51
trung bình khoảng 70 – 80 ng/μl, có thể do lá điều có nhiều chất thứ cấp khác như
polyphenol, polypeptide,…gây khó khăn cho quá trình tách chiết. Một số mẫu có nồng
độ DNA rất thấp (khoảng 30 ng/μl trở xuống) đều là của những mẫu lá non hay những
lá đã trưởng thành nhưng còn mềm.
 Khó khăn: Khó tách DNA từ lá điều còn non. Trong 80 mẫu thực hiện có
25 mẫu lá non cho kết quả tách chiết DNA không tốt (giá trị OD cao hơn 1,8 nhưng
nồng độ DNA rất thấp, khi điện di không thấy kết quả). Lặp lại việc tách 25 mẫu lá
non trên khoảng 2 – 3 lần nhưng vẫn không cho kết quả. Điều này có thể do lá non
đang trong thời kỳ sinh trưởng mạnh nên nồng độ các hợp chất thứ cấp nhiều, ảnh
hưởng không tốt đến việc tách chiết DNA, ngoài ra trong lá non hàm lượng nước cao
làm cho số lượng DNA trong lá non ít hơn lá trưởng thành (hình 4.2).

Hình 4.2 Kết quả tách chiết DNA lá điều tươi còn non
 Biện pháp khắc phục:
Đối với lá điều trưởng thành: Chúng tôi cũng đưa ra một số lưu ý khi
thực hiện quá trình tách chiết:
- Bước 1: Bước này cần phải giữ cho lá không bị khô trước khi
nghiền, công đoạn nghiền phải đều tay, không nghiền mạnh. Sử dụng
máy vortex khuấy trộn kỹ ở tốc độ thấp, khoảng 600 –
1.000 vòng/phút.
TT16 TT20TT23 TT26TT28 TT30

truyền và nhận diện một số band có thể là chỉ thị phân tử
4.2.2.1. Kết quả thí nghiệm 1: Thực hiện theo quy trình của các tác giả nƣớc
ngoài
Bước đầu chúng tôi đã thực hiện theo quy trình của Samal và ctv (2002) đưa ra
nhưng không thấy kết quả với cả 4 primer đã dùng. Kết quả PCR – RAPD với primer
11 được trình bày trên hình 4.3. 53
Hình 4.3 Kết quả điện di sản phẩm PCR – RAPD primer 11 của thí nghiệm 1.
Chúng tôi nhận định có thể do việc sử dụng hóa chất khác nguồn gốc nên việc
áp dụng theo quy trình của các tác giả trên là không phù hợp. Mặt khác chúng tôi nhận
thấy việc thực hiện tới 45 chu kỳ là quá nhiều, vì vậy chúng tôi đưa ra thí nghiệm 2 có
35 chu kỳ phản ứng và nồng độ các thành phần của phản ứng được giữ nguyên.
4.2.2.2 . Kết quả thí nghiệm 2: Giảm số chu kỳ xuống còn 35 chu kỳ và giử
nguyên thành phần hoá chất nhƣ thí nghiệm 1
Sau khi thực hiện PCR – RAPD thu được kết quả với primer 1 và primer 11,
trong khi primer 2 và 9 không có kết quả (hình 4.4).

(C) (D)
Hình 4.5 Kết quả điện di sản phẩm PCR – RAPD của thí nghiệm 3 với primer 11 (C)
và primer 2 (D)
Với primer 2 và 9 chúng tôi nhận thấy không có khả năng nhân bản DNA lá
điều đã thu thập được, vì vậy chúng tôi không sử dụng 2 primer này ở các bước nghiên
cứu tiếp theo. Với primer 1 và 11 chúng tôi nhận thấy primer 11 cho số band nhiều hơn
và các band sáng hơn, do đó chúng tôi chọn primer 11 để tiến hành tiếp. Chúng tôi đã
thử số chu kỳ nhiều hơn với primer 11song kết quả cũng không tốt hơn. Vì vậy chúng
tôi tiến hành thí nghiệm 4 bằng cách thay đổi nồng độ các hóa chất phản ứng và giữ
nguyên 37chu kỳ. Chúng tôi nhận định vấn đề chủ yếu nằm ở việc tối ưu hóa nồng độ
của MgCl
2
, nồng độ của Taq polymerase, dNTPs, primer, vì vậy chúng tôi đưa ra 5
nghiệm thức (NT) thay đổi nồng độ của MgCl
2
kết hợp với việc thay đổi nồng độ của
TT1TT4 TT5 TT6 TT7 TT8
TT1 TT4 TT5 TT6 TT7 TT8
55
Taq polymerase, dNTPs, primer và 1 nghiệm thức giữ nguyên nồng độ các chất như ở
thí nghiệm 3 để làm đối chứng (ĐC).
4.2.2.4 . Kết quả thí nghiệm 4: Thay đổi thành phần hóa chất, thực hiện phản
ứng PCR qua 37 chu kỳ
Tiến hành trên 3 mẫu TT1, TT4 và TT8, chúng tôi thu được kết quả, được
trình bày trong hình 4.6.
hẳn so NT1 và độ sáng của các band cũng tăng lên rõ rệt.
Chúng tôi thấy NT5 và NT6 cho kết quả tốt hơn cả, trong khi NT6 tăng cả
MgCl
2
, Taq polymerase, dNTPs và primer thì NT5 chỉ tăng MgCl
2
và dNTPs, đồng
thời sau một vài lần thực hiện lặp lại NT5 chúng tôi thấy NT5 cho kết quả khá ổn định,
do đó chúng tôi thống nhất chọn NT5 để thực hiện phản ứng PCR – RAPD cho tất cả
các mẫu ly trích được DNA. Quy trình thực hiện phản ứng PCR – RAPD được trình
bày trong bảng 4.2.
Bảng 4.2. Quy trình thực hiện phản ứng PCR – RAPD.
Thành phần hóa chất (25 μl/ống)
Chu trình nhiệt
Taq buffer 10 X
2 mM MgCl
2

0,5 U Taq polymerase
120 μM dNTPs
20 ng primer11
20 ng DNA khuôn.
Thêm nước để đạt 25 μl.
94
o
C – 4 phút.
Lặp lại 37 chu kỳ:
94
o
C – 1 phút;
Hình 4.7 Kết quả điện di sản phẩm phản ứng PCR – RAPD các mẫu từ TT1 – TT13.
Hình 4.7 là kết quả điện di các mẫu từ TT1 – TT13 cho thấy có 3 band đồng
hình và 6 band đa hình. Band đồng hình là những band có ở tất cả các mẫu, band đa
hình là những band có ở mẫu này mà không có ở mẫu kia. Trên hình 4.7 ta thấy mẫu
TT1 không có band 750 base pairs, 2300 base pairs, TT5 không có band 1600 base
pairs, TT6 không có band 1600 base pairs.

Hình 4.8 Kết quả điện di sản phẩm phản ứng PCR – RAPD các mẫu từ TT14 – TT25
Từ hình 4.8 chúng tôi nhận thấy có mẫu TT24 và TT25 cho kết quả không tốt,
vì vậy chúng tôi không sử dụng làm kết quả đánh giá đa dạng di truyền.

TT14 TT15 TT17TT19 TT21 TT22 TT24 TT25 La
Kết quả PCR – RAPD không tốt
TT01 TT04 TT05 TT06 TT07 La TT08 TT09 TT10 TT11 TT12 TT13
Band khó
xác định
Band đa hình
Band đồng hình
Hình 4.9A Kết quả điện di sản phẩm phản ứng PCR – RAPD các mẫu từ TT27–CD53.
Khi sử dụng kỹ thuật RAPD với 11 primer để đánh giá tính đa dạng di truyền
của các giống điều (Samal và ctv, 2002) thì với primer 11 đã thu được 11 band trong
đó có 9 band đa hình và 2 band đồng hình, điều này chứng tỏ primer 11 cho kết quả có
tính đa hình cao và khá ổn định [7] [15].

TT TT TT TT TT VT CD CD La CD CD CD CD BR BR BR CD
27 29 31 33 36 38 39 40 41 43 44 45 46 49 50 53

Band đa hình
59
Hình 4.9B Kết quả điện di sản phẩm phản ứng PCR– RAPD các mẫu từ XM61– M79.
Vì một số band khó nhận biết bằng mắt thường nên chúng tôi sử dụng công cụ
Detectband của phần mềm Quantity One 4.2.1 trong máy Geldoc để phát hiện band.

Có đến 16/17 mẫu là của những cây cho
rất nhiều hoa, ra hoa sớm và năng suất rất
cao, vì vậy chúng tôi giả thuyết có thể
band 600base pairs là chỉ thị phân tử của
những tính trạng ra hoa sớm, rất nhiều
hoa và năng suất rất cao.
700 base pairs
2/41 mẫu, tỉ lệ 5 %.
Mẫu CĐ39 và CĐ41 giống nhau và khá
đặc biệt so với những mẫu khác, trong đó
có tính trạng trái đỏ, rất ngon nhưng ít
hạt. Chúng tôi giả định có thể band
700base pairs này là chỉ thị của tính trạng
trái đỏ và rất ngon.
750 base pairs
35/41 mẫu, tỉ lệ 85 %.
Chưa xác định.
1200 base pairs
25/41 mẫu, tỉ lệ 61 %.
Chưa xác định.
1400 base pairs
27/41 mẫu, tỉ lệ 66 %.
Chưa xác định.
1600 base pairs
26/41 mẫu, tỉ lệ 63 %.
Chưa xác định.
1900 base pairs
35/41 mẫu, tỉ lệ 85 %.
Chưa xác định.
2300 base pairs