11
có bổ sung BA (5,0mg/L), Ki (0,5mg/L) và IBA (0,5mg/L) là thích hợp cho khả năng
biệt hóa chồi từ mô sẹo. Ở nồng độ BA (3,0mg/L), Ki (0,5mg/L) và IBA (0,5mg/L)
chồi sẽ phát triển mạnh hơn, chồi lớn hơn và khi cắt chồi nuôi cấy trên môi trƣờng MS
thì khả năng tạo rễ và phát triển tốt hơn những môi trƣờng còn lại. Môi trƣờng tạo rễ là
½ MS + NAA (0,1-1,0mg/L) hoặc IBA (0,1-1,0mg/L). Môi trƣờng ½ MS có bổ sung
than hoạt tính (1,0mg/L) là thích hợp để cây ra rễ ở cây hồ tiêu, không cần sử dụng
Auxin cho mục đích ra rễ (Đoàn Thị Ái Thuyền, Thái Xuân Du và Đỗ Văn Giáp, 2003).
2.3.2 Một số công trình nghiên cứu nuôi cấy cây hồ tiêu ở nƣớc ngoài:
Phƣơng pháp vi nhân giống tạo dòng cây hồ tiêu sử dụng các mảnh cấy nhƣ:
đầu rễ, mắt nhánh và chồi ngọn từ cả cây tiêu non và cây trƣởng thành (Mathews và
Rao, 1984; Agarwal, 1988; Philip và ctv. 1992; Nazeem và ctv. 1993; Nirmal Babu và
ctv. 1993; Joseph và ctv. 1996; Lissamma và ctv. 1996). Trong phƣơng pháp vi nhân
giống cây tiêu bị gây trở ngại do sự nhiễm của vi sinh vật (Kelkar và Krishnamurthy,
1996). Trong đó việc nuôi cấy hạt tiêu là ít bị nhiễm nhất. Tốc độ nhân chồi của tiêu
khoảng 6 chồi / 90 ngày nuôi cấy.
Các cây con in vitro phải đƣợc để trong phòng ẩm mát khoảng 20-30 ngày để
cây con có điều kiện phát triển cứng cáp và thích nghi dần với điều kiện sống bên
ngoài. Cây tiêu in vitro phát triển khá tốt trên đồng ruộng. Qua báo cáo sớm về
phƣơng pháp nuôi cấy in vitro cây tiêu (Chua 1981, Fitchet 1988), phenolic đƣợc tiết
ra từ vết cắt của mẫu cấy và vi sinh vật gây nhiễm nội sinh trong mẫu cấy (Mohan
1985, Fitchet 1988) là hai yếu tố ngăn cản qui trình nhân giống in vitro cây tiêu.
Madhusudhanan và Rahiman (1996) báo cáo họ đã sử dụng hoạt chất charcoal
(200mg/L) kết quả là đã làm giảm đƣợc sự hóa nâu mẫu cấy của các giống tiêu
P. nigrum, P. longum, P. attenuatum và P. betle. Sự kết hợp chất kháng sinh
trong môi trƣờng nuôi cấy đã kiểm soát đƣợc vi sinh vật nội sinh trong cây tiêu nuôi
cấy theo Kelkar và Krishnamurthy (1996).
Tái sinh cây tiêu từ nuôi cấy mô sẹo đã đƣợc hệ thống hóa mô sẹo phát triển
thành lá và chồi để tái sinh cây tiêu mới (Nirmal Babu và ctv. 1993, Nazeem và ctv.
1993, Bhat và ctv. 1995). Cây mới đƣợc tái sinh trực tiếp từ mô lá thông qua giai đoạn
mô sẹo (Nirmal Babu và ctv. 1993).

đƣờng cong của loài Coléoptiles họ Graminées. Do có tác dụng trong hoạt động kéo
dài tế bào nên có tên nhƣ vậy. Đây là một chất có nhân indole, có công thức nguyên là
C
10
H
9
O
2
N, có tên là acid indole β acetique hoặc acid β indolylacétique.
13
2.4.1.1 Tính chất sinh lý của Auxin
Auxin can thiệp vào nhiều hiện tƣợng sinh lý, hoạt động của nó phụ thuộc vào
nồng độ và các sự hỗ tƣơng qua lại của chúng với các chất điều hòa khác. Các tác
động của Auxin đƣợc thể hiện nhƣ sau:
Kéo dài tế bào: làm ra tăng tính đàn hồi của thành tế bào và cho sự xâm nhập
của nƣớc vào bên trong tế bào; lúc đó sự đề kháng của thành tế bào giảm đi và
tế bào tự kéo dài ra.
Sự thay đổi về tính thẩm thấu của màng tế bào, sự thay đổi này thể hiện bằng
một sự phóng thích ion H
+
, ion này gây ra một hoạt tính acid có tác dụng làm
giảm tính đề kháng của thành tế bào và bởi sự hấp thu ion K
+
.
Một hoạt động tổng quát trên sự chuyển hóa và đặc biệt là trên sự tổng hợp
ARN robosomique.
Sự kích thích về sự phân chia tế bào đối với các tế bào nguồn gốc cambium.
Hiệu quả này là do chất “histogène” bởi vì nó dẫn đến có nhiều tế bào giống
nhau hoàn toàn, các tế bào này tạo nên một “mô sẹo”.
Hoạt động lên sự tổng hợp ethylene bắt đầu từ một vài nồng độ; chất etylen tham

tiên đƣợc nhận dạng là acid gibbérellique hoặc là GA
3
, kế đến là GA
4
+ GA
7
và GA
7
.
Tất cả các Gibbérelline thể hiện một nhân giống nhau; chúng có sự khác nhau bởi chất
lƣợng và vị trí của các chất gắn trên nhân.
2.4.2.1 Tính chất sinh lý của Gibbérelline
Hoạt động kéo dài các đốt của cây, hoạt động này cũng có thể áp dụng lên các
cuống hoa và điều này cho phép có một sự chín tốt hoặc những phát hoa phát
triển hơn.
Trong nuôi cấy in vitro, Gibbérelline có tác động đối với nhiều đỉnh sinh
trƣởng, nếu thiếu Gibbérelline đỉnh sinh trƣởng thể hiện một dạng hình cầu, tạo
nên các mắt cây.
Hoạt động phức tạp trong sự ra hoa.
Tác động lên sự đậu trái của các trái không hạt.
Tác động gây thức giấc các chồi, mầm ngủ trên các hạt giống làm thuận lợi cho
sự nảy mầm.
Trong lĩnh vực sinh tạo cơ quan thực vật, Gibbérelline cho thấy các hoạt động
đối kháng: chúng dƣờng nhƣ đối ngƣợc với hiện tƣợng phân hóa tế bào. Trong
nuôi cấy in vitro Gibbérelline không đƣợc sử dụng vào mục đích này, nhƣng
15
chúng có công dụng với các mô đã có tổ chức (đỉnh sinh trƣởng, chồi ngọn,
chồi thân…).
2.4.2.2 Gibbérelline trong cây trồng
Gibbérelline đƣợc tìm thấy trong tất cả các loại cây và trong các loại nấm, ở đây

16
Cytokinine có vai trò quan trọng trong nuôi cấy in vitro, nó thể hiện các tính
chất cần thiết để duy trì sự sống của mô, kích thích sự phân chia tế bào và định
hƣớng tế bào trong con đƣờng phân hóa.
2.4.3.2 Cytokinine trong cây trồng
Đƣợc tìm thấy đầu tiên vào năm 1963 trong các phôi còn non của cây ngô (là
zeatine); chất thứ hai là IPA thấy ở trong cây bị nhiễm vi khuẩn corynebacterium
fascines. Chúng định vị ở lá non trong chồi và ở các đầu của rễ cây.



C.
Nhiệt kế để đo nhiệt độ phòng nuôi cây.
Ẩm kế để đo độ ẩm của phòng nuôi cây.

18
3.2.4 Môi trƣờng cơ bản dùng trong thí nghiệm
Môi trƣờng dùng trong thí nghiệm là MS (Murashige & Skoog), gồm các thành
phần sau:
Nguyên tố đa lượng:
NH
4
NO
3
1650 mg/L
KNO
3
1900 mg/L
MgSO
4
.7H
2
O 370 mg/L
KH
2
PO
4

CuSO
4
.5H
2
O 0,025 mg/L
CoCl
2
.6H
2
O 0,025 mg/L
Vitamins:
Inositol 100 mg/L
Nicotinic 0,5 mg/L
Pyridoxin Hcl 0,5 mg/L
Thiamin Hcl 0,1 mg/L
Glyxin 2 mg/L
Fe EDTA:
FeSO
4
.7H
2
O 27,8 mg/L
Na
2
EDTA.2H
2
O 37,3 mg/L

3.3. Vật liệu nuôi cấy
Đối tƣợng đƣợc dùng để thí nghiệm là cây tiêu LadaBelangtoeng.

Số ống
nghiệm

Số chồi
T2
T6
T10
Tetracylin
Tetracylin
Tetracylin
2,5
2,5
2,5
chồi tiêu
chồi tiêu
chồi tiêu
30
30
30
30
30
30

Bảng 3.2 Mô tả thí nghiệm 1b
Tên
NT

Kháng sinh
Nồng độ kháng
sinh (g/L)

dƣới vòi nƣớc cho sạch xà bông.
Cho mẫu vào dung dịch kháng sinh Tetracylin hoặc Streptomycin đã pha sẵn, rồi
bỏ lên máy lắc và tính giờ để lấy mẫu ra.
* Vào tủ cấy:
Rửa lại mẫu bằng nƣớc cất vô trùng 3 lần.
Ngâm mẫu trong dung dịch nƣớc Javel với tỷ lệ giữa nƣớc và Javel là 1:1 trong
khoảng 15 phút.
Rửa sạch Javel trong nƣớc cất vô trùng 3 lần.
Lắc mẫu trong dung dịch cồn 70
o
trong 30 giây.
Rửa lại nƣớc cất vô trùng 3 lần.
Lột bỏ hết lớp lá cho tới khi lộ ra phần ngọn nhỏ màu xanh (không còn phần màu
đen) thì dùng dao cấy bén cắt lấy phần ngọn này (dài khoảng 0,5 – 1 cm).
Đƣa các phần ngọn này vào trong các ống nghiệm đã chuẩn bị sẵn môi trƣờng
của thí nghiệm này là: khoáng MS + 8,5g/L Agar + 10g/L Đƣờng saccharose.
 Điều kiện thí nghiệm:
Môi trƣờng: Các mẫu ngọn đƣợc nuôi trên môi trƣờng khoáng MS + 8,5g/L Agar
+ 10g/L Đƣờng saccharose. Môi trƣờng đã khử trùng ở 1.2 atm, 121
o
C trong thời gian
25 phút.
pH môi trƣờng: 5.8
Thể tích môi trƣờng: 15ml / ống nghiệm
Cƣờng độ ánh sáng: 100µmol/m
2
.s
Thời gian chiếu sáng: 16 giờ / ngày
Nhiệt độ: 25 ± 2
0