BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
BÙI THỊ THANH TỊNH
HOÀN THIỆN QUY TRÌNH BIẾN NẠP ĐOẠN
DNA VÀO TẾ BÀO VI KHUẨN E. coli DH5α
LUẬN VĂN KỸ SƢ
CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Thành phố Hồ Chí Minh
2006 MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING
NONG LAM UNIVERSITY,HCHC
DEPARTMENT OF BIOTECHNOLOGY
COMPLETING PROTOCOL OF
TRANSFORMATION DNA FRAGMENTS INTO
E.coli DH5α BACTERIAL CELLS
Ban giám đốc Trung tâm Phân Tích Hóa Sinh - Trƣờng Đại học Nông Lâm TP.
Hồ Chí Minh cùng toàn thể các anh chị tại Trung Tâm đã tạo điều kiện thuận lợi tối đa
cũng nhƣ tận tình giúp đỡ em trong thời gian thực tập tốt nghiệp.
Anh Nguyễn Văn Lẫm đã tận tình hƣớng dẫn, giúp đỡ em trong suốt quá trình
làm đề tài
Các anh, chị và các bạn sinh viên thực tập tại phòng 105, 118 - khu Phƣợng Vỹ
Trƣờng Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh đã giúp đỡ tôi.
Và cuối cùng là các bạn lớp Công Nghệ Sinh Học K28 đã luôn đồng hành, chia
sẻ vui buồn, động viên và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập và làm đề tài. TP. Hồ Chí Minh, tháng 8 năm 2006
Bùi Thị Thanh Tịnh
ii
TÓM TẮT
BÙI THỊ THANH TỊNH, Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh, “Hoàn thiện
quy trình biến nạp đoạn DNA vào tế bào vi khuẩn E. coli DH5α”, đƣợc thƣc hiện
tại Trung tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hóa Sinh và Bộ môn Bảo Vệ Thực Vật-Trƣờng
Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh.
Giáo viên hƣớng dẫn: thầy Lê Đình Đôn.
Đề tài đƣợc thực hiện từ tháng 02 năm 2006 đến tháng 08 năm 2006 với các nội
dung:
Trang
Lời cảm ơn ................................................................................................................... i
Tóm tắt ........................................................................................................................ ii
Mục lục ......................................................................................................................iii
Danh sách các chữ viết tắt ........................................................................................ vii
Danh sách các hình ................................................................................................... vii
Danh sách các bảng ................................................................................................... ix
PHẦN 1. MỞ ĐẦU .................................................................................................... 1
1.1 Đặt vấn đề ............................................................................................................. 1
1.2 Mục tiêu của đề tài................................................................................................ 2
1.3 Nội dung thực hiện ............................................................................................... 2
PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................................... 3
2.1 Hiện tƣơng biến nạp ở vi khuẩn ........................................................................... 3
2.1.1 Giới thiệu về hiện tƣợng biến nạp ................................................................ 3
2.1.2 Cơ sở sinh hóa và tế bào học của hiện tƣợng biến nạp ................................ 3
2.1.3 Cơ chế của hiện tƣợng biến nạp ................................................................... 5
2.1.4 Vai trò của hiện tƣợng biến nạp ................................................................... 5
2.1.5 Ứng dụng của hiện tƣợng biến nạp .............................................................. 5
2.2 Các vector và chủng chủ dùng trong biến nạp ..................................................... 6
2.2.1 Khái niệm chung các vector ......................................................................... 6
2.2.2 Plasmid ......................................................................................................... 7
2.2.2.1 Cấu trúc ............................................................................................... 7
2.2.2.2 Tính chất của plasmid .......................................................................... 8
2.2.2.3 Phân loại plasmid ................................................................................ 8
2.2.3 Phage ............................................................................................................ 9
2.2.4 Chủng chủ E.coli .......................................................................................... 9
2.3 Các ezyme dùng trong biến nạp ......................................................................... 10
2.3.1 Các enzym cắt giới hạn (RE) ..................................................................... 11
iv
3.3.1 Dụng cụ thí nghiệm .................................................................................... 23
v
3.3.2 Các thiết bị máy móc ................................................................................. 23
3.3.3 Các loại môi trƣờng nuôi cấy vi khuẩn ...................................................... 23
3.3.4 Các loại hóa chất dùng trong thí nghiệm ................................................... 24
3.3.5 Các loại enzym dùng trong thí nghiệm ...................................................... 24
3.4 Phƣơng pháp nghiên cứu .................................................................................... 25
3.4.1 Quy trình biến nạp plasmid vào tế bào vi khuẩn ....................................... 25
3.4.2 Quy trình biến nạp đoạn DNA vào vi khuẩn
E.coli DH5α và kiểm tra .......................................................................... 26
3.4.3 Tăng sinh vi khuẩn E.coli DH5α trên môi trƣờng LB ............................... 27
3.4.4 Chuẩn bị tế bào khả nạp ............................................................................. 27
3.4.5 Biến nạp plasmid pBluescript vào tế bào vi khuẩn
E.coli DH5α bằng phƣơng pháp sốc nhiệt
(theo quy trình của Sambrook và cộng sự, 1989 có sửa đổi) ................................. 27
3.4.6 Chiết tách plasmid và sử dụng enzym cắt để kiểm tra ............................... 29
3.4.6.1 Chiết tách plasmid ............................................................................. 29
3.4.6.2 Phản ứng cắt Plasmid
(quy trình trích dẫn bởi Samuel S.M.Sun, 1994) ...................................... 32
3.4.6.3 Quy trình điện di trên gel agarose ..................................................... 32
3.4.7 Tinh sạch plasmid và đoạn DNA từ sản phẩm PCR .................................. 33
3.4.7.1 Phƣơng pháp tinh sạch DNA ............................................................. 33
3.4.7.2 Quy trình tinh sạch DNA từ gel ........................................................ 33
3.4.7.3 Quy trình tinh sạch trực tiếp sản phẩm PCR bằng cột GFX ................... 34
3.4.8 Thiết lập phản ứng tạo blunt-end cho sản phẩm PCR ............................... 35
3.4.9 Thiết lập phản ứng nối giữa plasmid và đoạn
DNA đầu bằng (phản ứng nối blunt-end) ................................................ 36
3.4.10 Chuyển sản phẩm nối vào tế bào vi khuẩn E.coli DH5α
khả nạp (theo quy trình của Sambrook và cộng sự, 1989 có chỉnh sửa) ............ 37
vii
DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
bp base pair
CFU Colony Form Unit
DNA Deoxyribonucleic acid
dNTP 3’- Deoxyribonucleoside- 5’- triphosphate
ETDA Ethylenediamine tetraacetic acid
IPTG Isopropyl-β-D-thiogalactoside
MCS Multiple cloning Site
OD Optical Density
PCR Polymerase Chain Reaction
RE Restriction Enzyme
RNA Ribonucleic acid
RFLP Restriction fragment length polymorphism
SDS Sodium dodecyl sulfate
TAE Tris Acetate EDTA
Taq Thermus aquaticus
Kb kilobase
dATP deoxyadenosine triphosphate
Hình 4.9 Kết quả điện di sản phẩm cắt bằng HindIII trên gel agarose 1% .................... 43
Hình 4.10 Kết quả điện di sản phẩm tinh sạch đoạn
DNA bằng phƣơng pháp cắt gel và thu hồi lại bằng cột GFX ............................................. 45
Hình 4.11 Kết quả điện di sản phẩm tinh sạch đoạn DNA
bằng phƣơng pháp cắt gel và thu hồi lại bằng cột GFX ....................................................... 45
Hình 4.12 Kết quả điện di sản phẩm tinh sạch trên gel agarose1% ................................ 46
Hình 1 Sơ đồ cấu trúc pBluescript II SK (+/-) .................................................................... 55
Hình 2 Sơ đồ cấu trúc pBluescript II KS (+/-) ......................................................... 56 ix
DANH SÁCH CÁC SƠ ĐỒ VÀ BẢNG
Sơ đồ 3.1 Vùng trình tự MCS của plasmid pBluescript II SK (+/-) ......................... 23
Sơ đồ 3.2 Quy trình biến nạp plasmid vào tế bào vi khuẩn E. Coli ........................ 25
Sơ đồ 3.3 Quy trình biến nạp đoạn DNA
vào vi khuẩn E. coli DH5α và kiểm tra ...................................................................... 26
vấn đề này, khi nghiên cứu trình tự của một đoạn DNA về sự hoạt động của gen, sự
biểu hiện ra protein và cấu trúc của protein, ngƣời ta chú trọng tới việc phân lập và thu
nhận đoạn DNA quan tâm và tiến hành tạo ra bản sao với số lƣợng lớn để tiến hành
nghiên cứu. Mặc khác, bộ gen của sinh vật thì rất lớn và phức tạp mà trình tự gen
chúng ta quan tâm thƣờng chỉ có một hay hai bản sao trong mỗi tế bào. Vì vậy chúng
ta không thể sử dụng các phƣơng pháp sinh hoá thông thƣờng để phân lập gen mục
tiêu trên bộ gen.
Những vấn đề trên có thể đƣợc giải quyết khi ta sử dụng các cấu trúc DNA có
khả năng tự sao chép trong tế bào chủ để làm phƣơng tiện mang gen, biến nạp gen,
tăng bản sao của gen, biểu hiện gen hay các thao tác khác trên gen. Các cấu trúc DNA
dùng cho mục tiêu này gọi là vector. Việc biến nạp DNA tái tổ hợp vào một tế bào
thích hợp sẽ cho phép vector có khả năng tồn tại ổn định và sao chép độc lập với bộ
gen của tế bào. Tế bào có khả năng tiếp nhận vector tái tổ hợp gọi là tế bào chủ. Tế
bào chủ thƣờng đƣợc chọn lọc và cải tạo để tạo thành các chủng chủ có kiểu gen và
các đặc tính thuận lợi cho các thao tác trên gen. Chủng chủ mang vector tái tổ hợp gọi
là dòng tái tổ hợp. Dòng tái tổ hợp đƣợc phân lập để lƣu trữ DNA tái tổ hợp hoặc dùng
cho các thao tác trên gen. Toàn bộ quá trình trên gọi là tạo dòng DNA hay DNA
cloning. Mục đích của tạo dòng nhằm thu đƣợc số lƣợng lớn và tinh khiết các trình tự
DNA hay thu nhận một dòng tế bào có khả năng biểu hiện gen mục tiêu.
Xuất phát từ những khó khăn trong thực tế nghiên cứu và trên nền tảng kiến
thức về kĩ thuật di truyền đƣợc tiếp thu trong quá trình học tập, chúng tôi tiến hành
2
thực hiện đề tài “ Hoàn thiện quy trình biến nạp đoạn DNA vào tế bào vi khuẩn E.
coli DH5α” phát triển từ đề tài: “Xây dựng quy trình biến nạp đoạn DNA vào tế
bào vi khuẩn E. coli DH5α” do Phạm Duy và Huỳnh Văn Thái, trƣờng đại học Nông
Lâm TPHCM thực hiện.
1.2 Mục tiêu của đề tài
Hoàn thiện quy trình chèn một đoạn DNA bất kỳ vào plasmid pBluescript và
chuyển plasmid tái tổ hợp này vào tế bào kí chủ E. coli DH5α.
Biến nạp là phƣơng pháp đơn giản nhất hiện có để đƣa DNA tái tổ hợp vào
trong tế bào. Trong trƣờng hợp các tế bào E. coli thì biến nạp có nghĩa là đƣa DNA
plasmid vào trong tế bào. Biến nạp còn đƣợc sử dụng với nghĩa rộng hơn, cụ thể là đƣa
bất kỳ DNA nào vào bất kỳ tế bào nào.
Lần đầu tiên biến nạp ở vi khuẩn đƣợc Frederick Griffith mô tả vào năm 1928
trong thí nghiệm nổi tiếng của ông về cái gọi là “nguyên lí biến nạp”. Trên thực tế phát
minh này về sau đã chứng minh rằng các gen đƣợc cấu thành từ DNA. Tuy nhiên
không phải tất cả vi khuẩn đều biến nạp một cách dễ dàng. Để cho biến nạp ở E. coli
có hiệu quả, các tế bào cần trở nên khả biến (competent). Để đạt đƣợc điều này, ngƣời
ta ngâm các tế bào trong dung dịch calcium chloride lạnh đông đá, khi đó các tế bào
trở nên khả biến theo một cách mà cho đến nay chƣa rõ nguyên nhân. Việc biến nạp
các tế bào khả biến đƣợc thực hiện bằng cách trộn DNA plasmid với các tế bào, rồi ủ
trong đá 20 đến 30 phút, sau đó tạo một sốc nhiệt ngắn (2 phút ở 42
0
C), làm nhƣ vậy
DNA sẽ chui vào tế bào. Các tế bào biến nạp thƣờng đƣợc ủ trong nƣớc thịt dinh
dƣỡng ở 37
0
C trong vòng 60 đến 90 phút để làm cho các plasmid ổn định và biểu hiện
các tính trạng của chúng ra kiểu hình. Sau đó, các tế bào đƣợc đƣa lên môi trƣờng
chọn lọc để nhân lên các tế bào có plasmid (Lê Đình Lƣơng, 2001).
2.1.2 Cơ sở sinh hóa và tế bào học của hiện tƣợng biến nạp
Hiện tƣợng biến nạp đòi hỏi sự thể hiện của gen mã hóa cho những thành phần
mà DNA gắn vào, sau đó sẽ đƣợc hấp thụ.
Trong tự nhiên, khi nồng độ các chất dinh dƣỡng hay nồng độ oxy giảm đến
mức tối thiểu ảnh hƣởng đến sự sống của vi khuẩn, lúc này tế bào sẽ bị thay đổi về cấu
trúc cũng nhƣ đặc tính sinh lý sinh hóa, màng tế bào bị biến tính dẫn đến sự hình thành
các kênh vận chuyển dạng lỏng, DNA sẽ theo các kênh này đi vào nhờ việc tiếp xúc
với màng và nhận đƣợc sự hỗ trợ của hệ thống vận chuyển bên trong tế bào.
Hệ thống vận chuyển này đƣợc hình thành trên cơ sở enzym gây biến tính một
tế bào thích nghi với những giới hạn về dinh dƣỡng. DegU giúp cho ComK bám chặt
hơn vào ComK promoter, điều này đảm bảo sự phiên mã chính xác ngay cả khi nồng
độ ComK thấp.
5
2.1.3 Cơ chế của hiện tƣợng biến nạp
Tế bào vi khuẩn có thể cho DNA xâm nhập vào tế bào đƣợc là do trong một
giai đoạn tăng trƣởng nào đó của tế bào, trên bề mặt của tế bào có hiện diện những
điểm tiếp nhận đặc biệt gọi là nhân tố dung nạp (competent factor). Nhân tố này có
khả năng tiếp nhận đoạn ngắn DNA từ môi trƣờng bên ngoài để đƣa vào bên trong tế
bào vi khuẩn, nhờ đó xảy ra tái tổ hợp.
Muốn thực hiện sự biến nạp cần phải có 2 điều kiện: (1) Phải có trong môi
trƣờng các đoạn DNA, (2) Khả năng dung nạp DNA của vi khuẩn nhận.
Không phải tất cả các vi khuẩn đều nhận DNA vào nhƣ nhau, mà cần phải sử
dụng một số chất để tạo lỗ trên vách tế bào, giúp sự xâm nhập dễ dàng của DNA nhƣ:
CaCl
2
50mmol, LiCl.
Quá trình biến nạp gồm 5 giai đoạn:
- Sự tiếp xúc của DNA lạ với tế bào nhận
- Sự xâm nhập của DNA vào tế bào nhận
- Sự liên kết của DNA lạ với đoạn tƣơng đồng của nhiễm sắc thể tế bào nhận
- Sự đồng hóa phân tử DNA lạ vào DNA của tế bào nhận nhờ tái tổ hợp
- Sự nhân lên của nhiễm sắc thể có DNA biến nạp
2.1.4 Vai trò của hiện tƣợng biến nạp
Hiện tƣợng biến nạp giúp các loài vi khuẩn có thêm các tính trạng mới dễ thích
nghi với môi trƣờng sống.
2.2 Các vector và chủng chủ dùng trong biến nạp
2.2.1 Khái niệm chung các vector
Vector có bản chất là DNA, thƣờng dạng vòng, mang nhiều đặc tính trong đó
có khả năng xâm nhập vào tế bào vi khuẩn và mƣợn bộ máy tế bào của vi khuẩn để tạo
ra nhiều bản sao khác giống hệt vector ban đầu. Một vector cần có các đặc điểm tiêu
chuẩn nhƣ sau:
- Có khả năng tự sao chép trong tế bào chủ, sao chép không phụ thuộc sự sao
chép bộ gen tế bào chủ.
- Có những đặc tính cho phép phát hiện dễ dàng tế bào vi khuẩn có chứa
chúng. Các đặc tính này thƣờng đƣợc mã hoá bởi các gen chọn lọc. Thông thƣờng là
các gen kháng kháng sinh (ampicillin, tetracyline). Ngoài ra, gen chọn lọc cũng có thể
là gen mã hóa cho enzyme (ví dụ β-galactosidase, luciferase) chuyển hóa cơ chất cho
phép quan sát một cách dễ dàng (tạo màu hay phát sáng theo thứ tự).
Hình 2.1 Cơ chế của hiện tƣợng biến nạp
7
- Mang những vị trí nhận biết duy nhất của một số enzym giới hạn. Các vị trí
cắt giới hạn này có tác dụng mở rộng khả năng xây dựng vector tái tổ hợp từ vector
ban đầu.
- Có kích thƣớc càng nhỏ càng tốt để có thể thu nhận một lƣợng DNA tối đa.
Hơn nữa, kích thƣớc vector càng nhỏ thì càng dễ xâm nhập vào tế bào vi khuẩn, càng
đƣợc sao chép nhanh và hiệu quả.
- Tồn tại đƣợc trong tế bào vi khuẩn qua nhiều thế hệ và ít gây xáo trộn nhất
cho tế bào chủ.
- Các vector biểu hiện cần chứa thêm promoter thích hợp cho việc biểu hiện
gen trong sinh vật chủ. Ngoài ra các vector này cũng cần mang các vector chọn lọc đặc
biệt nhằm dễ dàng chọn lọc cá thể sinh vật chủ có mang vector tái tổ hợp.
Các vector thƣờng sử dụng trong biến nạp là plasmid và phage
2.2.2 Plasmid
Plasmid là phân tử DNA dạng vòng có kích thƣớc phân tử nhỏ, có trong vi
- Plasmid có DNA là chu trình kín độc lập với tế bào vi khuẩn.
- Plasmid mang một gen hay nhiều gen.
- Plasmid có khả năng sống sót trên môi trƣờng có nồng độ một số chất hóa học
ví dụ nhƣ ampicilin.
- Khi plasmid mang gen kháng, ngƣời ta dùng chất kháng này nhƣ một marker
chọn lọc.
2.2.2.3 Phân loại plasmid
Phân loại plasmid đƣợc dựa vào những đặc tính cơ bản mã hóa bởi các gen của
nó. Có 5 loại plasmid đƣợc định tính nhƣ sau:
Loại 1: F plasmid (Fertility) chỉ mang tra gen, có khả nạng chuyển vị và tiếp
hợp. Ví dụ F plasmid của E. coli.
Loại 2: R plasmid (resistance) mang gen mã hóa các hợp chất kháng lại các chất
kháng sinh giúp tế bào kí chủ tồn tại trong môi trƣờng sống. Ví dụ RP4 trong vi khuẩn
Pseudomonas.
Loại 3: Col plasmid tạo ra colicin gây chết vi khuẩn khác. Ví dụ ColE1
trong E. coli.
Loại 4: Degradative plasmid giúp kí chủ tạo các chất sinh học có tính chất đặc
biệt trong điều kiện nào đó, nhƣ toluen, salycylyc xit. Ví dụ TOL plasmid trong
Pseudomonas putida.
9
Loại 5: Virulence plasmid xác định khả năng gây bệnh của vi khuẩn chủ. Ví dụ
Ti plasmid trong Agrobacterium tumefaciens gây bệnh bƣớu trên cây hai lá mầm.
Trong các thí nghiệm phân lập và biến nạp gen thƣờng sử dụng plasmid có ba
đặc tính cơ bản sau:
- Trọng lƣợng phân tử thấp.
- Khả năng thăm dò các tính trạng chọn lọc trên tế bào chủ.
- Có cloning site đủ cho một lƣợng lớn restriction enzyme.
2.2.3 Phage
Là vật liệu di truyền của Bacteriophage, loại virus tấn công vi khuẩn. Khi tấn
Nhằm duy trì sự tồn tại của các vector bacteriophage trong tế bào chủ, thông
thƣờng E. coli dùng để tạo dòng đƣợc cải tiến thành các chủng theo các hƣớng cơ bản
sau:
- Loại bỏ các hệ thống sửa đổi hạn chế (restriction modification) vì các hệ thống
này sẽ can thiệp vào sự sao chép của DNA lạ trong tế bào vi khuẩn nhờ đó vi khuẩn sẽ
phân giải DNA lạ theo nhƣ cách DNA bacteriophage bị phân giải do hệ thống phòng
vệ tự nhiên. Do vậy các chủng E. coli dùng cho tạo dòng sẽ bị gây đột biến trong hệ
thống sửa đổi hạn chế nội sinh (hsdR
-
) hay gây đột biến trong phức hợp
mcrA/mcrB/mrr là phức hợp phân giải DNA lạ không đƣợc methyl hóa một cách
chính xác.
- Hệ thống tái tổ hợp DNA đƣợc sữa đổi để ngăn chặn sự tái tổ hợp. Gen recA
của E. coli mã hóa cho một DNA-dependent-ATPase cần thiết cho sự tái tổ hợp ở E.
coli. Các chủng chủ E. coli dùng để tạo dòng có đột biến recA
-
thƣờng không thực hiện
đƣợc sự tái tổ hợp.
- Thay đổi hoạt tính endonuclease nhằm làm tăng lƣợng plasmid tích lũy trong
tế bào. Thông thƣờng ngƣời ta sẽ gây đột biến trên gen endA (endA) là gen mã hóa cho
endonuclease I. Việc mất endonuclease này sẽ làm tăng sản lƣợng plasmid và cải biến
chất lƣợng DNA đƣợc chiết tách bằng cách sử dụng các phƣơng pháp sinh hóa chuẩn.
2.3 Các ezyme dùng trong biến nạp
Trong thí nghiệm biến nạp gen cần sử dụng enzym cắt giới hạn, enzym sửa
chữa DNA, enzym gắn DNA biến nạp và vector.
11
- Tiếp theo là chữ số la mã chỉ thứ tự RE đƣợc phát hiện (trong trƣờng hợp RE
cùng đƣợc tìm thấy ở 1 loài vi khuẩn).
12
- Đôi khi còn có thêm một chữ viết hoa để chỉ chủng vi khuẩn sử dụng.
Ví dụ:
Escherichia coli Ry13
Giống Loài Chủng
EcoRI: enzyme đầu tiên đƣợc tìm thấy ở E. coli
EcoRV: enzyme thứ 5 đƣợc tìm thấy ở E. coli
2.3.1.3 Các loại ezyme giới hạn
Enzym cắt giới hạn là các endonuclease có khả năng thủy giải DNA mạch đôi
một cách lặp lại ở những trình tự xác định.
Dựa vào khả năng này ngƣời ta chia ra làm 3 loại enzym cắt giới hạn:
Loại 1: Khi enzym nhận biết đƣợc trình tự, nó sẽ di chuyển trên phân tử DNA
đến cách đó khoảng 1000-5000 nucleotide và giải phóng độ khoảng vài chục
nucleotide.
Loại 2: Enzym nhận biết trình tự và cắt ngay tại vị trí đó.
Loại 3: Enzym nhận biết một trình tự và cắt DNA tại vị trí cách đó khoảng 20
nucleotide. Trong các thí nghiệm ngƣời ta chỉ sử dụng các enzym cắt giới hạn loại II.
2.3.1.4 Các RE loại II
Trình tự nhận biết: Mỗi enzym cắt giới hạn nhận biết một trình tự nocleotide
đặc trƣng. Các trình tự này thƣờng bao gồm từ 4-8 nucleotide (thƣờng là 4 hay 6). Các
RE khác nhau có cùng trình tự nhận biết gọi là isochizomers. Đối với một số RE, trình
tự nhận biết không có tính chuyên biệt tuyệt đối – một số nucleotide của trình tự có thể
đƣợc thay thế bởi nucleotide khác.
Ví dụ : NspI GGGC(A,T)C- vị trí cắt thứ tƣ có thể là C, A, hay T
Bgly GCCNNNNNGGC – N là bất kì nucleotide nào.
Đặc trƣng quan trọng nhất của trình tự nhận biết là chúng có cấu trúc
palyndromic, nghĩa là hai mạch của trình tự hoàn toàn giống nhau khi chúng đƣợc đọc
DNA
đƣợc
methyl
hoá
Enzym cắt
giới hạn
EcoRI
Enzym cắt
giới hạn
EcoRI
DNA
không
đƣợc
methyl
hoá
DNA không
đƣợc methyl
hoá
Phân cắt
Đầu dính
Copyright: Tài liệu đại học ©