xi

DANH SÁCH CÁC HÌNH

HÌNH TRANG
Hình 2.1: Một đợt dịch bệnh do C. cassiicola gây ra trên cây cao su ở Việt Nam 8
Hình 2.2: Hình minh họa phản ứng PCR 11
Hình 2.3: Sơ đồ vùng ITS ở nấm 20
Hình 2.4: Lược đồ các primer trên vùng ITS 20
Hình 3.1: Hình minh họa chu trình nhiệt của phản ứng PCR
dùng trong thí nghiệm 29
Hình 4.1: Triệu chứng bệnh đặc trưng của bệnh rụng lá Corynespora 34
Hình 4.2: Triệu chứng biến thiên của bệnh rụng lá Corynespora 34
Hình 4.3:Triệu chứng của bệnh héo đen đầu lá do nấm Colletotrichum
gloeosporioidies 35
Hình 4.4: Bào tử nấm C. cassiicola dạng đơn dưới kính hiển vi và bào tử nấm
Colletotrichum gloeosporioidies 35
Hình 4. 5: Khuẩn lạc nấm C. cassiicola trên môi trường PDA 36
Hình 4.6: Kết quả ly trích DNA nấm C. cassiicola từ các nguồn khác nhau 37
Hình 4.7: Kết quả điện di sản phẩm PCR một số mẫu nấm C. cassiicola 38
Hình 4.8: Sản phẩm PCR thu nhận được sau khi giảm lượng primer dùng trong
phản ứng PCR 39
Hình 4.9: Kiểm tra kích thước sản phẩm PCR của nấm C. cassiicola và so sánh với
sản phẩm PCR của nấm Beauveria bassiana và Metarhizum anisopliae 40
Hình 4.10: Các sản phẩm tạo thành khi phân cắt sản phẩm
PCR bằng enzyme EcoRI 41
Hình 4.11: Phân cắt các sản phẩm PCR bằng enzyme MspI 42
Hình 4.12: Phân cắt sản phẩm bằng enzyme CfoI 42
Hình 4.13: Phân cắt sản phẩm bằng enzyme RsaI 43

nhiễm bệnh. Trước tình hình đó, người trồng cao su thường được khuyến cáo trồng các
dvt có tính kháng bệnh. Tuy nhiên, khả năng gây bệnh của các dòng C. cassiicola là rất
khác nhau tùy thuộc vào dvt cao su khác nhau và các điều kiện môi trường như nhiệt
độ, độ ẩm, lượng mưa, độ cao và độ màu mỡ của đất. Các nghiên cứu trên thế giới cho
thấy nấm C. cassiicola trên cây cao su có sự phân hóa về di truyền (CFC/INRO Project
Proposal, 1999; Safia và Noor Hisham, 2003). Do vậy, việc xác định sự đa dạng sinh
học, đặc biệt là đa dạng ở mức độ phân tử của C. cassiicola là việc rất cần thiết. Đây 2

chính là tiền đề cho việc xác định các marker phân tử có liên quan đến tính độc của C.
cassiicola và phục vụ cho việc nghiên cứu tính kháng trên các dvt cao su.
Ở Việt Nam, bệnh rụng lá Corynespora trên cây cao su đã được ghi nhận vào tháng
09/1999, gây hại nặng cho các dvt RRIC 103, RRIC 104 và LH 88/372. Hiện nay, số
lượng dvt cao su bị nhiễm bệnh đã tăng lên nhiều, bệnh đã xuất hiện tại một số công ty
cao su ở miền Đông Nam Bộ (Phan Thành Dũng, 2004) và một số tỉnh phía Bắc như
Hà Tây và Nghệ An (Chi Cục Bảo Vệ Thực Vật, 2000). Những nghiên cứu về bệnh
này ở Việt Nam hiện chưa nhiều và mới chỉ dừng lại ở phân tích, đánh giá tình hình
bệnh cũng như tính kháng của một số dvt cao su đối với nấm C. cassiicola. Việc ứng
dụng các kỹ thuật phân tử trong chẩn đoán bệnh và nghiên cứu về nấm C.
cassiicola chưa nhiều trong khi bệnh rụng lá Corynespora ngày càng lan rộng, triệu
chứng bệnh ngày càng biến thiên, càng ngày càng có nhiều dvt cao su bị nhiễm bệnh,
đã trở thành mối lo ngại của nhiều nước trồng cao su.
Xuất phát từ các vấn đề trên, chúng tôi thực hiện đề tài “Phân tích đa dạng di
truyền một số mẫu nấm Corynespora cassiicola (Berk. & Curt.) Wei gây bệnh trên
cây cao su (Hevea brasliensis Muell. Arg) bằng phƣơng pháp RFLP – PCR”.
1.2.Mục đích yêu cầu
1.2.1.Mục đích
Thu thập và phân lập nấm C. cassiicola trên lá cao su bị bệnh có biểu hiện các

50, cây cao su được trồng tại một số vùng Tây Nguyên, miền Trung và một số vùng ở
phía Bắc (Đặng Văn Vinh, 2000). Hiện nay, diện tích cao su của cả nước đạt trên
450.000 ha với sản lượng trên 400.000 tấn /ha (Tổng Công Ty Cao Su Việt Nam,
2004).
Cây cao su là loại cây công nghiệp dài ngày, cung cấp mủ và gỗ cho rất nhiều
ngành công nghiệp. Đây cũng là loại cây có giá trị kinh tế cao trong các lĩnh vực nông
– lâm – công nghiệp. Trong những năm gần đây, sản lượng mủ không ngừng được
nâng cao nhờ những cải tiến về giống, kỹ thuật nông nghiệp, quy trình khai thác,…
Tuy nhiên, những thiệt hại do bệnh gây ra cũng gia tăng đáng kể, một phần do việc
chọn lọc chủ yếu dựa theo hướng sản lượng cao, sinh trưởng nhanh đã làm thất thoát
gen kháng bệnh. Mặt khác, do tình hình thời tiết – khí hậu có nhiều thay đổi và diễn
biến phức tạp, cùng với sự phát triển và chuyên canh cây trồng trên diện rộng trong
vùng khí hậu nóng ẩm, mưa nhiều đã dẫn đến sự phát sinh – phát triển mạnh về cả
chủng loại cũng như mức độ bệnh, gây ảnh hưởng không nhỏ đến vấn đề canh tác và
hiệu quả kinh tế của nó, thiệt hại sản lượng và gia tăng chi phí sản xuất. Hiện nay, cao
su được phát triển mạnh dưới dạng tiểu điền, nên thiệt hại do bệnh gây ra đã ảnh
hưởng trực tiêp đến đời sống của những người trồng cao su. 4

Theo Chee (1976), cây cao su bị trên 550 loài sinh vật tấn công, trong đó có 24 loài
có tầm quan trọng về kinh tế. Theo Nguyễn Hải Đường (1997), có 24 loại bệnh gây
hại trên cây cao su tại Việt Nam.

2.2. Sơ lƣợc về nấm C. cassiicola (Berk. & Curt.) Wei
2.2.1. Lịch sử phát hiện
Cooke (1896) ghi nhận Cercospora melonis là tác nhân gây đốm lá dưa hấu và
dưa leo tại Mỹ. Năm 1906, Gusgow ghi nhận loại nấm tương tự trên dưa leo tại
Đức và đặt tên nó là Corynespora maizei. Năm 1980, Lindau khẳng định các tác

C. cassiicola có thể gây hại cho tất cả các bộ phận của cây và gây ra các bệnh:
leaf fire, leaf spot, target spot, frog eye, late blight, ring spot, brown leaf
sprot…(Phan Thành Dũng dẫn nhập, 1995)
2.2.4. Đặc tính sinh học của C. cassiicola
C. cassiicola (Berk and Curt) Wei có khả năng sống ký sinh trên thực vật cũng
như có khả năng sống hoại sinh trên xác bã thực vật (Ellis và Holiday, 1971).
Khuẩn ty của nấm có màu xám đến nâu và biến thiên rất nhiều về hình thái,
hình dạng bào tử trên vết bệnh cũng như trong môi trường nhân tạo. Bào tử trên lá
có màu nâu nhạt, dạng hình lưỡi liềm, có chứa nhiều vết ngăn với chiều dài đôi khi
lên đến 700 m.
Ellis và Holiday (1971) mô tả khuẩn lạc của nấm có màu xám đến nâu. Bào tử
dạng đơn hay kết thành chuỗi, biến thiên về kích thước và hình dạng.
Nấm dễ dàng phát triển trên môi trường nhân tạo nhưng rất khó hình thành bào
tử. Sử dụng môi trường PDA cải thiện đáng kể khả năng hình thành bào tử của
C. cassiicola phân lập được từ đậu nành.
C. cassiicola có khả năng phát triển trong khoảng nhiệt độ 8 – 36
o
C trên môi
trường PDA, thích hợp nhất ở 28
o
C, ngưng phát triển ở nhiệt độ trên 40
o
C.
C. cassiicola trên các ký chủ khác nhau có nhiệt độ phát triển tối ưu khác nhau.
Khuẩn ty của C. cassiicola phát triển tốt trong điều kiện tối. Khuẩn lạc hình
thành thay đổi theo mức độ chiếu sáng, phát triển rộng và mỏng dưới ánh sáng
huỳnh quang, dày và tụ lại trong điều kiện tối.
Đối với C. cassiicola trên cây cao su, khuẩn lạc phát triển tốt nhất trên môi
trường PDA ở nhiệt độ 28
o

– 1988 và 400 ha phải nhổ để trồng lại với ước tính thiệt hại khoảng 200 triệu
Rp. Một số dvt kéo dài thời kỳ kiến thiết cơ bản 8 – 10 năm và làm giảm sản
lượng 30 – 50 % đối với vườn khai thác (Sinulinga, 1996; Sujanto và Irwan
Suhendry, 2000).
Diễn biến của bệnh trên các dvt theo từng năm được ghi nhận như sau:
- 1980: RRIC 103.
- 1982: PNN 2058, 2444, 2447.
- 1984: GT 1, KRS 21, FX 25, BPM 6, RRIM 725. 7

- 1991: RRIM 600.
- 1995: IAN 873.
- 1999: AV 2037.
2.3.2.2. Malaysia
Ghi nhận tại vườn ương trên dvt RRIC 52 và FX 25. Năm 1985, dịch bệnh
bùng phát gây hại nặng cho RRIC 103, KRS 21 và RRIM 725. Hiện nay bệnh
ghi nhận tại tất cả các vùng trồng cao su trong cả nước, nặng nhất tại Johor Baru
và Trengganu. Các dvt bị nhiễm bệnh bao gồm GT 1, RRIM 600, 701, 702, 703,
712, 725, 901, 2009, 2020, PR 261, IAN 873, PB 217 (Shukhor S.K. and Hidir
S.M., 1996).
2.3.2.3. Sri Lanka
Là nước thiệt hại nặng nề nhất, bệnh lần đầu tiên xuất hiện tại 9 địa phương
trong vườn nhân sau đó gây hại nặng trên toàn quốc. 4.300 ha dvt RRIC 103, là
dvt cao sản được khuyến cáo trồng đại trà (2.400 ha của đại điền và 1.900 ha
của tiểu điền chiếm 3% diện tích trồng cao su cả nước lúc bấy giờ), phải nhổ bỏ
và trồng lại bằng dvt kháng bệnh. Chính phủ phải bồi thường 64 triệu Rp cho
người trồng cao su bị thiệt hại. Các tiến bộ về giống bị khựng lại (thay thế PB
86 bằng các dvt cao sản thuộc RRIC 100’ s series), buộc phải duy trì dvt có sản

2.3.2.7. Việt Nam
Bệnh xuất hiện lần đầu vào tháng 8 năm 1999 tại trại thực nghiệm cao su Lai
Khê, Viện Nghiên Cứu Cao Su Việt Nam. Dvt LH 88/372, RRIC 103 và RRIC
104 bị hại nặng và phải cưa bỏ và xử lý bằng 0,5 % Benlate C 50 WP. Theo một
số ghi nhận ban đầu, bệnh gây thiệt hại về sinh trưởng và sản lượng do tán lá
không đủ để cây sinh trưởng và duy trì sản lượng. Một số vườn khai thác bị hại
nặng có sản lượng chỉ bằng 1/3 -1/2 so với vườn cây có cùng điều kiện không bị
nhiễm bệnh. Sinh trưởng cũng chậm, tỷ lệ khô miệng cạo và cỏ trong vườn cũng
gia tăng hơn so với vườn cây không bị hại. Ngoài ra, cùng dvt và tuổi cây, bệnh
phân bố khác nhau, trong đó gây hại nặng tại những vùng thấp ẩm ướt hơn so
với vùng cao có điều kiện thông thoáng hơn (Phan Thành Dũng và Nguyễn Thái
Hoan, 1999 và 2000).
9 Hình 2.1: Một đợt dịch bệnh do C. cassiicola gây ra trên cây cao su ở Việt Nam.
Nguồn: Bộ Môn BVTV/VNCCSVN.
2.3.3. Đặc tính sinh học của nấm C. cassiicola trên cây cao su
Khuẩn ty của nấm có màu xám đến nâu, rất biến thiên về hình thái, hình dạng
bào tử trên vết bệnh cũng như trên môi trường nhân tạo. Bào tử trên lá có màu nâu
nhạt với dạng hình lưỡi liềm chứa nhiều vết ngăn với chiều dài biến thiên, đôi khi
đạt 700 m. Bào tử dạng đơn đôi khi dạng chuỗi dính với nhau ở hai đầu gọi là
hilum, phát tán nhờ gió.
Bào tử phóng thích vào ban ngày và cao điểm từ 8 – 11 giờ sáng. Sau thời gian
mưa nhiều và tiếp theo nắng ráo, số lượng bào tử phóng thích nhiều nhất do nấm
cần ẩm độ cao để hình thành bào tử. Bào tử có khả năng tồn tại trên các vết bệnh
cũng như trong đất với thời gian kéo dài, trên lá cao su khô nấm vẫn tồn tại và giữ