11

2.2.2.3. Nấm bào ngư Pleurotus pulmonarius
Phần lớn đƣợc nhập từ nƣớc ngoài (Hình 2.3). Nhƣng gần đây, GS. Lê Xuân
Thám và cộng sự (1999) phát hiện đƣợc một loại khác ở Daklak - Tây Nguyên, sau đó
đƣa về Đà Lạt và đã hoàn thiện quy trình trồng trên mùn cƣa [7] .

2.2.2.4. Nấm bào ngƣ Pleurotus abalonus
Nấm này có nguồn gốc từ Đài Loan. Là một loài nấm ƣa nóng nên rất thuận lợi
để phát triển nuôi trồng trong điều kiện khí hậu của Việt Nam [1]. Nấm này có đặc
điểm là quả thể rất to (Hình 2.4), đƣờng kính mũ nấm có thể đạt đến 35 cm [2].
Ngoài ra còn một loài khác cũng đang đƣợc trồng ở Việt Nam nhƣ Pleurotus
eryngii, Pleurotus flabellatus. Và mới đây (2005) Thạc sĩ Cổ Đức Trọng đã trồng
thành công 2 loài nấm bào ngƣ mới: Pleurotus citrinopileatus Singer Pleurotus (quả
thể màu vàng) và Pleurotus djamor (quả thể có màu hồng)[7].
Hình 2.6. Pleurotus floridanus
Hình 2.3. Pleurotus pulmonarius
Hình 2.4. Pleurotus abalonus
Hình 2.5 Pleurotus sp. 12
2.3. Phƣơng pháp sắc ký - Phân tích amino acid
2.3.1. Đặc điểm chung của phƣơng pháp sắc ký
Phƣơng pháp sắc ký đƣợc phát triển vào đầu tiên bởi Mikhail Semyonovich Tsvet
(1901) trong quá trình nghiên cứu về chlorophyll. Đến năm 1952, Archer John Porter
Martin and Richard Laurence Millington Synge đã đoạt giải Nobel hóa học về sắc ký
phân tách. Từ đó kỹ thuật sắc ký ngày vàng đƣợc phát triển cao hơn cho đến ngày nay [24].
Sắc ký là phƣơng pháp phân tách, phân li, phân tích các chất dựa vào sự phân


Dạng sắc ký

Pha động

Pha tĩnh
Cách bố trí
pha tĩnh
Cơ chế trao
đổi chất
Khí
Khí- hấp phụ
Khí -lỏng
Lỏng
Lỏng - rắn
Lỏng - lỏng
Lỏng - nhựa trao đổi
Lớp mỏng
Rây (sắc ký gel)

Khí
Khí

Lỏng
Lỏng
Lỏng
Lỏng
Lỏng

Rắn

sắc ký giấy (paper chromatography), sắc ký lớp mỏng (thin layer chomatography-
TLC), sắc ký khí (gas chromatography), sắc ký trao đổi ion (ion exchange
chromatography), sắc ký lỏng cao áp (high performance liquid chromatography), điện
di mao quản (capillary electrophoresis) [15].
2.4.1. Sắc ký giấy (Paper chromatograhhy)
- Quá trình phân tách đƣợc thực hiện trên giấy sắc ký hoặc giấy lọc (Hình 2.7).
- Dùng viết chì, vẽ một đƣờng mảnh trên gốc của giấy (1,5 - 2 cm). đánh
những dấu nhỏ dọc theo đƣờng vừa kẻ.
- Dùng pipett hút lƣợng mẫu với thể tích nhất định cho vào những dấu vừa
mới đánh. Để khô, tiếp tục cho vào mẫu thứ 2 trên đầu tube khác nhau. Làm khô.
- Đặt chúng vào bồn sắc ký (cho dung môi ngập khoảng 1cm giấy sắc ký).
- Để bồn ở nơi mát tránh ánh sáng trực tiếp, khoảng 1 giờ.
14

- Lấy ra, dùng viết chì kẻ đƣờng đánh dấu nơi mà dung môi di chuyển. Làm khô.
- Phun ninhydrin vào toàn bộ mặt giấy. Để khô. Tính giá trị Rf. [24]
- Đối với sắc ký giấy dùng cho phân tích amino acid, các nhà phân tích
còn dùng sắc ký cuộn tròn và sắc ký giấy tròn.

2.4.2. Sắc ký lớp mỏng ( Thin layer chromatography _TLC)
Trong phƣơng pháp này, pha tĩnh là một lớp mỏng chất hấp phụ đƣợc gắn vào
một giá mang thƣờng là bản thủy tinh và pha động đi qua lớp mỏng này bằng lực mao dẫn.
Trong TLC một chiều, các thành phần trong mẫu đƣợc tách rời nhau bằng một
lần chạy sắc ký với một dung môi nào đó, còn TLC hai chiều là một kỹ thuật sắc ký có
khả năng tách mạnh bằng hai lần chạy sắc ký với hai chiều vuông góc nhau và với hai
hệ dung môi khác nhau [7].
Quy trình phân tích amino acid trên TLC [23]

Sự tƣơng tác giữa chất tan với pha động và pha tĩnh có thể phụ thuộc vào sự
chọn lựa khác nhau cả dung môi và pha tĩnh. Kết quả HPLC sẽ thu đƣợc nhiều cấu tử
khác nhau mà các kỹ thuật sắc ký khác không thực hiện đƣợc và nó dễ dàng phân tách
số lƣợng lớn các chất hoá học trộn lẫn vào nhau.

2.4.3.1. Pha tĩnh
Tùy theo mẫu phân tích mà ta có có mô hình pha tĩnh khác nhau.
Liquid - Solid Dựa trên độ phân cực. Những cấu tử nào có độ phân cực mạnh
sẽ liên kết chặ với pha tĩnh hơn những chất có độ phân cực yếu hơn. Vì thế những chất
ít phân cực sẽ bị lôi cuốn ra khỏi cột nhanh hơn. 16
Size - Exclusion Dựa trên kích thuớc phân tử của thành phần đƣợc phân tích.
Pha tĩnh chứa các hạt xốp bên trong có nhiều lỗ nhỏ. Những thành phần có kích thƣớc
lớn hơn hạt sẽ bị loại ra ngoài và đƣợc tách rửa đầu tiên. Những cấu tử có kích thƣớc
phù hợp sẽ bị hấp thu và lỗ và đƣợc tách rửa sau.
Normal phase (pha bình thƣờng) Pha tĩnh phân cực cao hơn độ phân cực của
dung môi pha động .
Reverse Phase (ngƣợc pha) pha tĩnh có độ phân cực thấp, pha động có độ phân
cực cao hơn.

Ion-Exchange đƣợc tiến hành dựa trên sự thay thế những ion trong mẫu với
những ion trái dấu trong pha tĩnh. Khi đó pha tĩnh sẽ giữ lại mẫu và pha động di
chuyển qua cột sẽ thế chỗ cho ion mẫu và đẩy mẫu ra khỏi cột.

2.4.3.2. Pha động
Tùy thuộc vào mô hình của HPLC mà pha động có thể thay đổi. Đối với pha
bình thƣờng, thì dung môi thƣờng là không phân cực còn đối với mô hình ngƣợc pha
thì thì thƣờng sử dụng có sự pha trộn giữa nƣớc và một vài dung môi hữu cơ phân cực

- Tạo dẫn xuất.
- Phân tách amino acid trên hệ thống sắc ký
- Phân tích dữ liệu và tính toán.
Trƣớc khi tiến hành phân tích amino acid, quá trình chuẩn bị mẫu cũng đóng vai
trò rất quan trọng vì nếu không chuẩn bị kỹ sẽ rất dễ bị nhiễm trong quá trình phân tích.
- Mẫu đƣợc đặt trong một tube sạch.
- Tất cả mẫu đƣợc làm khô trƣớc khi phân tích.
Trong quá trình tiến hành phải đeo găng tay , tuy nhiên tránh các bụi trên găng
tay bám vào mẫu.
18
2.5.1. Quá trình thủy phân (Hydrolysis)
Để phân tích amino acid trong mẫu protein, mẫu phải đƣợc thủy phân tạo thành
những amino acid đơn.
Thủy phân bằng acid là phƣơng pháp thông thƣờng nhất để thủy phân protein
trƣớc khi tiến hành pnân tích amino acid. Phƣơng pháp thủy phân bằng acid có thể tạo
ra sự phân cắt khác nhau đối với một vài amino acid- phá hủy hoàn toàn hoặc một
phần. Một số khó khăn khi thủy phân bằng acid.
- Trytophan bị phá hủy hoàn toàn
- Serine và threonine bị phá hủy một phần
- Methionine có thể bị oxy hóa
- Cysteine thƣờng đƣợc phát hiện nhƣ là cystine (nhƣng cystine thƣờng
đƣợc phát hiện rất kém bởi vì chúng bị phân hủy một phần).
- Asparagine và glutamine tƣơng ứng bị chuyển thành acid aspartic và
acid glutamic.
Nhƣ vậy, nếu kỹ thuật thủy phân không tốt có thể gây ra nhiều kết quả không chính xác.
Một số phƣơng pháp thủy phân thƣờng đƣợc sử dụng trong HPLC.
Phƣơng pháp 1: Dùng HCl 6N và phenol (từ 0.1- 1 %)

2.5.2. Quá trình tạo dẫn xuất (Derivatisation) [17]
Những amino acid sẽ không đƣợc phát hiện nếu chúng không đƣợc tạo dẫn xuất.
Hiện nay có rất nhiều phƣơng pháp tạo dẫn xuất, sự chọn lựa bất kỳ một kỹ
thuật nào phụ thuộc vào độ nhạy, thời gian phân tích và độ chính xác của phƣơng pháp.
Nói chung một nữa trong số kỹ thuật phân tách amino acid là kỹ thuật sắc ký
trao đổi ion kèm theo postcolumn (ninhydrin hay o – phthaladehyde). Kỹ thuật phát
hiện bằng postcolumn chỉ yêu cầu với lƣợng mẫu nhỏ (khoảng 5-10 µg protein trong
một lần phân tích).
Kỹ thuật phân tích amino acid liên quan đến tạo dẫn xuất precolumn cũng đƣợc
ứng dụng rất rộng rãi và yêu cầu là HPLC ngƣợc pha. Kỹ thuật này rất nhạy nên đòi
hỏi lƣợng mẫu phân tích rất nhỏ chỉ khoảng 0.5-1 µg.
Phƣơng pháp phát hiện bằng ninhydrin postcolumn
Phƣơng pháp sắc ký trao đổi ion với ninhydrin postcolumn là một trong những
phƣơng pháp đƣợc ứng dụng nhiều nhất trong kỹ thuật định lƣợng amino acid.
Sau khi amino acid đƣợc phân tách trên sắc ký sẽ đƣợc phát hiện thông qua
phản ứng của chúng với ninhydrin sẽ tạo màu vàng hay màu tím. Những amino acid
thƣờng cho màu tím sẽ đƣợc phát hiện ở bƣớc sóng hấp thụ là 570 nm. Những amino
acid cho màu nhƣ là proline thƣờng đƣợc phát hiện ở bƣớc sóng 440 nm. Ngoài 20
ninhydrin, o – phthalaldehyde (OPA) cũng đƣợc sử dụng trong phân tích postcolumn.
Bƣớc sóng phát hiện của phƣơng pháp này thƣờng vào khoảng 348 - 450 nm.
Đối với phƣơng pháp precolumn thì tác nhân tạo dẫn xuất thƣờng đƣợc sử dụng
là phenylisothiocyanate (PITC). PITC phản ứng với amino acid ở nhiệt độ phòng trong
vòng 5-10 phút (Pierce Chemical company, 1999) tạo thành phenylisocarbamyl (PTC)
và có thể đƣợc phát hiện ở bƣớc sóng 254 nm. Vì thế tạo dẫn xuất amin acid với PITC
thông qua sắc ký ngƣợc pha (reversed-phase HPLC) có thể đƣợc sử dụng để phân tích
định lƣợng amino acid với detector UV.
Với phƣơng pháp này, giới hạn phát hiện cho phần lớn những amino acid là