đều, ly tâm 10000 vòng/phút trong 5 phút ở 20
0
C . Thu
dịch nổi cho vào các eppendorf mới tƣơng ứng.

SK(+/-) đã cắt bằng HindIII và đoạn DNA từ phản ứng PCR, giải trình tự sản phẩm
nối trên.
50

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tài liệu tiếng việt
1. Hồ Huỳnh Thùy Dƣơng, 2002, Sinh học phân tử, NXB Giáo Dục.
2. Lê Đình Lƣợng, 2001, Nguyên lý kỹ thuật di truyền, NXB Khoa Học Kỹ Thuật.
3. Nguyễn Đức Lƣợng, Phan Thị Huyền, Lê Thị Thủy Tiên, Huỳnh Ngọc Oanh
và Cao Cƣờng, 2002, Công nghệ gen, NXB Đại Học Quốc Gia TP. HCM.
4. Nguyễn Thị Lang, Bùi Chí Bửu, 2005, Sinh học phân tử - Giới thiệu phương
pháp và ứng dụng, NXB Nông Nghiệp TP. HCM.
5. Phạm Duy, Huỳnh Văn Thái, 2005, Xây dựng quy trình biến nạp đoạn DNA
vào tế bào vi khuẩn E. coli DH5α, Luận văn tốt nghiệp kỹ sƣ Công nghệ sinh
học, Đại Học Nông Lâm TP. HCM.
6. Phạm Thành Hổ, 8-2003, Di truyền học, NXB Giáo Dục.
7. Tô Minh Châu, Vƣơng Thị Việt Hoa, Vũ Thị Lâm An, Lâm Thanh Hiền, Nguyễn
Thị Ngọc Diệp và Nguyễn Thúy Hƣơng, 1999, Vi sinh vật học đại cương, NXB
Đại Học Quốc Gia TP. HCM – Trƣờng Đại Học Nông Lâm TP. HCM.
8. Trần Linh Thƣớc, Đặng Thị Phƣơng Thảo và Nguyễn Đức Hoàng, 2002, Giáo


52

PHỤ LỤC

1. Công thức pha một số môi trƣờng dùng trong thí nghiệm
 Môi trƣờng LB (Luria – Bertain) lỏng
Trytone 10g
Bacto yeast extract 5g
Natrichlorua (NaCl) 10g
Thêm nƣớc cho tới 1000 ml
Hấp khử trùng ở 121
0
c trong 20 phút
 Môi trƣờng LB agar

Dung dịch I
Tris – HCl 25mM pH8
Glucose 50mM
EDTA 10mM
Dung dịch II (nên pha trƣớc khi dùng)
Sodium dodecyl sulfat (SDS) 10% 100 µl
NaOH 5N 40µl
Nƣớc cất 2 lần 860µl
Dung dịch III
Glacial acetic 0.2M
Potassium acetat 0.2M
Dung dịch TE (pH8)
Tris – HCl (pH8) 10mM
EDTA (pH8) 1mM
Dung dịch TAE 1X
Tris – acetat 40mM
EDTA (pH8) 1mM
Loading dye
Bromophenol blue 0.25%
Glycerol trong TAE 1X 40%
Dung dịch Lysozyme:
Hoà tan 10mg trong 1ml dung dich Tris-HCl 10mM pH 8.0.
Dung dịch X-gal 20mg/ml
Cân 20 mg X-gal hoà tan trong 1ml dung dịch dimethylformamide (dung dịch
này rất độc, phải cẩn thận khi thao tác)
Dung dịch IPTG 20mg/ml (stock)
Cân 20 mg IPTG (dạng bột) hoà tan trong 1 ml nƣớc khử ion, sau đó lọc qua
màng lọc có kích thƣớc lỗ 0,2μm
Hình 1 Sơ đồ cấu trúc pBluescript II SK (+/-)
56
Hình 2 Sơ đồ cấu trúc pBluescript II KS (+/-)