i

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
 KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP

BƢỚC ĐẦU XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƢỢNG
CÁC SẢN PHẨM BIẾN ĐỔI GEN BẰNG
PHƢƠNG PHÁP REAL-TIME PCR

Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

PHƢƠNG PHÁP REAL-TIME PCR
Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện:
TS. LÊ ĐÌNH ĐÔN NGUYỄN HỮU TRƢỞNG
Th.S NGUYỄN THÁI THỦY Thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 9 – 2005

iii

LỜI CẢM TẠ

Em xin chân thành cảm ơn:
Ban Giám hiệu trường Đại Học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm Bộ
môn Công nghệ sinh học, cùng tất cả quý thầy cô đã truyền đạt kiến thức cho em trong
suốt quá trình học tập tại trường.
Thầy Lê Đình Đôn đã tận tình hướng dẫn, nhận xét và giúp đỡ em hoàn thành

ĐẦU XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƢỢNG CÁC SẢN PHẨM BIẾN ĐỔI
GEN BẰNG PHƢƠNG PHÁP REAL-TIME PCR.
Giáo viên hướng dẫn: TS. Lê Đình Đôn và Th.S Nguyễn Thái Thủy.
Đề tài được thực hiện từ tháng 3/2005 đến tháng 8/2005 tại Phòng thí nghiệm Công
nghệ Sinh học Phân tử (lab B), Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Thành
phố Hồ Chí Minh.
Mục tiêu đề tài: Xây dựng quy trình định lượng bắp biến đổi gen dựa trên promoter 35S
bằng phương pháp Real-Time PCR. Đánh giá khả năng định lượng và hiệu quả của
phương pháp. Định lượng một số mẫu bắp và thực phẩm có chứa bắp trên thị trường Tp
Hồ Chí Minh và phụ cận.
Đề tài đã có những kết quả sau:
Quy trình định lượng sản phẩm biến đổi gen:
- Bước 1: Ly trích DNA mẫu bắp và thực phẩm có chứa bắp. Quy trình đề nghị:
dung dịch phá màng tế bào: CTAB 2%; dung dịch biến tính protein:
phenol/chloroform; dung dịch tủa DNA: isopropanol.
- Bước 2: Sàng lọc bắp biến đổi gen dựa trên promoter 35S. Phương pháp đề nghị:
Real-Time PCR với thuốc nhuộm SYBR Green I.
Kết quả thí nghiệm sàng lọc: sản phẩm có promoter 35S cho vạch khuếch
đại có kích thước 123 bp với nhiệt độ nóng chảy 86-86,5oC.
- Bước 3: Định lượng mẫu bắp biến đổi gen có kết quả sàng lọc dương tính, dựa
trên promoter 35S. Phương pháp đề nghị: Real-Time PCR với mẫu dò Taqman.
Kết quả đánh giá: phương pháp Real-Time PCR có khả năng phát hiện và
định lượng 1 copy gen đích trong mẫu thí nghiệm, định lượng chính xác
một mẫu có tỷ lệ phần trăm chuyển gen biết trước.
- Khảo sát một số mẫu sản phẩm cho thấy, trên thị trường Việt Nam có sản phẩm
chuyển gen ở các dạng thực phẩm và thức ăn khác nhau.


Results: Detection GM maize with p35S PCR amplifiers (123 bp and Tm 86-
86,5
o
C).
- Step 3: GM maize quantification based on 35S promoter.
Method: Real-Time PCR with hybridization probe Taqman.
Quantification ability: Detection and quantification 1 copy of p35S in a
experiment template, exactly quantification a template which percentage
ratio of GMO presentation has known.
- Detection and quantification some food and feed in Ho Chi Minh City has GMO
in its ingredients.
Conclusion: A GM maize quantification process by Real-Time PCR has been
established and can be applied to many other species. vi

MỤC LỤC

LỜI CẢM TẠ iii
TÓM TẮT iv
MỤC LỤC vi
CHỮ VIẾT TẮT xi
DANH MỤC HÌNH xii
DANH MỤC BẢNG xiv
PHẦN I: MỞ ĐẦU 1
1.Đặt vấn đề 1

6.1.1. Nguyên tắc định lượng dựa trên DNA 18
6.1.2. Quy trình xét nghiệm sản phẩm biến đổi gen tại châu Âu 19
6.1.2.1. Quá trình sàng lọc sản phẩm biến đổi gen 19
6.1.2.2. Quá trình định lượng sản phẩm biến đổi gen 19
7. Tình hình Việt Nam 21
7.1.Nghiên cứu và phát triển sinh vật biến đổi gen 21
7.2.Vấn đề thương mại hóa và kiểm soát sinh vật biến đổi gen 21
8. Các phƣơng pháp định lƣợng sản phẩm chuyển gen 22
8.1.Phương pháp ELISA 23
8.2.Quantitative competitive PCR (QC-PCR) [42] 23
8.3.Nguyên tắc kĩ thuật Real-time PCR 24
8.3.1. Hóa chất định lượng 24
8.3.1.1. SYBR Green I 25
8.3.1.2. Mẫu dò phân hủy (Taqman probe) 25
8.3.2. Công cụ phát hiện 27
8.4.Nguyên tắc định lượng bằng kĩ thuật Real-time PCR 28
8.4.1. Quan hệ định lượng 28
8.4.2. Thiết kế thí nghiệm 29
8.4.3. Phân tích dữ liệu Real-time PCR 30
8.4.4. Tính toán hàm lượng GMO 31
8.5.Mức độ chuyên biệt trong phát hiện và định lượng cây trồng biến đổi gen
[9][44]32
8.6.Một số công trình nghiên cứu về phát hiện và định lượng GMO dựa trên
promoter 35S. 34
8.6.1. Phát hiện và sàng lọc GMO dựa trên promoter 35S. 34
8.6.2. Định lượng GMO đựa trên promoter 35S 35
PHẦN III: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP TIẾN HÀNH 36
1.Nội dung nghiên cứu 36
2.Điều kiện tiến hành thí nghiệm 36


7.5.1. Bố trí thí nghiệm 46
7.5.1.1. Xây dựng đường chuẩn định lượng p35S 47
7.5.1.2. Đánh giá kết quả định lượng 48
7.5.2. Thành phần phản ứng PCR 48
7.5.2.1. Đặc điểm 35S master mix 49
7.5.2.2. Đặc điểm SYBR Green I Supermix 49
7.5.3. Chương trình nhiệt thiết lập trên máy Real-Time PCR 49

ix

7.5.4. Cài đặt phần mềm điều khiển 50
7.5.5. Phân tích kết quả thí nghiệm 51
8.Thí nghiệm 4: Đánh giá khả năng định lƣợng của phƣơng pháp Real-Time PCR.
54
8.1.Mục tiêu 54
8.2.Nguyên tắc 54
8.3.Vật liệu thí nghiệm 54
8.4.Trang thiết bị 54
8.5.Hóa chất 54
8.5.1. Đặc điểm 35S và corn-reference master mix 55
8.5.2. Đặc điểm chuẩn 35S và gen tham chiếu (35S và corn reference
calibration DNA standards) 55
8.6.Phương pháp thực hiện 55
8.6.1. Bố trí thí nghiệm 56
8.6.1.1. Độ nhạy phản ứng 56
8.6.1.2. Độ chính xác: 56
8.6.2. Thiết kế phản ứng định lượng 56

4.1.Độ nhạy của phương pháp: 76
4.2.Độ chính xác của phương pháp 78
5.Thí nghiệm 5: Ứng dụng phƣơng pháp định lƣợng Real-Time PCR 79
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 85
1.Kết luận 85
2.Đề nghị 86
TÀI LIỆU THAM KHẢO 87
PHỤ LỤC 92

xi

CHỮ VIẾT TẮT

35S: 35S promoter
Bp: Base pair
Bt: Bacillus thringensis
CaMV: Cauliflower mosaic virus
CCD: Charged coupled device
C
T
: Threshold cycle
CTAB: Cetyl-trimetyl-ammonium-bromide
DNA: Deoxyribonucleic acid
dNTPs: Deoxyribonucleotide triphosphates
EC: European Community
ELISA : Enzyme linked immunosorbent assay
FAO: Food and Agriculture Organization

Hình 2.6: Các quốc gia trồng cây chuyển gen trên thế giới [18] 10
Hình 2.7: Tỷ lệ các loại cây chuyển gen trên thế giới [19] 11
Hình 2.8: Biểu tình phản đối GMO tại châu Âu [27] 15
Hình 2.9: Không yêu cầu dán nhãn [42] 19
Hình 2.10: Bắt buộc phải dán nhãn [42] 19
Hình 2.11: Quy trình kiểm soát GMO tại châu Âu [13] 20
Hình 2.12 : QC-PCR 23
Hình 2.13: Thuốc nhuộm SYBR Green I [43][45] 25
Hình 2.14: Cơ chế hoạt động của mẫu dò Taqman [43] 26
Hình 2.15: Máy Real-Time PCR [8] 27
Hình 2.16: Cấu tạo bộ phận quang học của máy Real-Time PCR [14] 28
Hình 2.17: Đường chuẩn cho phản ứng định lượng [14] 30
Hình 2.18: Đồ thị phản ứng Real-time PCR [14] 31
Hình 2.19: Mức độ chuyên biệt trong phát hiện và định lượng GMO [44] 34
Hình 3.1: Màn hình Melt Curve 45
Hình 3.2: Màn hình Edit Protocol 50
Hình 3.3: Màn hình Edit Plate Setup 51
Hình 3.4: Màn hình View Quantities/Identifiers 51
Hình 3.5: Màn hình View Post-Run Data 52
Hình 3.6: Màn hình PCR Quantification 53
Hình 3.7: Màn hình PCR Standard Curve 53
Hình 4.1: Kết quả điện di của 3 quy trình ly trích 60
Hình 4.2: Kết quả điện di các mẫu sản phẩm 61
Hình 4.3: Kết quả điện di thí nghiệm 2 phương pháp 1 64
Hình 4.4: Đồ thị DNA quantification của các mẫu đối chứng 65
Hình 4.5: Đồ thị DNA quantification của các mẫu thí nghiệm 66
Hình 4.6: Đồ thị Melt curve của mẫu đối chứng 67
Hình 4.7: Đồ thị Melt curve của mẫu thí nghiệm 67
Hình 4.8 : Đồ thị mẫu chuẩn 35S của hai phương pháp 71
Hình 4.9: Đường chuẩn được xây dựng từ các mẫu chuẩn 35S 72