BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
***000*** KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
NUÔI TRỒNG VÀ XÁC ĐỊNH THÀNH PHẨN AMINO ACID
CỦA MỘT SỐ LOÀI NẤM BÀO NGƢ (Pleurotus spp.)
BẰNG KỸ THUẬT SẮC KÝ LỎNG CAO ÁP
(High performance liquid chromatography - HPLC)
Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Niên khóa: 2001-2005
Sinh viên thực hiện: ĐOÀN BẢO QUỐC Thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 9/2005 ii
LỜI CẢM TẠ
CHÂN THÀNH CẢM ƠN:
Ban Giám Hiệu Trƣờng Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh.
Bộ môn Công Nghệ Sinh Học
Bộ môn Bảo vệ Thực vật
Quí thầy cô đã truyền đạt kiến thức cho chúng tôi trong suốt quá trình học tại
trƣờng.
TRÂN TRỌNG BIẾT ƠN
Thầy Lê Đình Đôn đã tận tình hƣớng dẫn, tạo mọi điều kiện giúp đỡ chúng tôi
hoàn thành khóa luận này.
Thầy Bùi Cách Tuyến, Thầy Bùi Minh Trí đã tạo điều kiện cho tôi thực tập tại
Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hóa Sinh.
Cô Trần Thị Dung, Thầy Lƣu Phúc Lợi, Thầy Nguyễn Văn Cƣờng, Anh Mai
Huy Hoàng đã giúp tôi có trang thiết bị cũng nhƣ phòng thí nghiệm để hoàn thành
khóa luận.
Các anh chị ở Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hóa Sinh, Đại Học Nông
Lâm TP. Hồ Chí Minh đã nhiệt tình giúp đỡ tôi hòan thành khóa luận.
Anh Lê Viết Ngọc Viện hạt nhân Đà Lạt, anh Hoàng trƣờng Đại học Khoa Học
Tự Nhiên Thành phố Hồ Chí Minh đã cung cấp giống nấm bào ngƣ cho tôi thực hiện
khóa luận.
Các thành viên lớp Công Nghệ Sinh Học 27 đã động viên, giúp đỡ tôi trong thời
Lời cảm ta ................................................................................................................ i
Tóm tắt .................................................................................................................... ii
Mục lục .................................................................................................................. iii
Danh sách các chữ viết tắt ..................................................................................... vi
Danh sách các hình ............................................................................................... vii
Danh sách các bảng ............................................................................................. viii
1. MỞ ĐẦU ..................................................................................................... 1
1.1. Đặt vấn đề .......................................................................................... 1
1.2. Mục đích ............................................................................................ 2
1.3. Yêu cầu ................................................................................................
1.4. Nội dung thực hiện ............................................................................ 2
2. TỔNG QUAN ............................................................................................. 3
2.1. Nấm trồng .......................................................................................... 3
2.1.1. Khái niệm về nấm ........................................................................ 3
2.1.2. Sinh sản và chu trình sống ........................................................... 5
2.1.3.. Đặc điểm biến dƣỡng và sinh lý ................................................. 7
2.2. Nấm bào ngƣ ...................................................................................... 8
2.2.1. Giới thiệu ..................................................................................... 8
2.2.2. Một số loài nấm bào ngƣ đƣợc nuôi trồng ở VIệt Nam .............. 9
2.2.2.1. Nấm bào ngƣ Pleurotus florida ........................................ 10
2.2.2.2. Nấm bào ngƣ Pleurotus sajor-caju ................................... 10
2.2.2.3. Nấm bào ngƣ Pleurotus pulmonarius ............................... 11
2.2.2.4. Nấm bào ngƣ Pleurotus abalonus ..................................... 11
2.3. Phƣơng pháp sắc ký ......................................................................... 12
2.3.1. Đặc điểm chung của phƣơng pháp sắc ký ................................. 12
2.3.2. Cơ sở của phƣơng pháp sắc ký .................................................. 12
2.4. Một số phƣơng pháp sắc ký trong phân tich amino acid ................. 13
v
2.4.1. Sắc ký giấy (Paper chromatography) ......................................... 13
3.3.3.1.Thủy phân mẫu ................................................................... 26
vi
3.3.3.2. Tạo dẫn xuất: ..................................................................... 27
3.3.3.3. Phân tích HPLC ................................................................. 28
3.3.3.4. Phân tích và tính toán kết quả ........................................... 28
4.. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................................ 29
4.1. Kết quả ............................................................................................. 29
4.1.1. Kết quả trồng nấm ...................................................................... 29
4.1.1.1. Sự tăng trƣởng của hệ sợi trên các môi trƣờng ................. 29
4.1.1.2. Sự hình thành quả thể ........................................................ 30
4.1.2. Kết quả phân tích amino acid .................................................... 32
5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ...................................................................... 35
5.1. Kết luận ............................................................................................ 35
5.2. Đề nghị............................................................................................. 35
6. TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................ 36 viii
DANH SÁCH CÁC HÌNH HÌNH .......................................................................................................... TRANG
Hình 2.1. Cấc trúc tế bào nấm ................................................................................ 3
Hình 2.2. Chu kỳ sống của nấm đảm...................................................................... 6
Hình 2.3. Pleurotus pulmonarius ......................................................................... 11
Hình 2.4. Pleurotus abalonus ............................................................................... 11
Hình 2.5 Pleurotus sp .......................................................................................... 11
Hình 2.6. Pleurotus floridanus ............................................................................. 11
Hình 2.7. Mô hình sắc ký giấy ............................................................................. 14
Hình 2.8. Mô hình sắc ký lớp mỏng ..................................................................... 14
Hình 2.9. Bộ dụng cụ HPLC ................................................................................ 16
Hình 2.10. Thủy phân protein bằng HCl .............................................................. 18
Hình 2.11. Tạo dẫn xuất amino acid bằng PITC .................................................. 20
Hình 2.12. Kết quả phân tích amino acid trên Pleurotus sp bởi sắc ký giấy tròn ..... 22
Hình 4.1. Sinh trƣởng trên môi trƣờng hạt của Pleurotus floridanus, Pleurotus
flabellatus, Pleurotus flabellatus .......................................................................... 31
Hình 4.2. Pleurotus abalonus trên giá mô .................................................................. 31
Hình 4.3. Bào tử Pleurotus abalonus ................................................................... 31
Hình 4.4. Bào tử đảm Pleurotus floridanus ...................................................................................... 31
biến, nấm còn đƣợc xem nhƣ là một loại “rau sạch” và có giá trị dƣợc liệu. Sản lƣợng
nấm bào ngƣ tăng lên rất nhanh trong vài thập kỷ qua. Theo thống kê của Chang và ctv
(1999) chỉ trong vòng 36 năm trở lại đây tổng sản lƣợng nấm trồng tăng gấp 21 lần từ
350.000 năm 1965 tăng lên 7,5 triệu tấn, trong đó nấm bào ngƣ Pleurotus spp. tăng từ
169000 tấn năm 1986 lên 876000 tấn năm1997.
Gần đây, Việt Nam cũng đang phát triển công nghệ trồng nấm trong nƣớc. Vì
thế, ngoài việc khai thác nấm hoang dại đem về trồng, nƣớc ta còn nhập khẩu nhiều
loại nấm bào ngƣ khác từ nƣớc ngoài nhƣ Trung Quốc, Đài Loan, Nhật Bản. Trong số
đó, có một số loài đã đƣợc biết rất rõ về thành phần dinh dƣỡng, một số loài còn lại
thành phần này vẫn chƣa đƣợc công bố chính thức, đặc biệt là thành phần amino acid.
Vì thế, việc xác định thành phần amino acid trên nấm bào ngƣ đối với Việt Nam là
điều cần thiết để có thể đánh giá giá trị sinh học, cũng nhƣ so sánh sự khác nhau giữa
chúng. Từ xƣa đến nay, việc xác định amino acid đã đƣợc thực hiện trên rất nhiều
công cụ khác nhau nhƣ: sắc ký giấy, sắc ký lớp mỏng. Phân tích amino acid trên các
công cụ phân tích truyền thống này thì đòi hỏi nhiều thời gian và rất phức tạp.
Ngày nay, với sự phát triển của kỹ thuật phân tích, việc xác định thành phần
amino acid trong mẫu sinh hóa đã đƣợc đơn giản hơn rất nhiều, bởi hầu hết các công
cụ đã đƣợc tự động hóa và đƣợc nối trực tiếp bộ phận xử lý số liệu. Hiện nay, trên thị
trƣờng đang tồn tại rất nhiều kỹ thuật phân tích amino acid nhƣ: sắc ký lỏng cao áp,
HPLC (high performance liquid chromatography), sắc ký trao đổi ion (ion exchange
chromatography), điện di mao quản (capillary electrophoresis).
Trong phạm vi cho phép, chúng tôi chỉ thực hiện “Phân tích amino acid bằng
sắc ký lỏng cao áp” trên một số loài nấm đang có ở thị trƣờng Việt Nam. Từ đó, với
kết quả thu đƣợc chúng tôi sẽ tiến hành so sánh với các đối tƣợng khác cũng nhƣ sự
khác nhau giữa chúng và dữ liệu về thành phần amino acid của từng loài nấm bào ngƣ
sẽ đƣợc lƣu lại để làm cơ sở cho những nghiên cứu sau này. 2
3
Phần 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Nấm trồng
2.1.1. Khái niệm về nấm
Hiện nay, số loài nấm trồng đƣợc chỉ chiếm một phần rất nhỏ trong số nấm ăn
thiên nhiên. Ngoài đặc điểm chung là quả thể hay tai nấm có kích thƣớc lớn (đa số
dạng tán dù), chúng còn ăn ngon và rất giàu dinh dƣỡng [5].
Nấm rất phong phú và đa dạng, bao gồm cả những loại ăn đƣợc và không ăn
đƣợc, những loài cho quả thể lớn có thể thấy bằng mắt thƣờng và những loài phải sử
dụng kính hiển vi mới quan sát đƣợc [5].
Ban đầu nấm đƣợc xếp vào giới thực vật. Tuy nhiên, quan điểm này ngày nay
không còn thuyết phục nữa và nhiều nhà phân loại học đã đề nghị xếp nấm vào một
giới riêng, gọi là giới nấm. Sở dĩ xếp Nấm thành một giới riêng mà không xếp vào giới
Thực vật vì nấm không có lục lạp, không có sắc tố quang hợp, không có đời sống tự
dƣỡng nhƣ thực vật, không có sự phân hóa thành rễ, thân, lá, không có hoa, phần lớn
không chứa cellulose trong thành tế bào [1].
Lysosome
Thành tế bào Màng tế bào chất
Bộ máy golgi
Nhân
đầu không có vách ngăn và có nhiều nhân, dần sẽ tạo thành vách ngăn và phân thành
nhiều tế bào đơn nhân trong sợi nấm. Sợi nấm cấp hai đƣợc tạo thành do sự phối trộn
của hai sợi nấm cấp một. Khi đó nguyên sinh chất trong hai sợi nấm sẽ phối trộn với
nhau. Hai nhân vẫn đứng riêng rẽ làm cho tế bào có hai nhân. Ngƣời ta còn gọi sợi
nấm loại này là sợi nấm song nhân (dycaryolic hyphae). Sợi nấm cấp ba là do sợi nấm
cấp hai phát triển thành. Các sợi nấm này liên kết chặt chẽ với nhau và
tạo thành quả thể [1].
5
2.1.2. Sinh sản và chu trình sống
Khả năng sinh sản là một đặc điểm quan trọng của nấm. Một tai nấm rơm
trƣởng thành có thể phóng hàng tỉ bào tử. Nhờ vậy, nấm phát triển rất nhanh và phân bố rộng.
Bào tử của nấm phổ biến có hai dạng: vô tính và hữu tính. Ở vi nấm, nấm mốc
lan truyền chủ yếu nhờ bào tử vô tính, chúng gây nhiễm khắp nơi dƣới dạng hạt bụi
nhỏ li ti, màu sắc khác nhau tùy loài. Riêng đối với nấm ăn, bào tử sinh ra bên dƣới
cấu trúc đặc bịêt gọi là mũ nấm hay tai nấm. Mũ nấm thƣờng có cuống nâng lên cao để
có thể nhờ gió đƣa bào tử đi xa. Bào tử nẩy mầm cho lại hệ sợi nấm mới [3].
Ngƣời ta quen gọi hệ sợi nấm ở giai đoạn tăng trƣởng (hay dinh dƣỡng) là tản
dinh dƣỡng, phân biệt với quả thể nấm (hay cơ quan sinh bào tử hữu tính của nấm) là
tản sinh sản.
Hầu hết nấm trồng là nấm đảm, cơ quan sinh sản có có cấu tạo đặc biệt là tai
nấm. Tai nấm chủ yếu gồm mũ và cuống nấm. Mũ thƣờng có dạng nón hay phễu, với
cuống đính ở giữa hay bên. Mặt dƣới mũ của nhóm này cấu tạo bởi các phiến mỏng
xếp sát vao nhau nhƣ hình nan quạt. Ở một số trƣờng hợp, phiến nấm còn kéo dài từ
mũ xuống cuống (chân nấm), nhƣ nấm bào ngƣ (Pleurotus) [3].
Bào tử đảm (basidiospore) tạo ra ở bề mặt phiến, trên cấu trúc đặc biệt gọi là
đảm (basidium). Riêng nấm đậu (Coprinus), khi tai nấm trƣởng thành mũ nấm sẽ chảy
ẩm độ, nhiệt độ thích hợp, hệ sợi nấm sẽ bện lại và tạo thành hạch nấm. Hạch nấm sẽ
tiếp tục phát triển cho quả thể trƣởng thành.[3].
Quả thể Phiến nấm
Giảm phân hình
thành bào tử đảm
Bào tử đảm
Sợi nấm sơ cấp
(đơn nhân)
Hợp tử
Sợi âm
Sợi dƣơng
Quá trình
dung hợp
Sợi nấm thứ cấp
(song nhân)
Hình thành
quả thể
Sợi nấm
song nhân
Hình 2.2. Chu kỳ sống của nấm đảm ( Peter H. Raven
và ctv, 1992) 7
Ở nấm đảm, sự phối hợp nguyên sinh chất giữa hai sợi nấm cấp một xảy ra rất
sớm, sợi nấm song nhân là hình thái chủ yếu của sợi nấm. Quả thể là do các sợi nấm
song nhân liên kết lại tạo thành. Sợi nấm song nhân về mặt di truyền đuợc biểu thị là
(n+n) khác với sợi nấm đơn nhân là n và hợp tử là 2n [1].
Ở một số loài còn có một dạng bào tử khác gọi là hậu bào tử hay bào tử màng
Cộng sinh: Đây là nhóm đặc biệt, lấy thức ăn từ cơ thể chủ nhƣng không
làm chết hoặc gây tổn thƣơng ký chủ, ngƣợc lại còn giúp chúng phát triển tốt hơn. Vì
vậy các loài này đối với ký chủ có mối quan hệ mật thiết với nhau. Do đó, việc nuôi
trồng trở nên phức tạp hơn, thƣờng giống nấm đƣợc cấy cùng lúc với việc trồng cây
(thí dụ nấm Tuber hoặc Boletus).
2.2. Nấm bào ngƣ
2.2.1. Giới thiệu
Nấm bào ngƣ (còn gọi là nấm sò, nấm bình cô, oyster mushroom) gồm nhiều
loài thuộc:
Chi Pleurotus
Họ Pleurotaceae
Bộ Agaricales
Lớp phụ Hymenomycetidae
Lớp Hymenomycetes
Ngành phụ Basidiomycotina
Ngành nấm thật-Eumycota
Giới nấm Mycota hay Fungi
Nấm bào ngƣ có tới 50 loài khác nhau. Tuy nhiên, số loài đƣợc nuôi trồng đƣợc
không nhiều, khoảng 10 loài [2].
Nấm bào ngƣ đƣợc nuôi trồng rộng rãi trên thế giới. Ở châu Âu nấm bào ngƣ
đƣợc trồng ở Hungary, Đức, Ý, Pháp, Hà Lan. Ở Châu Á nấm bào ngƣ đƣợc trồng ở
Trung Quốc với sản lƣợng rất cao (khoảng 12 nghìn tấn mỗi năm) giá khoảng 2.2 triệu
đồng Việt Nam. Ngoài Trung Quốc, nấm này còn đƣợc trồng ở Nhật Bản, Việt Nam,
Hàn Quốc, Thái Lan Ấn Độ [2].
Nấm bào ngƣ không chỉ ăn ngon mà còn có giá trị dinh dƣỡng cao. Trong nấm
chứa đầy đủ các amino acid.
Ngoài giá trị dinh dƣỡng, nấm bào ngƣ còn có giá trị dƣợc liệu. Nhiều nghiên
cứu cho thấy nấm bào ngƣ cùng một số nấm ăn khác có tác dụng chống ung thƣ. Bằng
phƣơng pháp khuếch tán vào thạch nhóm nghiên cứu của Trƣờng Đại học Khoa Học
Nam vì khí hậu nƣớc ta rất thuận lợi cho việc phát triển loài nấm này. Hiện nay, nấm
bào ngƣ đƣợc trồng với nhiều chủng loại (khoảng 7 loại) tập trung nhiều ở Đà Lạt và
Thành phố Hồ Chí Minh. Hầu hết các dòng nấm đƣợc nuôi trồng ở nƣớc ta là các
giống đƣợc nhập từ nƣớc ngoài. Tuy nhiên vẫn có một số ít đƣợc khai thác ngay trên
địa lý của Việt Nam sau đó đêm về nuôi trồng trên điều kiện nhân tạo.
10
Bảng 2.1. Nhiệt độ thích hợp đối với một số nấm bào ngƣ (Lê Duy Thắng, 1999)
Loài nấm
Nhiệt độ thích
hợp cho tơ tăng
trƣởng (
0
C)
Nhiệt độ thích hợp
cho ra nấm (
0
C)
Pleurotus floridanus
Pleurotus sajor - caju
Pleurotus pulmonarius
Pleurotus abalonus
Pleurotus flabellatus
25-30
25-30
chất thông thƣờng, gần đây nấm này còn đƣợc trồng trên cơ chất là cây mai dƣơng để
chống sự xâm lấn của chúng góp phần giải quyết nạn môi trƣờng. Loài nấm này đƣợc
nhập từ Nhật Bản và đƣợc nuôi trồng thành công trên mùn cƣa đầu tiên ở Thành phố
Hồ Chí Minh.
11
2.2.2.3. Nấm bào ngư Pleurotus pulmonarius
Phần lớn đƣợc nhập từ nƣớc ngoài (Hình 2.3). Nhƣng gần đây, GS. Lê Xuân
Thám và cộng sự (1999) phát hiện đƣợc một loại khác ở Daklak - Tây Nguyên, sau đó
đƣa về Đà Lạt và đã hoàn thiện quy trình trồng trên mùn cƣa [7] .
2.2.2.4. Nấm bào ngƣ Pleurotus abalonus
Nấm này có nguồn gốc từ Đài Loan. Là một loài nấm ƣa nóng nên rất thuận lợi
để phát triển nuôi trồng trong điều kiện khí hậu của Việt Nam [1]. Nấm này có đặc
điểm là quả thể rất to (Hình 2.4), đƣờng kính mũ nấm có thể đạt đến 35 cm [2].
Ngoài ra còn một loài khác cũng đang đƣợc trồng ở Việt Nam nhƣ Pleurotus
eryngii, Pleurotus flabellatus. Và mới đây (2005) Thạc sĩ Cổ Đức Trọng đã trồng
thành công 2 loài nấm bào ngƣ mới: Pleurotus citrinopileatus Singer Pleurotus (quả
thể màu vàng) và Pleurotus djamor (quả thể có màu hồng)[7].
Hình 2.6. Pleurotus floridanus
Hình 2.3. Pleurotus pulmonarius
Hình 2.4. Pleurotus abalonus
Hình 2.5 Pleurotus sp. 12
2.3. Phƣơng pháp sắc ký - Phân tích amino acid
13
Tùy theo trạng thái tập hợp của các pha, loại tƣơng tác và sự hình thành sắc ký
mà ngƣời ta phân biệt các loại sắc ký nhƣ bảng 2.2.
Bảng 2.2. Các dạng sắc ký cơ bản [9]
Dạng sắc ký
Pha động
Pha tĩnh
Cách bố trí
pha tĩnh
Cơ chế trao
đổi chất
Khí
Khí- hấp phụ
Khí -lỏng
Lỏng
Lỏng - rắn
Lỏng - lỏng
Lỏng - nhựa trao đổi
Lớp mỏng
Rây (sắc ký gel)
Khí
Khí
Lỏng
Theo kích thƣớc
phân tử
2.4.. Một số phƣơng pháp sắc ký trong phân tích amino acid
Phân tích amino acid là phƣơng pháp xác định thành phần amino acid cũng nhƣ
định lƣợng chúng trong mẫu protein hay peptide. Phân tích amino acid có thể sử dụng
sắc ký giấy (paper chromatography), sắc ký lớp mỏng (thin layer chomatography-
TLC), sắc ký khí (gas chromatography), sắc ký trao đổi ion (ion exchange
chromatography), sắc ký lỏng cao áp (high performance liquid chromatography), điện
di mao quản (capillary electrophoresis) [15].
2.4.1. Sắc ký giấy (Paper chromatograhhy)
- Quá trình phân tách đƣợc thực hiện trên giấy sắc ký hoặc giấy lọc (Hình 2.7).
- Dùng viết chì, vẽ một đƣờng mảnh trên gốc của giấy (1,5 - 2 cm). đánh
những dấu nhỏ dọc theo đƣờng vừa kẻ.
- Dùng pipett hút lƣợng mẫu với thể tích nhất định cho vào những dấu vừa
mới đánh. Để khô, tiếp tục cho vào mẫu thứ 2 trên đầu tube khác nhau. Làm khô.
- Đặt chúng vào bồn sắc ký (cho dung môi ngập khoảng 1cm giấy sắc ký).
- Để bồn ở nơi mát tránh ánh sáng trực tiếp, khoảng 1 giờ.
14
- Lấy ra, dùng viết chì kẻ đƣờng đánh dấu nơi mà dung môi di chuyển. Làm khô.
- Phun ninhydrin vào toàn bộ mặt giấy. Để khô. Tính giá trị Rf. [24]
- Đối với sắc ký giấy dùng cho phân tích amino acid, các nhà phân tích
còn dùng sắc ký cuộn tròn và sắc ký giấy tròn.
2.4.2. Sắc ký lớp mỏng ( Thin layer chromatography _TLC)
Trong phƣơng pháp này, pha tĩnh là một lớp mỏng chất hấp phụ đƣợc gắn vào
HPLC đƣợc ra đời vào đầu những năm1970 là một trong những công cụ phân
tích đầu tay của các nhà phân tích.
HPLC dựa vào pha động (dạng lỏng) để phân tách các thành phần trộn lẫn vào
nhau. Những thành phần này đầu tiên đƣợc hòa tan vào trong dung môi và sau đó dƣới
tác dụng của áp suất cao , chúng sẽ bị lôi kéo di chuyển qua cột sắc ký. Trong cột, hỗn
hợp sẽ đƣợc phân tách thành những cấu tử của chúng.
Sự tƣơng tác giữa chất tan với pha động và pha tĩnh có thể phụ thuộc vào sự
chọn lựa khác nhau cả dung môi và pha tĩnh. Kết quả HPLC sẽ thu đƣợc nhiều cấu tử
khác nhau mà các kỹ thuật sắc ký khác không thực hiện đƣợc và nó dễ dàng phân tách
số lƣợng lớn các chất hoá học trộn lẫn vào nhau.
2.4.3.1. Pha tĩnh
Tùy theo mẫu phân tích mà ta có có mô hình pha tĩnh khác nhau.
Liquid - Solid Dựa trên độ phân cực. Những cấu tử nào có độ phân cực mạnh
sẽ liên kết chặ với pha tĩnh hơn những chất có độ phân cực yếu hơn. Vì thế những chất
ít phân cực sẽ bị lôi cuốn ra khỏi cột nhanh hơn.
Copyright: Tài liệu đại học ©