1
PHẦN 1. MỞ ĐẦU
1.1 Đặt Vấn Đề
Cách đây hai thập kỷ, nhiều nhà khoa học trên thế giới đã đúng khi nhận thấy việc
sử dụng DNA tái tổ hợp nhƣ là một công cụ hữu hiệu trong việc nâng cao năng suất
cây trồng và chất lƣợng lƣơng thực, thực phẩm đồng thời vẫn thúc đẩy đƣợc một nền
nông nghiệp bền vững. Tiếp theo những nhận định này là hàng loạt những đột phá
trong nghiên cứu khoa học về các phƣơng pháp chuyển gen, trong việc phát hiện và
bảo tồn những gen quý.
Tuy nhiên, việc nghiên cứu và phân tích ở mức phân tử DNA thƣờng gặp khó khăn
lớn về số lƣợng và độ tinh sạch của DNA trong mẫu thí nghiệm. Để giải quyết vấn đề
này, khi nghiên cứu trình tự của một đoạn DNA về sự hoạt đông của gen, sự biểu hiện
ra protein và cấu trúc của protein, ngƣời ta chú trọng tới việc phân lập và thu nhận
đoạn DNA quan tâm và tiến hành tạo ra bản sao với số lƣợng lớn để tiến hành nghiên
cứu. Mặc khác, bộ gen của sinh vật thì rất lớn và phức tạp mà trình tự gen chúng ta
quan tâm thƣờng chỉ có một hay hai bản sao trong mỗi tế bào. Vì vậy chúng ta không
thể sử dụng các phƣơng pháp sinh hoá thông thƣờng để phân lập gen mục tiêu trên bộ
gen.
Những vấn đề trên có thể đƣợc giải quyết khi ta sử dụng các cấu trúc DNA có khả
năng tự sao chép trong tế bào chủ để làm phƣơng tiện mang gen, biến nạp gen, tăng
bản sao của gen, biểu hiện gen hay các thao tác khác trên gen. Các cấu trúc DNA dùng
cho mục tiêu này gọi là vector. Việc biến nạp DNA tái tổ hợp vào một tế bào thích hợp
sẽ cho phép vector có khả năng tồn tại ổn định và sao chép độc lập với bộ gen của tế
bào. Tế bào có khả năng tiếp nhận vector tái tổ hợp gọi là tế bào chủ. Tế bào chủ
thƣờng đƣợc chọn lọc và cải tạo để tạo thành các chủng chủ có kiểu gen và các đặc
tính thuận lợi cho các thao tác trên gen. Chủng chủ mang vector tái tổ hợp gọi là dòng
tái tổ hợp. Dòng tái tổ hợp đƣợc phân lập để lƣu trữ DNA tái tổ hợp hoặc dùng cho các
thao tác trên gen. Toàn bộ quá trình trên gọi là tạo dòng DNA hay DNA cloning. Mục
đích của tạo dòng nhằm thu đƣợc số lƣợng lớn và tinh khiết các trình tự DNA hay thu
Biến nạp plasmid tái tổ hợp vào tế bào.
Kiểm tra thể biến nạp trên môi trƣờng có chứa Ampicillyn, X-gal, IPTG
Kiểm tra lại kết quả biến nạp đoạn gen bằng phản ứng cắt, phản ứng PCR trên
plasmid tách chiết từ thể biến nạp. 3
PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LYỆU
2.1 Hiện tƣợng biến nạp ở vi khuẩn
2.1.1 Hiện tƣợng biến nạp
Biến nạp là hiện tƣợng tiếp nhận DNA từ bên ngoài vào tế bào vi khuẩn. Hiện
tƣợng biến nạp đƣợc chứng minh lần đầu tiên trên vi khuẩn Streptococcus pneumoniae
do Fred Griffiths, năm 1928, sau đó đƣợc kiểm chứng lại bởi Avery và cộng sự năm
1944 (viện Rocketfeller). Chủng vi khuẩn mà Griffiths và Avery sử dụng có trạng thái
khả nạp tự nhiên, chúng có khả năng hấp thu DNA tự nhiên có sẵn ở môi trƣờng sống.
Nguồn DNA này có đƣợc từ các tế bào chết hay các tế bào bị phân hủy. Kết quả thu
đƣợc là vi khuẩn thể hiện một hoặc vài tính trạng mới, tính trạng này ổn định và có
khả năng di truyền.
Từ các nghiên cứu của Griffiths và Avery đã chỉ ra rằng tế bào vi khuẩn phải ở
trạng thái sinh lý đặc biệt mới có khả năng hấp thu DNA, đó là “trạng thái khả nạp”.
Trạng thái khả nạp xuất hiện tự nhiên ở một vài loài vi khuẩn khi mà nồng độ chất
dinh dƣỡng và oxy trong môi trƣờng sống của chúng giảm xuống thấp. Trong thực tế
nghiên cứu biến nạp phải tiến hành xử lý tế bào vi khuẩn để chúng có khả năng hấp
protein màng. Enzym ComC có bản chất là một peptidase phân cắt protein ComG của
màng tế bào làm cho nó không còn tính trọn vẹn của một protein màng, từ đó chúng
đƣợc hoạt hoá. Có 7 protein cùng dạng với ComG, tất cả chúng đều có thể tạo ra cấu
trúc cho phép DNA tiếp cận với ComEA. ComEA là thể nhận để DNA đi vào tế bào.
ComEC có thể tạo ra kênh vận chuyển dạng dịch và qua đó DNA đi vào tế bào
(Leendert W.Hamoen và cộng sự, 1998).
ComFA là một dạng helycase có chức năng phối hợp với ComEA và ComEC để
đƣa sợi DNA mạch đơn vào tế bào. Trong quá trình chuyển nạp sợi DNA mạch đôi
bám vào đầu Carboxyl của ComEA và đƣợc phân ra thành những đoạn dƣới tác động
của endonuclease (hiện nay đã xác định đó là NucA), phần đầu cuối mới đƣợc cắt ra
này đƣợc đƣa tới ComEC và ComEA để chúng vận chuyển vào tế bào.
Sự phiên mã của gen “late competence” mã hoá cho bộ máy gắn kết và hấp thụ
DNA (ComC, ComE, ComF, ComG) cũng nhƣ các yếu tố cần cho sự tái tổ hợp (recA,
addAB) đòi hỏi một yếu tố có khả năng kých hoạt sự phiên mã.
ComK là yếu tố hoạt hoá sự phiên mã. ComK đƣợc điều chỉnh chính xác sự biểu
hiện của nó. Sự biểu hiện của ComK đƣợc quy định bởi một mạng lƣới phức tạp bao
gồm AbrB, ComA, sinR và MecAB. Trong các thí nghiệm thực hiện năm 1998,
Leendert W.Hamoen và cộng sự đã chỉ ra rằng ComK nhận biết một vùng trình tự
5
ngắn giàu A/T, đƣợc sắp xếp trong một khung đọc đặc trƣng và lynh động dọc theo sợi
xoắn DNA. Phân tích footfrinting các gốc hydroxyl của ComK bám vào addAB
promoter cho phép họ kết luận rằng ComK bám vào vùng trình tự giàu A/T
AAAAN
5
TTTT.
ComK đƣợc điều hoà âm bởi sự bám vào của AbrB và CodY, đƣợc hoạt hoá dƣơng
bởi AbrB, sinR, DegU. CodY là một GTP-binding protein nhạy cảm với nồng độ GTP
nội bào nhƣ là một chỉ thị về dinh dƣỡng, nó điều hoà sự phiên mã ở phần đầu phare
ổn định và sự phiên mã của gen quy định sự hình thành bào tử. Từ đó, cho phép tế bào
Ba gen cấu trúc lacZ (mã hoá β- galactosidase), lacY (mã hoá permerase) và lacA
(mã hoá acetylase). Một trình tự nucleotide gọi là promoter (vùng khởi động: P), đánh
dấu điểm khởi đầu sao chép của cả 3 gen. Một trình tự nucleotide gọi là operator (vùng
hoạt động: O) nằm giữa promoter và các gen mã hoá enzym. Operator quyết địmh
RNA polymerase không lyên kết hay lyên kết với promoter và di chuyển dọc theo các
gen (trích dẫn bởi Bùi Trang Việt, 2002).
Hình 2.1 Cấu trúc operon Lac trong vi khuẩn E.coly.
Trích dẫn từ Bài giảng sinh học phân tử, Bùi Trang Việt, 2002.
Ngƣời ta gọi một nhóm gen với các chức năng lyên hệ cùng với promoter và
operator là operon. Operon chỉ có ở procaryote; sự tập hợp các gen trong operon giúp
các gen lyên hệ biểu hiện nhanh chóng (do sự thay đổi môi trƣờng), vì chúng đƣợc
kiểm soát chỉ bởi một “nút đóng mở” duy nhất (đó chính là operator). Trƣớc operon
lacZ là gen điều hoà I, gen này mã hoá repressor, tức protein có vai trò kìm hãm sự
biểu hiện gen. Hoạt động của operon Lac đƣợc chứng minh nhƣ sau:
Khi có glucose (và không có lactose), gen điều hoà I hoạt động (I có promoter
riêng) để tạo ra repressor; repressor nhận biết và lyên kết với operator, cản sự lyên kết
gen điều hoà
Gen điều
hoà
Vùng cấu trúc
gen
của lac operon
cấu trúc
gen của
cấu trúc
gen của
cấu trúc
gen của
Phƣơng pháp này thực hiện lâu, hệ số biến nạp của tế bào sau xử lý thấp nhƣng đơn
giản và dễ thực hiện.
Hiện nay để tạo tế bào E.coly khả nạp theo các phƣơng pháp hóa học, ngƣời ta có
thể tiến hành theo 3 cách khác nhau
Thứ nhất, phƣơng pháp Hanahan cho phép tạo những tế bào E.coly khả nạp có hiệu
quả biến nạp cao (5x10
8
khuẩn lạc/µg plasmid DNA).
8
Thứ hai, phƣơng pháp Inoue dễ lặp lại hơn phƣơng pháp Hanahan và tạo ra các tế
bào khả nạp có hiệu quả biến nạp từ 1x10
8
đến 3x10
8
khuẩn lạc/µg plasmid DNA.
Thứ ba, phƣơng pháp Calcium chloride, phƣơng pháp này đƣợc phát triển từ hơn 30
năm qua và tạo ra các tế bào khả nạp có hiệu quả biến nạp từ 5x10
6
đến 2x10
7
khuẩn
lạc/µg plasmid DNA. Thông thƣờng, ngƣời ta xử lý tế bào vi khuẩn trong dung dịch
muối lạnh của kim loại hoá trị II nhƣ CaCl
2
, MgCl
2
, RbCl
2
.
gốc từ các họ plasmid này) mang một đoạn ngắn của DNA E.coly chứa những trình tự
điều hòa và mã hóa cho α-protein của β-galactosidase (đầu amin). Việc chèn vào đoạn
9
này trình tự MCS chứa các vị trí cắt giới hạn duy nhất (vẫn duy trì khung đọc) sẽ tạo
thêm vài amino axit trong α-protein mà không ảnh hƣởng tới chức năng của lacZ. Các
vector loại này sẽ đƣợc sử dụng với các chủng chủ thể hiện phần đầu carboxyl của β-
galactosidase. Hiện tƣợng α-complementation xảy ra khi hai protein bất hoạt của β-
galactosidase E.coly (α, ω-protein ) kết hợp với nhau để tạo thành một enzym có chức
năng. Các khuẩn lạc có α-complementation sẽ dễ dàng đƣợc phát hiện vì việc xuất
hiện khuẩn lạc màu xanh trên môi trƣờng có chứa cơ chất tạo màu X-gal (5-Bromo- 4-
chloro-3-Indolyl –β-D-galactopyranoside). Hợp chất không màu X-gal bị phân cắt bởi
β-galactosidase để cho galactose và một dẫn xuất của indoxyl. Dẫn xuất này, đến lƣợt
nó, bị oxy hóa trong không khí để tạo ra dẫn xuất dibromo-dichloro có màu xanh. Để
có sự biểu hiện của β-galactosidase cần có chất kých hoạt là IPTG (đồng phân của
galactose không bị nhận biết bởi β-galactosidase), đóng vai trò nhƣ là chất kých hoạt
của gen lacZ.
Khi chèn đoạn DNA vào trình tự MCS của các vector (ví dụ pBluescript) sẽ làm
ngăn cản việc tạo thành α-protein đầu amin. Do đó, hiện tƣợng α-complementation
không thể xảy ra. Vì vậy, khuẩn lạc do thể biến nạp hình thành có màu trắng.
2.3.5 Chiết tách DNA plasmid
Với mong muốn thu nhận một số lƣợng lớn các bản sao plasmid, ngƣời ta sử dụng
bộ máy di truyền của các tế bào chủ. Thông qua đó, plasmid đƣợc sao chép với số
lƣợng lớn và tốc độ cực kì nhanh chóng theo tốc độ tăng trƣởng của tế bào chủ. Trƣớc
hết, biến nạp plasmid vào tế bào chủ, sau đó nuôi cấy tế bào chủ trên môi trƣờng chọn
lọc thích hợp thu nhận sinh khối tế bào. Quá trình tách chiết plasmid từ tế bào chủ là
công đoạn cuối cùng nhằm thu nhận plasmid dƣới dạng tinh. Các quy trình tách chiết
đều có các bƣớc chính là phá vỡ màng tế bào, biến tính DNA, tủa protein, cuối cùng là
tủa DNA. Tuỳ theo từng phƣơng pháp cụ thể ngƣời ta sẽ sử dụng các tác nhân khác
nhau trong từng công đoạn của quá trình tách chiết.
cho việc bổ sung các nucleotide vào mạch DNA mới. Taq polymerase đƣợc phân lập
từ vi khuẩn suối nƣớc nóng thermus aquaticus. Enzym này có tính chịu nhiệt rất cao,
nó chịu đƣợc nhiệt độ biến tính DNA khoảng 94
o
C. Nhiệt độ tối ƣu cho sự hoạt động
của Taq polymerase khoảng 70 – 72
o
C. Trong phản ứng PCR nếu nồng độ enzym này
quá thấp không đủ lƣợng enzym xúc tác cho phản ứng sẽ tạo ra sản phẩm PCR không
mong muốn.
2 4 6 8 1 0
Biến tính
Ủ bắt cặp
Kéo dài
Lặp lại n lần
94–95
o
C
72
o
C
45-56
o
C
11
Các nucleotid tự do
dNTP – deoxyribonucleotide-5-triphosphate. Đây là hổn hợp 4 loại nucleotide
dATP, dTTP, dCTP, dGTP làm nguyên lyệu cho phản ứng tổng hợp mạch DNA mới.
Nồng độ nucleotide trong phản ứng PCR mất cân bằng sẽ làm phát sinh các lỗi sao
cho một phản ứng PCR tùy thuộc vào số lƣợng DNA mẫu ban đầu. Nếu ít chu kỳ thì
12
sản phẩm PCR thu đƣợc ít. Nếu kéo dài tiến trình PCR thì hiệu quả khuyếch đại giảm
hẳn do: sự cạn kiệt các thành phần phản ứng, sự mỏi mệt của các enzym dùng trong
phản ứng.
Nhiệt độ và pH
Những enzym đƣợc sử dụng trong phản ứng rất mẫn cảm với nhiệt độ. Theo Trần
Thị Dân (2000), sự thay đổi nhiệt độ có ảnh hƣởng mạnh đến năng suất và độ chuyên
biệt của sản phẩm PCR. Để biến tính thì khoảng nhiệt độ từ 94 – 95
o
C là thích hợp
nhất, nếu nhiệt độ cao hơn sẽ làm mất hoạt lực của Taq polymerase. Để kéo dài chuỗi
ngƣời ta sử dụng nhiệt độ 72
o
C, đây là nhiệt độ tối ƣu cho Taq polymerase hoạt động.
Khoảng nhiệt độ dùng để bắt cặp là khó xác định nhất, khoảng nhiệt độ này đƣợc xác
định tùy từng loại primer. Primer có trình tự càng nhiều G, C thì nhiệt độ bắt cặp càng
cao. Thông thƣờng nhiệt độ bắt cặp từ 50 – 56
o
C.
Hầu hết các enzym, mẫu DNA đƣợc đệm trong môi trƣờng tối ƣu có pH = 8. Ở pH
này DNA rất ổn định. Trong môi trƣờng axit các bazơ purin rất dể bị tách khỏi sợi
DNA, cầu nối phosphodiester bị phá vỡ. Tuy nhiên theo chu kỳ nhiệt độ của phản ứng
PCR thì pH có thể thay đổi từ 6,8 – 7,8.
Các vấn đề thƣờng gặp trong PCR và phƣơng pháp khắc phục
Bảng 2.1 Các vấn đề thƣờng gặp trong PCR và phƣơng pháp khắc phục
1. Có nhiều
sản phẩm
chuỗi ngắn
o
C
Gia tăng nồng độ KCl buffer lên 1,2 – 2 X, vẫn giữ nồng độ MgCl
2
ở
mức 1,5 – 2 mM
Gia tăng nồng độ MgCl
2
lên 3 – 4,5 nM, nhƣng vẫn giữ nguyên nồng
độ dNTP
Giảm lƣợng mồi
Giảm lƣợng DNA khuôn
Giảm lƣợng Taq polymerase
3. Không có
sản phẩm nào
cả
Đảm bảo rằng các thành phần PCR đã cho vào phản ứng
Đổi dung dịch dNTP do dNTP rất nhạy cảm với việc cấp rã đông.
Gia tăng hàm lƣợng mồi
Gia tăng hàm lƣợng DNA khuôn mẫu
Giảm nhiệt độ bắt cặp xuống 6 – 10
o
C
4. Sản phẩm
PCR ít
Giảm nhiệt độ ủ bắt cặp đến mức có thể
Gia tăng lƣợng mồi
Gia tăng lƣợng DNA khuôn
Gia tăng lƣợng Taq polymerase
cloning. Vector đƣợc chọn phải có khả năng mang một hoặc nhiều gen vào tế bào chủ
và cần có các đặc điểm tiêu chuẩn nhƣ sau:
Có khả năng tự sao chép trong tế bào chủ, sao chép không phụ thuộc sự sao chép
bộ gen tế bào chủ. Có những đặc tính cho phép phát hiện dễ dàng tế bào vi khuẩn có
chứa chúng. Các đặc tính này thƣờng đƣợc mã hoá bởi các gen chọn lọc. Mang những
vị trí nhận biết duy nhất của một số enzym giới hạn. Các vị trí cắt giới hạn này có tác
dụng mở rộng khả năng xây dựng vector tái tổ hợp từ vector ban đầu. Có kých thƣớc
càng nhỏ càng tốt để có thể thu nhận một lƣợng DNA tối đa. Hơn nữa, kých thƣớc
vector càng nhỏ thì càng dễ xâm nhập vào tế bào vi khuẩn, càng đƣợc sao chép nhanh
và hiểu quả. Tồn tại đƣợc trong tế bào vi khuẩn qua nhiều thế hệ và ít gây xáo trộn
nhất cho tế bào chủ. Các vector biểu hiện cần chứa thêm promoter thích hợp cho việc
biểu hiện gen trong sinh vật chủ.
15
Các dạng vector thƣờng sủ dụng là plasmid và phage (nhiễm sắc thể của virút).
2.4.1 Plasmid
Hình 2.3 Mô hình plasmid sử dụng cho cloning (Nguồn tài lyệu T.A. Brown, 1997).
Plasmid là phân tử DNA dạng vòng có kých thƣớc phân tử nhỏ, có trong vi khuẩn
và vi sinh vật khác, plasmid có khả năng nhân bản độc lập với chromosome của tế bào
ký chủ. Chúng có khả năng mang một hoặc nhiều gen, thƣờng là gen mã hóa các chất
có ích cho vi khuẩn . Ví dụ, plasmid mang gen Ampicillyn hoặc Chloramphenocol sẽ
giúp vi khuẩn chủ kháng lại và tồn tại trong môi trƣờng có kháng sinh này. Tính kháng
với loại kháng sinh nào đó đƣợc xem nhƣ là một dấu hiệu chọn lọc, hay đặc điểm để
nhận điện quan trọng giúp khẳng định sự hiện diện của gen ngoại lai.
Cấu trúc plasmid bao gồm vùng ori (origin of replycation) giúp quá trình nhân
nhanh về số lƣợng nhƣng không phụ thuộc vào nhiễm sắc thể của vi khuẩn chủ.
Những plasmid nhỏ có thể sử dụng DNA của tế bào ký chủ cho việc nhân bản của nó,
nhƣng đối với các plasmid lớn, chúng mang những gen mã hóa chuyên biệt giúp cho
DNA của phage đƣợc truyền vào ký chủ và ở đó nó trải qua quá trình nhân lên số
lƣợng, ngƣời ta lợi dụng đặc tính này để thiết kế các vector mang DNA vào tế bào.
Ngoài ra, còn có vector lai giữa plasmid và phage mà ở đó các chức năng của phage
đƣợc biểu hiện và sử dụng theo một cách nào đó, gọi là phasmid. Các vector lai giữa
plasmid và phage đƣợc hoàn thiện cho tới nay và đƣợc sử dụng rộng rãi cho các ứng
dụng nhƣ giải trình tự DNA và sản xuất các mẫu dò để sử dụng trong các nghiên cứu
về lai axit nucleic. Các vector này là những plasmid quan trọng, chúng chứa điểm khởi
đầu sao chép f1 của phage M13, và có thể tiếp nhận các đoạn DNA có kých thƣớc tới
10kb (pEMBL9, pBluescript).
2.5 Các enzym đƣợc sử dụng cho biến nạp DNA
Trong thí nghiệm biến nạp gen cần sử dụng enzym cắt giới hạn, enzym sửa chữa
DNA, enzym gắn DNA biến nạp và vector.
2.5.1 Các enzym cắt giới hạn
Khái niệm hiện tƣợng giới hạn: Các thực khuẩn thể xâm nhiễm vào tế bào vi
khuẩn và sinh sôi nhờ bộ máy sinh tổng hợp của vi khuẩn. Khi số lƣợng phage tăng lên
17
đến hàng triệu bản sao, chúng sẽ phá vỡ tế bào vi khuẩn. Nhƣng trong một số trƣờng
hợp, tế bào vi khuẩn vẫn nguyên vẹn mà phage cũng không sinh sôi. Hiện tƣợng này
có thể do một trong hai nguyên nhân là DNA phage gắn vào vi khuẩn dƣới dạng không
hoạt động trong một thời gian hay DNA phage bị một hệ thống bảo vệ của vi khuẩn
tiêu diệt khi vừa mới xâm nhập, hệ thống bảo vệ này là các enzym cắt giới hạn. Đây
chính là hiện tƣợng giới hạn.
Khi nghiên cứu DNA phage bằng phƣơng pháp Southern blot, ngƣời ta thấy rằng
DNA phage trích từ vi khuẩn bị phá vỡ có kých thƣớc nguyên vẹn trong khi DNA
phage trích từ vi khuẩn không bị phá vỡ lại bị cắt thành những đọan nhỏ hơn kých
thƣớc đã xác định. Tuy vậy, ngay trên những chủng kháng phage, vẫn có một số vi
khuẩn bị phân hủy. Các phage do số ít vi khuẩn này phóng thích có khả năng phân hủy
chủng vi khuẩn trƣớc kia còn kháng phage.
Tất cả những hiện tƣợng nêu trên là kết quả của một hệ thống gồm hai enzym: Các
(b) DNA của vi khuẩn không đƣôc nhận biết bởi enzym cắt
Các kiểu cắt của RE loại 2:
Cắt tạo đầu bằng (blunt-ends): Một số RE cắt hai mạch DNA tại cùng một điểm.
Sau khi cắt, hai đầu bằng sẽ không có khả năng tự kết hợp lại. Để nối chúng lại
phải dùng enzym T4 lygase.
HaeIII
5’ GG CC 3’
3’ GG CC 3’
5’ GG CC 3’
3’ CC GG 5’
Cắt đầu dính (cohesive ends): Ở một số RE, vị trí cắt lệch nhau trên hai mạch.
Trong trƣờng hợp này, các đầu dính bổ sung có thể bắt cặp trở lại, hai phân tử
EcoRI
không cắt
DNA đƣợc
methyl hoá
DNA
đƣợc
methyl
hoá
Enzym cắt
giới hạn
EcoRI
Enzym cắt
giới hạn
EcoRI
DNA
không
nhỏ (nhờ một protease), phần chịu trách nhiệm exonuclease 5’ 3’. Do đó, enzym
Klenow có hai hoạt động: hoạt động tổng hợp DNA polymerase
5’ 3’ và hoạt động thủy giải exonuclease 3’ 5’.
2.5.2.2 Terminal transferase
Enzym này đƣợc ly trích từ tuyến ức của bê. Terminal transferase xúc tác phản ứng
gắn các deoxynucleotide vào đầu 3’OH tự do của phân tử DNA. Sự gắn này mang tính
ngẫu nhiên nên thành phần nucluetide của chuỗi polynucleotide mới hình thành hoàn
toàn phụ thuộc nồng độ của 4 loại nucleotide có trong phản ứng.
Enzym này đƣợc sử dụng khi cần thêm đuôi nucleotide để tạo đầu sole cho phân tử
DNA hay đánh dấu đầu 3’OH của các DNA trong phƣơng pháp xác định trình tự
nucleic axit theo Maxam và Gilbert. 20
2.5.2.3 Các DNase
Các DNase thƣờng đƣợc cô lập từ tuyến tụy bò, là các endonuclease có khả năng
cắt một phân tử DNA sợi đơn hay kép theo cách ngẫu nhiên để cho một hỗn hợp các
olygonucleotide. Hoạt động của DNase thay đổi tuỳ theo sự hiện diện của Mn
2+
hay
Mg
2+
. Khi có Mn
2+
, DNase tác động trên hai sợi DNA gần nhƣ ở cùng một nơi để cho
những đầu thẳng (hay không quá 1-2 nucleotide). Khi có Mg
2+
, DNase tác động trên
mỗi sợi DNA riêng lẻ.
2.5.3 Các enzym khử phosphoril hoá.
lygase trích từ E.coly nhƣng đặc biệt còn có khả năng nối hai trình tự DNA đầu bằng
nên là lygase đƣợc chuộng nhất trong sinh học phân tử.
2.6 Thiết kế DNA tái tổ hợp và tăng bội
2.6.1 Với plasmid
Enzym hạn chế cắt vector ở vị trí hạn chế hay MSC. Các DNA sợi kép (plasmid
thẳng) với các đầu dính hay bằng đƣợc tạo thành. Đoạn DNA lạ đƣợc cắt ra từ một
phân tử DNA lớn bởi cùng enzym cắt giới hạn (với trƣờng hợp đầu dính) hoặc thu
nhận từ phản ứng PCR. Sau đó, phản ứng nối giữa vector và DNA chèn đƣợc tiến hành
dƣới sự xúc tác của DNA lygase, DNA lygase giúp sự tạo nối đồng hóa trị giữa các
nucleotide cạnh nhau.
2.6.2 Với DNA phage
Khác với DNA plasmid, DNA không đóng vòng, nhƣng ta cũng có thể tạo các ngân
hàng DNA bằng cách dùng các phage làm vector, theo cùng nguyên tắc với sự dùng
plasmid. Các bƣớc tạo DNA tái tổ hợp : Làm phóng thích DNA phage ra khỏi vỏ, làm
cho các đầu tận cùng của đọan DNA insert có khả năng tƣơng hợp với các đầu tận
cùng của DNA phage, và sau đó dùng lygase để nối lyền các đoạn DNA, tái tạo vỏ
phage nhờ chất trích protein từ vỏ phage. Đến đây, phage sẵn sàng nhiễm vào vi
khuẩn. Để tăng bội DNA phage ngƣời ta cho các phage nhiễm vào vi khuẩn. Các
phage chứa DNA lạ sinh sản mạnh và phá vỡ vi khuẩn. Các vi khuẩn sau đó đƣợc trải
trên thạch trong hộp petri.
2.7 Các nghiên cứu về biến nạp DNA
Cohen và công sự (1973), đã thành công khi biến nạp plasmid tái tổ hợp vào tế bào
vi khuẩn E.coly bằng phƣơng pháp Calcium chloride.
Sambrook và cộng sự (1989), đƣa ra phƣơng pháp chuẩn bị tế bào E.coly khả nạp,
biến nạp plasmid vào tế bào theo phƣơng pháp hóa chất và sốc nhiệt, sau đó ông đƣa
ra công thức tính hệ số biến nạp
N = A x10
n
x OV/PV
N: hệ số biến nạp, tính bằng CFU/µg plasmid DNA
23
PHẦN 3: VẬT LYỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện khoá luận tốt nghiệp
Thời gian : Khoá luận đƣợc tiến hành từ ngày 01 tháng 03 năm 2005 đến ngày 15
tháng 08 năm 2005.
Địa điểm : Trung tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hoá Sinh Trƣờng Đại học Nông lâm
Thành phố Hồ Chí Minh và phòng 118,105 khu Phƣợng Vỹ Trƣờng Đại học Nông lâm
Thành phố Hồ Chí Minh.
3.2 Vật lyệu và phƣơng pháp dùng trong thí nghiệm
3.2.1 Vật lyệu làm thí nghiệm
3.2.1.3 Đoạn DNA
Hai đoạn DNA đƣợc chọn nghiên cứu trong khoá luận này là
Đoạn DNA (629bp) chứa gen mã hoá 2,4-diacetylploroglucinol (2,4-DAPG) trong
vi khuẩn Psedomonas fluorescens.
Đoạn DNA(580bp)trong vùng ITS của loài nấm Beauveria bassiana.
3.2.2 Dụng cụ thí nghiệm
Đĩa petri, Ống nghiệm
Eppendorf các loại
Pipet và đầu tip
Lọ thủy tinh đƣng hóa chất
Đầu lọc hóa chất
Thùng đựng nƣớc đá
Bình tam giác
3.2.3 Các thiết bị máy móc
Tủ cấy vô trùng
Bồn ổn nhiệt
Máy ly tâm
Tủ định ôn
Máy lắc vi khuẩn
Tủ lạnh
Máy đo OD
Tủ sấy dụng cụ
Thiết bị điện di
Máy chụp gel
Lò vi sóng
3.2.4 Các loại môi trƣơng nuôi cấy vi khuẩn
Môi trƣờng LB lỏng (bacto tryptone, bacto yeast extract, natri chlorua )
Môi trƣờng LB lỏng có bổ sung kháng sinh (bacto tryptone, bacto yeast extract,
natri chlorua, ampicillyn)
Glycerol 70%
Bromophenol blue
Ethidiumbromide
3.2.6 Các loại enzym dùng trong thí nghiệm
BamHI với trình tự nhận biết: G GATCC
(Roche, Cat.No. 220 612) CCTAG G
EcoRV với trình tự nhận biết: GAT ATC
(Roche, Cat.No. 667 145) CTA TAG
Hind III với trình tự nhận biết: A AGCTT
(Roche, Cat.No. 656 313) TTCGA A
DNA T4 lygase (usb, Product No. 70005Y) do công ty Amersham cung cấp.
DNA Polymerase I large fragment (Klenow) (BioLabs, Code number M0210S) do
công ty Bio-rad cung cấp.
Copyright: Tài liệu đại học ©