1
Chƣơng 1
GIỚI THIỆU
1.1. Đặt vấn đề
Trong những năm gần đây, cây điều (Anacardium occidental L.) đã và đang trở
thành một cây công nghiệp mạnh, có giá trị kinh tế – xã hội cao của nước ta. Hằng
năm, doanh thu từ cây điều đem về cho nước ta hàng trăm triệu USD, trở thành nước
xuất khẩu nhân điều đứng thứ 2 thế giới, vượt qua Ấn Độ, chỉ đứng sau Brazil [4]. Bên
cạnh đó, việc canh tác cây điều còn giúp nước ta giải quyết được những vấn đề xã hội
khác như: phủ xanh đất trống đồi trọc, giải quyết việc làm, đem lại thu nhập ổn định
cho người nông dân ở những vùng đất khô cằn, bạc màu,…Nước ta nằm trong vùng
có khí hậu thuận lợi và có diện tích lớn đất phù hợp cho sự phát triển của cây điều, vì
vậy chúng ta có tiềm năng lớn để phát triển mạnh cây điều.
Tuy nhiên tình hình canh tác cây điều của nước ta nói chung và của tỉnh Bà Rịa –
Vũng Tàu nói riêng không đạt tương xứng như tiềm năng, do đó năng suất bình quân
còn thấp, không đồng đều và không ổn định cả về chất lượng và sản lượng, bắt nguồn
từ việc phát triển cây điều một cách tự phát, không được đầu tư nghiên cứu nghiêm
túc, đặc biệt là những nghiên cứu về các giống điều và kỹ thuật canh tác. Để có thể đề
ra một chiến lược toàn diện phát triển cây điều, điều qua trọng là cần phải đầu tư cho
công tác lai tạo, bảo tồn và phổ biến những giống điều có chất lượng vượt trội so với
những giống hiện có. Muốn vậy trước hết phải đánh giá được mức độ đa dạng di
truyền của quần thể cây điều hiện có. Xuất phát từ yêu cầu đó, được sự phân công của
Bộ môn Công Nghệ Sinh Học–Trường Đại học Nông Lâm Tp.HCM, dưới sự hướng
dẫn của thầy TS. Bùi Minh Trí, chúng tôi thực hiện đề tài: “Bƣớc đầu đánh giá mức
độ đa dạng di truyền của quần thể điều (Anacardium occidental L.) tại tỉnh Bà
Rịa – Vũng Tàu bằng kỹ thuật RAPD và AFLP”.
thực hiện lấy mẫu những cây điều có đặc điểm nổi bật và điển hình, không dựa trên
đặc điểm phân loại giống.
Không có đủ điều kiện để thu thập lượng mẫu lớn.
3
Không có đủ điều kiện để thực hiện phản ứng PCR – RAPD với nhiều
primer và tìm ra quy trình PCR – RAPD tối ưu.
Không có điều kiện để tiến hành kỹ thuật AFLP trên nhiều mẫu và với
nhiều tổ hợp primer do chi phí thực hiện quá cao.
nhưng cành nhánh nhỏ và ngắn, lá thưa thớt, không thể cho nhiều hoa và trái. Thông
thường khoảng cách trồng phổ biến khoảng 8 – 10 m.
Tán cây điều rộng, trung bình khoảng 10 m, có khi đạt 20 m [2].
2.1.2.2. Hệ rễ
Cây điều có rễ cọc và rễ ngang. Ở những vùng đất khô, mạch nước ngầm thấp,
rễ cọc đâm xuống sâu để hút nước, do đó cây điều có khả năng chịu hạn cao và vững
5
chắc. Rễ cọc cây điều trên 5 tuổi có thể sâu khoảng 5 m. Hệ thống rễ ngang mọc cách
mặt đất khoảng 12 cm.
2.1.2.3. Lá
Lá cây điều thuộc loại lá đơn, nguyên. Lá thường có dạng thuôn hay hình
trứng, đuôi lá thường hơi tròn. Lá non có màu xanh hay đỏ tía tùy giống, khi già có
màu xanh thẫm. Theo Rao và Hassan (1957), thời gian trung bình từ khi ra lá non đến
lá trưởng thành khoảng 20 ngày [3].
2.1.2.4. Hoa và quả điều
Hoa điều nhỏ, đài hợp, có năm cánh rời. Khi mới nở cánh hoa có màu trắng
hay vàng có sọc đỏ, sau đó chuyển thành màu hồng sẫm. Hoa điều có hai loại: hoa đực
và hoa lưỡng tính. Hoa đực gồm toàn nhị đực, hoa lưỡng tính có khoảng 8 – 12 nhị
đực và có một nhụy cái ở chính giữa. Nhụy cái gồm một bầu noãn nằm dưới một vòi
dài (dài và mập hơn nhị đực). Theo Copeland (1961), trong bầu noãn chứa một noãn
duy nhất, nếu được thụ tinh sẽ phát triển thành hạt điều [2].
Hoa điều mọc thành từng chùm có từ vài chục đến 1 – 2 trăm hoa, gồm cả hoa
đực và hoa lưỡng tính, trong đó hoa đực chiếm tỉ lệ cao, còn hoa lưỡng tính dao động
từ 0 – 30 % tổng số hoa trong chùm. Số hoa lưỡng tính đậu quả tới chín cho thu hoạch
khoảng 10 %. Những chùm hoa của đầu và cuối vụ thường nhiều hoa đực, những
chùm hoa chính vụ có tỉ lệ hoa lưỡng tính cao. Tỉ lệ hoa lưỡng tính còn tùy thuộc vào
từng cây khác nhau trong vườn. Bình quân tỉ lệ hoa lưỡng tính trong chùm khoảng
bệnh, đất quá khô hoặc úng lầy, thiếu hụt chất dinh dưỡng nghiêm trọng.
Sau khi trồng khoảng 2 – 3 năm, cây điều bắt đầu ra hoa kết trái. Năng suất
giữa các cây trong cùng một vườn, giữa các năm, giữa các vườn điều với nhau thường
khác nhau, phụ thuộc chủ yếu vào giống, kỹ thuật trồng và thời tiết. Năng suất hạt điều
trung bình của nước ta khoảng 1,1 tấn/ha [4].
2.1.3. Đặc điểm sinh thái của cây điều
2.1.3.1. Khí hậu
Các yếu tố thuận lợi cho sự sinh trưởng và phát triển của cây điều :
Chế đô mưa: Theo Ohler (1979), lượng mưa thích hợp giới hạn từ 1.000 –
2.000 mm/năm, có một mùa mưa tập trung, không đến sớm, sau đó là một mùa khô
kéo dài 4 – 6 tháng [2].
7
Chế độ nhiệt: Thích hợp từ 20
o
C – 37
o
C, cực thuận ở 27
o
C [9]. Một điều
ảnh hưởng rõ rệt đến năng suất hạt điều là do sương muối. Khi có nhiều sương muối
trùng với thời kỳ kết hạt non của cây, nhiều hạt non sẽ bị thối đen, năng suất giảm. Cây
điều nước ta thường bị ảnh hưởng nhiều bởi sương muối.
Chế độ ánh sáng: Cây điều là cây ưa sáng hoàn toàn, thích hợp ở những
vùng mà độ dài ngày và đêm bằng nhau và bầu trời quang đãng. Số giờ nắng khoảng
2000 h/năm [3].
Độ ẩm tương đối: Độ ẩm không khí thích hợp từ 65 % – 80 %.
2.1.3.2. Đất đai
trái cũng khác nhau, có khi nhiều khoảng 6 – 10 trái, ít chỉ 1 – 3 trái.
Về quả giả: Khác biệt ở màu sắc, hình dạng, kích cỡ, mùi vị quả giữa các
giống. Có giống quả màu đỏ, màu hồng, màu vàng, đỏ sọc xanh. Có giống quả tròn,
quả dài, quả to hay nhỏ. Có giống quả ngọt khi chín, có giống quả nhạt, khi ăn khé cổ
do có nhiều tananh trong nước quả.
Về hạt và năng suất hạt: Khác biệt về hạt ở các đặc điểm như hình dạng,
kích thước, trọng lượng, tỉ lệ nhân. Có giống hạt tròn mẩy, có giống hạt lép. Có giống
hạt to và nặng, khi chín trọng lượng khô đạt đến 8 g/hạt (khoảng 127 – 132 hạt/kg), có
giống hạt nhỏ, chỉ đạt 3,5 g/hạt (gần 300 hạt/kg). Có giống tỉ lệ nhân đạt 20 % trọng
lượng hạt, cũng có giống đạt 30 % trọng lượng hạt.
2.1.4.2. Phƣơng pháp nhân giống cây điều
Các phương pháp nhân giống điều chủ yếu là chiết, ghép, gieo hạt, tuy nhiên
trong thực tế nông dân thường dùng phương pháp chọn cây điều mẹ tốt để lấy hạt làm
giống. Ngoài ra, hiện nay nông dân thường mua cây giống cao sản từ những công ty
giống.
2.1.5. Sản xuất điều trên thế giới
Từ một cây mọc hoang dại ở vùng Đông Bắc Brazil, ngày nay cây điều được
trồng ở nhiều nơi trên thế giới, chủ yếu ở những nước có nền nông nghiệp khá phát
triển hay những nước đang phát triển. Hiện nay có khoảng 50 nước trồng điều trên
toàn thế giới. Những nước sản xuất điều chủ yếu: Ấn Độ, Brazil, Việt Nam, Guinea-
Bissau, Ivory Coast, Benin, Nigeria, Mozambique, Tanzania,…
9
Bảng2.1. Sản xuất nhân hạt điều của thế giới niên vụ 1997 và 2000 – 2001.
ĐVT: tấn
Nƣớc/khu vực 1997 2000 – 2001
Ấn Độ
70.000
70.000
Cộng 900.000 1.200.000
Nguồn:[4].
Ngoài nhân điều là sản phẩm chính có giá trị kinh tế cao còn có dầu hạt điều
(CNSL – Cashew nut shell liquid) – một sản phẩm tạo ra trong quá trình chế biến hạt
điều lấy nhân xuất khẩu, chiếm khoảng 18 – 23 % trọng lượng hạt điều, có thành phần
chính là acid anacardic và cardol. CNSL là một sản phẩm nguyên liệu đa năng, dùng
cho công nghiệp hóa chất, chế tạo bố thắng, lớp phủ cho các bộ ly hợp, chế tạo các loại
sơn,vecni, các loại nhựa,…Những nước sản xuất CNSL chủ yếu là Brazil, Ấn Độ,
Mozambique, Tanzania,… Ngoài ra trái điều còn dùng làm nguyên liệu trong công
nghiệp chế biến nước giải khát khá phát triển ở một số nước (Brazil, Ấn Độ,…). Gỗ
điều dùng trong các ngành đồ gỗ mỹ nghệ và nội thất gia đình. Bên cạnh đó, cây điều
còn có một số tác dụng chữa bệnh được một số nước sử dụng như: giảm đau, lợi tiểu,
điều trị hen suyễn (Brazil), thuốc sát trùng (Peru),…[3].
10
2.1.6. Sản xuất điều ở Việt Nam
Việt Nam nằm trong khu vực nhiệt đới gió mùa, có khí hậu thuận lợi cho cây điều
phát triển. Cây điều có thể đã được đưa vào nước ta từ thế kỷ 18 hay sớm hơn
(Johnson, 1973) [2], nhưng mãi đến đầu những năm 1975, cây điều mới được trồng
phổ biến để phủ xanh đất trống đồi trọc do bom đạn chiến tranh. Cho đến cuối thập kỷ
80 của thế kỷ 20 chúng ta mới bắt đầu xuất khẩu nhân điều [3]. Kể từ mốc thời gian đó
đến nay, phát triển cây điều không phải lúc nào cũng thuận lợi, có những lúc người
nông dân trồng điều đã phải chặt bỏ hết cả vườn điều để trồng tiêu, cà phê,… do giá
điều quá thấp và mất mùa liên tục. Tuy nhiên hiện nay ngành trồng điều đã và đang
phát triển mạnh, đạt được những thành tựu đáng ghi nhận. Năm 2004, cả nước có hơn
400.000 ha diện tích trồng điều, là năm cho sản lượng cao nhất của ngành điều từ
Nhập khẩu
Hạt điều
thô
Nhân
điều
1986
1987
1988
1989
1990
1991
1992
1993
1994
1995
1996
1997
1998
1999
2000
2001
2002
1530
1449
468
12.000
28.000
31.000
47.000
60.000
27.000
30.000
40.000
30.000
50.000
-
-
33,6
261
286
360
1.400
6.000
9.526
18.257
23.791
33.000
26.000
16.000
30.000
38.000
63.000
14
23
29
10
11
12
Hoa Kỳ
Trung Quốc
Úc
Anh
Hà Lan
Nhật
Canada
Hồng Kông
Đức
New Zealand
Đài Loan
Các nước khác
18
32
17
8
8
3
3
3
2
1
1
1
24
28
18
13
Bảng2.4. Tình hình phát triển sản xuất điều tại Việt Nam dự kiến đến năm 2010.
ĐVT: ha
1997 2005 2010
Toàn quốc 250.000 340.000 500.000
Duyên hải Nam Trung Bộ
Quảng Nam
Quảng Ngãi
Bình Định
Phú Yên
Khánh Hòa
Ninh Thuận
Bình Thuận
61.000
4.000
3.000
15.000
8.000
7.000
3.000
21.000
100.000
10.000
10.000
15.000
15.000
15.000
10.000
Đồng Nai
Bà Rịa – Vũng Tàu
Bình Dương
Bình Phước
Tây Ninh
Tp. Hồ Chí Minh
149.000
35.000
20.000
32.000
50.000
10.000
2.000
170.000
40.000
25.000
28.000
65.000
10.000
2.000
190.000
40.000
30.000
28.000
65.000
25.000
2.000
Đồng bằng sông Cửu Long 13.000 10.000 10.000
Nguồn: [4].
H. Xuyên Mộc
H. Long Đất
H. Côn Đảo
6.257
153
109
1.630
1.387
2.589
384
6
5.102
48
73
413
742
3.575
250
1
6.010
48
71
812
1.272
3.575
231
1
7.316
24
72
2.2. Các kỹ thuật đánh giá tính đa dạng di truyền và phát hiện chỉ thị phân tử
2.2.1. Giới thiệu chung về tính đa dạng di truyền và chỉ thị phân tử
Tế bào là đơn vị của sự sống, được phân ra làm 2 loại: Tế bào tiền nhân
(Prokaryote) và tế bào nhân thật (Eukaryote). Bộ máy di truyền của 2 loại tế bào trên
được hình thành từ 2 loại nucleic acid: DNA (Deoxyribonucleic acid) và RNA
(Ribonucleic acid). Ở sinh vật có tế bào nhân thật (Eukaryote), thông tin di truyền là
phân tử DNA – là chuỗi xoắn kép mạch đôi gồm 2 chuỗi polynucleotide song song, có
trình tự các nucleotide bắt cặp bổ sung với nhau. Các nucleotide được cấu tạo từ 3
thành phần: nhóm photphat, đường ribose và một trong 4 loại bazơ hữu cơ (adenine,
cytoxine, thymine và guanine). Có 4 loại nucleotide khác nhau: A (nucleotide có chứa
base adenine), T (nucleotide có chứa base thymine), C (nucleotide có chứa base
cytoxine) và G (nucleotide có chứa base guanine). Các nucleotide trong cùng một
mạch đơn được nối với nhau bằng liên kết photphat và 2 mạch đơn sắp xếp đối song
với nhau theo nguyên tắc bổ sung A – T, G – C [1] [5] [8].
Trong một loài, các giống khác nhau có trình tự bộ gene khác nhau. Trình tự bộ
gene của các cá thể trong một giống cũng có thể khác nhau, do sự xuất hiện của một
loại đột biến nào đó. Đôi khi sự khác biệt này lại có ý nghĩa về mặt di truyền, do đột
biến xuất hiện tại vị trí của một gene nào đó trong bộ gene của một cá thể, làm cho
gene đó không biểu hiện hay biểu hiện khác đi thành một tính trạng khác với những cá
thể khác cùng giống. Sự khác biệt về di truyền như vậy được gọi là tính đa dạng di
truyền [1].
16
Sự khác nhau về di truyền của các cá thể trong cùng một giống (hay giữa các
giống trong cùng một loài) có thể biểu hiện hay không biểu hiện thành những tính
trạng bên ngoài. Người ta thường tìm kiếm những dấu hiệu để nhận ra được sự khác
nhau về di truyền giữa các cá thể (hoặc giữa các giống), gọi là những chỉ thị [1].
Có 3 loại chỉ thị thường được sử dụng:
người ta càng tìm ra được nhiều kỹ thuật đánh giá đa dạng di truyền và phát hiện chỉ
thị, tuy nhiên có thể được chia ra làm 2 nhóm:
Những kỹ thuật dựa trên kỹ thuật PCR (PCR based): RAPD, STS, SSR,
SSCP, AFLP,…
Kỹ thuật dựa trên kỹ thuật lai DNA – DNA (Non PCR based): điển hình là
RFLP [1] [8].
2.2.2. Kỹ Thuật RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphisms)
Đây là kỹ thuật sinh học phân tử nhằm phát hiện sự khác nhau về di truyền giữa
các cá thể, giữa các giống trong cùng một loài dựa vào sự khác nhau về số lượng và
kích thước của những đoạn DNA được tạo ra do sử dụng những enzyme cắt giới hạn
(restriction enzymes) cắt toàn bộ bộ gene của những cá thể hay giống được nghiên
cứu, sau đó những đoạn DNA được cắt ra này được lai với những probe được đánh dấu
huỳnh quang đã biết, kết quả được quan sát qua màu huỳnh quang phát ra. Sử dụng
đoạn probe chuyên biệt với loài hay giống cần nghiên cứu. Nguyên lý của kỹ thuật này
dựa vào hiện tượng đột biến làm mất hay xuất hiện một vị trí cắt giới hạn, vì vậy kỹ
thuật RFLP có thể phát hiện đột biến mặc dù mức độ tin cậy không cao [1].
2.2.3. Kỹ thuật SSCP (Single – Strand Conformation Polymorphism)
Kỹ thuật này dựa trên giả thuyết: sự khác biệt giữa các DNA do sự thay đổi cấu
trúc của dây đơn DNA có cấu trúc hình học khác nhau, làm cho DNA dịch chuyển trên
gel với tốc độ và khoảng cách di chuyển khác nhau. Sau khi thực hiện phản ứng PCR,
làm biến tính DNA thành dây đơn, điện di và nhuộm bạc. Kỹ thuật SSCP có quy trình
thực hiện khó nhưng kết quả có độ tin cậy không cao [1].
2.2.4. Kỹ thuật STS (Sequence – Tagged Sites)
Do Olson và ctv đề xuất năm 1989, dựa trên nguyên lý: Trình tự một đoạn DNA
chuyên biệt cho loài, thông qua kỹ thuật PCR nhân bản đoạn DNA đó lên hàng triệu
lần và phát hiện qua điện di [6]. Kỹ thuật này có nhược điểm là phải biết trình tự gene
của đối tượng nghiên cứu.
Hình 2.1 Nguyên lý kỹ thuật RAPD
2.2.6.1. Các bƣớc tiến hành kỹ thuật RAPD
Bước 1: Tách chiết DNA
DNA được tách chiết có chất lượng tốt (tương đối sạch và không bị gãy
nhiều).
5
`
5
`
5*
5* 3
`
3
`
3
`
3
`
Primer ngẫu nhiên
Thực hiện PCR với những
primer ngẫu nhiên
Sau phản ứng PCR, kết quả
đem điện di phát hiện band.
20
Sử dụng phương pháp của Doyle và Doyle (1988) [1] [13]. Phương pháp
này sử dụng CTAB (Hexadecyltrimethylammoniumbromid) – một chất tẩy cation hình
Thành phần Tên gọi Bản chất Tác dụng
pH Ức chế hoạt động của
những enzyme phân hủy
(như enzyme DNase hoạt
động ở pH=7).
Tris-HCl Dung dịch đệm Duy trì pH phù hợp.
EDTA ethylenediamine
-tetraacetate
Ức chế những enzyme
phân hủy DNA.
sodium acetat. Muối -Kết hợp với ethanol 100%
kết tủa và rửa sạch DNA.
-Bảo vệ DNA.
CTAB hexadecyltrime-
thylammonium-
bromide.
Chất tẩy cation. -Hòa tan màng tế bào.
-Biến tính protein.
-Thành lập phức hợp với
những protein, polysaccha-
ride.
CIA chloroform-
isoamylalcohol.
Chiết xuất protein và
những polycaccharide.
isopropanol Kết tủa DNA.
ß-mercaptoetha-
nol
Tác nhân phá
hủy màng nhân
dụng kết hợp với những kỹ thuật cao cấp khác để đánh giá đa dạng di truyền và nhận
diện chỉ thị phân tử có độ tin cậy cao [6].
2.2.6.3. Những hạn chế của kỹ thuật RAPD
Kỹ thuật RAPD có độ chính xác không cao, không ổn định (thể hiện ở mức
độ lặp lại giống nhau thấp).
Khả năng nhân bản trong phản ứng PCR cao nhưng khả năng xuất hiện đa
hình thấp và độ tin cậy không cao. Khả năng nhận diện chỉ thị phân tử thấp và có độ
tin cậy không cao [1] [6].
2.2.6.4. Ứng dụng của kỹ thuật RAPD
Kỹ thuật RAPD được phát minh và sử dụng ngay sau khi kỹ thuật PCR ra đời,
mặc dù cho kết quả có độ tin cậy không cao nhưng vẫn còn được sử dụng do ưu điểm
dễ thực hiện và chi phí thấp. Những ứng dụng của kỹ thuật RAPD:
Đánh giá đa dạng di truyền: Đã được áp dụng trên các đối tượng: cúc lai,
cà phê, bắp, đậu nành, lúa mì, lúa mạch, dâu tây, khoai tây, cà chua,…
Nhận diện chỉ thị phân tử: Ở Việt Nam, nghiên cứu đa dạng di truyền và
mối tương quan giữa kiểu gene RGA và kiểu hình phản ánh bệnh đạo ôn của một số
giống lúa ở Việt Nam (Lã Tuấn Nghĩa và ctv, 1999) [1] [6].
23
Xây dựng bản đồ gene: Sử dụng phương pháp BSA kết hợp kỹ thuật RFLP
và RAPD lập bản đồ gene tms – 1 của dòng lúa TGMS (5460S) (Wang và ctv, 1995)
[1] [6].
2.2.7. Kỹ thuật AFLP
2.2.7.1. Nguyên lý kỹ thuật AFLP
Kỹ thuật AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism – đa hình chiều
dài những đoạn DNA được nhân bản) là kỹ thuật sinh học phân tử hiện đại do Zebeau
và Vos (1993) phát minh ra, sau đó được Vos và cộng sự (1995), Vos và Kuiper (1997)
tiếp tục phát triển. Kỹ thuật này dựa trên nền tảng kỹ thuật PCR, bằng cách sử dụng
Giai đoạn gắn những adapter: Adapter là một chuỗi sợi đôi DNA đầu
dính gồm một trình tự khoảng 20 nucleotide đã biết có khả năng bắt cặp bổ xung với
những đoạn DNA vừa được cắt. Mục đích để tạo ra những khuôn DNA có trình tự 2
đầu đã biết, để trong 2 phản ứng PCR sau này người ta sử dụng những primer có trình
tự bổ sung với trình tự của các adapter đã gắn.
Để không cho các đoạn DNA vừa được cắt ra không bắt cặp lại với nhau,
giai đoạn cắt và gắn adapter được thực hiện đồng thời và được coi như một bước.
Bước 3: Nhân bản tiền chọn lọc (Pre – selective amplification)
Thực hiện phản ứng PCR thứ nhất, sử dụng những sản phẩm đã gắn
adapter từ bước 2 làm khuôn DNA, primer nhân bản tiền chọn lọc là những chuỗi
DNA mạch đơn có trình tự bổ sung với các adapter đã sử dụng ở bước 2 và cộng thêm
1 nucleotide ở đầu 3
’
.
Primer nhân bản tiền chọn lọc MseІ = trình tự bổ sung với trình tự
của adapter MseI + 1 nucleotide (thường là C).
Primer nhân bản tiền chọn lọc EcoRІ = trình tự bổ sung với trình tự
của adapter EcoRI + 1 nucleotide (thường là A).
Mục đích để tạo ra sự chọn lọc đầu tiên – tiền chọn lọc ở mức độ thấp
những đoạn DNA được cắt và gắn adapter, đồng thời tăng số lượng của những đoạn có
thể nhân bản (là những đoạn có khả năng bắt cặp với các primer nhân bản tiền chọn
lọc). Với việc thêm 1 nucleotide sẽ giảm bớt được nhiều đoạn có gắn với adapter.
25
Bước này có thể kiểm tra kết quả bằng cách điện di trên gel agarose 1,5 %.
Bước 4: Nhân bản chọn lọc (Selective amplification)
Thực hiện phản ứng PCR thứ hai sử dụng các primer nhân bản chọn lọc có
trình tự tương tự như primer nhân bản tiền chọn lọc, cộng thêm 2 hay 3 nucleotide ở
EcoRІ-AT NED
EcoRІ-TA JOE
EcoRІ-AG JOE
EcoRІ-AA JOE
Copyright: Tài liệu đại học ©