26

thường không gây trở ngại cho việc khuếch đại DNA. Có nhiều cách khác nhau, tuy
nhiên ta sẽ tìm hiểu một phương pháp khá đơn giản. Đó là mẫu dò Taqman.

Hình 2.14: Cơ chế hoạt động của mẫu dò Taqman [43]

Phương pháp Taqman dựa trên khả năng 5‟-3‟ exonuclease của Taq DNA
Polymerase để cắt đứt một mẫu dò trong phản ứng PCR. Taqman thông thường là một
chuỗi oligonucleotide dài khoảng 20-30 base (thường nó có nhiệt độ nóng chảy cao
hơn 10
o
C so với nhiệt độ nóng chảy của mồi) có gắn thuốc nhuộm phát huỳnh quang ở
đầu 5‟ và một thuốc nhuộm hấp thu ở đầu 3‟. Do đầu 3‟ bị khóa, mẫu dò không thể
được kéo dài như một mồi. Trong phản ứng PCR, với sự hiện diện của gen đích, mẫu
dò liên kết đặc hiệu ở giữa hai mồi xuôi và ngược. Khi mẫu dò còn nguyên vẹn, thuốc
nhuộm hấp thu ở gần thuốc nhuộm phát huỳnh quang làm cho tín hiệu huỳnh quang bị
triệt tiêu chủ yếu do hiệu ứng chuyển năng lượng kiểu Forster. Khi phản ứng PCR xảy
ra, hoạt động 5‟-3‟ exonuclease của Taq DNA Polymerase sẽ phá hủy trình tự mẫu dò
khi và chỉ khi mẫu dò này liên kết với gen đích. Lúc này, thuốc nhuộm phát huỳnh
quang sẽ cách xa thuốc nhuộm hấp thu và chúng sẽ phát quang. Vì vậy, lượng DNA
được tích lũy sẽ được phát hiện qua sự gia tăng lượng tín hiệu huỳnh quang. Quá trình
này xảy ra trong mỗi chu kỳ và không gây cản trở việc khuếch đại DNA. Trong
phương pháp này, mẫu dò Taqman phóng thích chất phát quang cộng thêm vào chất
phát quang đã được phóng thích trong các chu kỳ trước đó. Vì vậy lượng tín hiệu
huỳnh quang gia tăng rất nhiều sau mỗi chu kỳ. Phương pháp này sử dụng các chương


thích được đặt ở góc phải phía trước của bộ phận quang học, với chiếc đèn chiếu sáng
từ phải sang trái, vuông góc với trục máy. Ánh sáng bắt nguồn từ chiếc đèn, qua bộ lọc
nhiệt và kính lọc kích thích (nếu mở) và phản chiếu lên 96 giếng trong máy luân nhiệt

28

bằng một hệ thống các tấm kính. Ánh sáng này sẽ kích thích các phân tử huỳnh quang
trong giếng [14].

Hình 2.16: Cấu tạo bộ phận quang học của máy Real-Time PCR [14]

Hệ thống phát hiện chiếm 2 phần 3 phía sau bộ phận quang học. Các phần
chính trong hệ thống phát hiện này bao gồm 1 kính lọc quang học đơn cho tín hiệu
huỳnh quang phát ra và một đầu đọc CCD (charged coupled device). Đầu đọc này có
độ phân giải 350.000 pixel cho phép định lượng riêng biệt tín hiệu huỳnh quang ở mỗi
giếng. Ánh sáng huỳnh quang phát ra từ giếng thí nghiệm sẽ đi qua tấm kính lọc và
được phát hiện bằng đầu đọc CCD [14].

Nguyên tắc định lƣợng bằng kĩ thuật Real-time PCR
Quan hệ định lƣợng
Hàm lượng GMO trong một mẫu thực phẩm được biểu diễn bằng lượng thành
phần biến đổi gen trong tổng lượng thành phần. Để xác định giá trị này, ta cần đo
lường số lượng trình tự một gen đối chiếu cũng như số lượng trình tự đặc trưng cho
GMO. Gen đối chiếu được lựa chọn phải:
- Đặc trưng cho loài
- Hiện diện với số lượng một copy trong bộ gen đơn bội
- Hiện diện ổn định trong các giống khác nhau của cùng một loài

thị phần trăm GMO trên bộ gen đơn bội [42].

Thiết kế thí nghiệm
Một thí nghiệm Real-time PCR được thiết kế như sau:
- Một phản ứng PCR dùng phát hiện và định lượng gen đích (trình tự DNA
đặc trưng cho GMO).

30

- Phản ứng PCR thứ hai được thiết kế để phát hiện và định lượng trình tự một
gen đối chiếu, đặc trưng cho loài và thường sử dụng cho định lượng GMO.
- Đường chuẩn cho gen đích và gen đối chiếu. Trong mỗi thí nghiệm, lượng
gen đích và gen đối chiếu được xác định từ đường chuẩn này. Sau đó, lượng
gen đích được chia cho lượng gen đối chiếu để xác định phần trăm hiện
diện của GMO trong mẫu. Để đạt yêu cầu thống kê, đường chuẩn phải có từ
3 - 4 nồng độ khác nhau. Hình 2.17: Đƣờng chuẩn cho phản ứng định lƣợng [14]

Thêm vào đó, một đối chứng âm (NTC - no template control) cần được thêm
vào trong mỗi thí nghiệm. Những đối chứng khác cũng có thể được sử dụng.
Cuối cùng, thí nghiệm định lượng gen đối chiếu và gen đích phải được thực
hiện trong cùng một lần chạy phản ứng PCR, điều này nhằm tránh những sai lệch
thống kê giữa các thí nghiệm [42].

Phân tích dữ liệu Real-time PCR

được sử dụng làm công cụ để tính toán lượng DNA
ban đầu trong mỗi phản ứng. Chu kỳ ngưỡng này cần được thiết lập phía trên đường
tín hiệu nền và nằm trong pha tăng trưởng hàm mũ, tại nơi mà đồ thị khuếch đại giống
nhau nhất. Thông thường, với hệ máy của công ty Bio-Rad, giá trị chu kỳ ngưỡng do
máy tự động thiết lập, đều này giúp ta tránh những sai sót chủ quan có thể xảy ra khi ta
tự thiết lập chu kỳ. Tuy nhiên, máy vẫn cho phép ta có thể thiết lập chu kỳ ngưỡng
trong những trường hợp đặc biệt [42].

Tính toán hàm lƣợng GMO
Kết quả của phản ứng Real-time PCR là giá trị ΔRn, biểu thị sự khác biệt giữa
giá trị Rn
+
(tín hiệu huỳnh quang của tất cả các mẫu) và Rn
-
(tín hiệu nền của phản ứng
- tín hiệu huỳnh quang ban đầu hay tín hiệu của đối chứng âm).

32

Hàm lượng GMO của một mẫu có thể được tính bằng phương pháp dựng đường
chuẩn dựa trên các nồng độ khác nhau của DNA
- Đường thứ nhất dùng để định lượng gen đối chiếu
- Đường thứ hai dùng định lượng trình tự mục tiêu của GMO
Ở mỗi mẫu thí nghiệm, hàm lượng gen đối chiếu và gen mục tiêu được xác định
bằng cách nội suy trên đường cong chuẩn. Từ đó, tỷ lệ hiện diện của GMO (phần
trăm) sẽ được tính bằng thương số của lượng gen GMO trên lượng gen đối chiếu. Tuy
nhiên, một điều cần chú ý là giá trị mẫu thí nghiệm cần phải nằm trong giá trị cao nhất

sản phẩm nào. Một ví dụ là: Nếu ta phát hiện có trình tự gen Cry IA (b)
trong mẫu hỗn hợp bắp và đậu nành đã chuyển gen Bt thì ta cũng không thể
xác định chính xác thành phần nào đã được chuyển gen và tỷ lệ chuyển gen
là bao nhiêu phần trăm. .
- Phương pháp chuyên biệt xây dựng (construct specific): đối tượng củ
phương pháp này là đoạn trình tự nằm giữa vùng promoter với vùng
enhancer, vùng enhancer với vùng gen mục tiêu hay giữa vùng gen mục tiêu
với vùng terminator. So với hai phương pháp trên, phương pháp này có thể
cho ta biết chính xác hơn thành phần nào đã được chuyển gen do chúng có
thể có sự kết hợp khác nhau giữa các trình tự nói trên. Tuy nhiên, trong
tương lai, nếu một cấu trúc gen chuyển nạp (gồm: promoter, enhancer, gen
và terminator) được sử dụng cho nhiều đối tượng khác nhau thì phương
pháp này cũng không còn chính xác nữa.
- Phương pháp chuyên biệt sự kiện chuyển gen (event specific). Đối tượng
của phương pháp này là đoạn trình tự giữa vùng promoter và vúng gen thực
vật hay giữa vùng terminator với vùng gen thực vật. Do đoạn trình tự này là
độc nhất cho mỗi sự kiện chuyển gen, chúng không chỉ cho phép ta xác định
chính xác thành phần nào đã được biến đổi gen trong mẫu hỗn hợp mà còn
chính xác trong từng sự kiện chuyển gen khi một cấu trúc được chuyển nạp
nhiều lần vào trong cùng một đối tượng. tuy nhiên, phương pháp này vẫn
còn trong giai đoạn phát triển và chưa được ứng dụng rộng rãi.
Trong phạm vi khóa luận này, chúng tôi sử dụng phương pháp đại trà để định
lượng promoter 35S trong mẫu bắp và thực phẩm có chứa bắp. Hạn chế của phương
pháp này là tính chuyên biệt và chính xác không cao bằng 3 phương pháp còn lại.


- Ngoài nước:
Brunnert Hans-Josef , Spener Friedrich and Börchers Torsten, 2001 . PCR-
ELISA for the CaMV-35S promoter as a screening method for genetically modified
Roundup Ready soybeans. Eur Food Res Technol (2001) 213:366–371.
Fukuta Shiro, Mizukami Yuko , et al., 2004. Real-time loop-mediated
isothermal amplification for the CaMV-35S promoter as a screening method for
genetically modified organisms. Eur Food Res Technol (2004) 218:496–500. Định lƣợng GMO đựa trên promoter 35S
M. Hardegger 7 P. Brodmann 7 A. Herrmann, 1999. Quantitative detection of
the 35S promoter and the NOS terminator using quantitative competitive PCR. Eur
Food Res Technol (1999) 209 :83–87.
36

36

PHẦN III: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP TIẾN HÀNH

1. Nội dung nghiên cứu
Trong phạm vi khóa luận này, các nội dung nghiên cứu của chúng tôi bao gồm
các mục sau:
- Xác định quy trình ly trích tốt nhất trong điều kiện thí nghiệm cho mẫu bắp
và thực phẩm có chứa bắp.
- So sánh phương pháp sàng lọc sản phẩm biến đổi gen bằng Real-Time PCR
với phương pháp PCR truyền thống.
- Xác định phương pháp định lượng bằng kĩ thuật Real-Time PCR với hóa
chất là thuốc nhuộm SYBR Green I hay mẫu dò Taqman.
- Đánh giá khả năng định lượng của phương pháp Real-Time PCR.

4. Vật liệu thí nghiệm
Vật liệu thí nghiệm trong khóa luận này được chọn như sau:
- Đối chứng dương: bắp chuyển gen Bt 176 với hàm lượng thành phần chuyển
gen là 1% cấp bởi GeneScan.
- Đối chứng âm: nước siêu sạch.
Các mẫu thí nghiệm được chọn lọc và mua ngẫu nhiên trên thị trường Tp Hồ
Chí Minh và Đồng Nai:

Phƣơng pháp 1:
Định lượng bằng Real-Time PCR
với thuốc nhuộm SYBR Green
Thí nghiệm 2:
Sàng lọc sản phẩm biến đổi gen
Kiểm tra sự hiện diện của promoter 35S
Phƣơng pháp 2:


Phương pháp sàng lọc đề nghị
Phƣơng pháp 2:
Định lượng bằng Real-Time
PCR với mẫu dò Taqman
38

38

Bảng 3.1: Mẫu thí nghiệm
STT
Tên và đặc điểm của mẫu
Kí hiệu
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
Bắp giống 1
Bắp giống 2
Bắp giống 3
Bắp giống 4
Bắp giống 5

trình ly trích DNA như sau:
- Qui trình 1: Tách chiết DNA bằng phương pháp đơn giản [36].
- Qui trình 2: Tách chiết DNA bằng phương pháp CTAB [38].