21
Tùy theo phƣơng pháp precolumn hay postcolumn mà ta có thể sử dụng pha
động, pha tĩnh, cột cũng nhƣ điều chỉnh bƣớc sóng phát hiện và detector phù hợp. Khi
đó thời gian phát hiện cũng khác nhau.
Nếu là PTC-aa thƣờng đƣợc phân tách trên cột cilica C18, hoặc Pico -Tag của sắc ký
ngƣợc pha; pha động thƣờng là acetonitrile; bƣớc sóng phát hiện ở 254nm và tất cả các
aa thƣờng đƣợc phát hiện khoảng 12 phút.không kể thời gian rửa cột hay thời gian
thêm để tạo cho đƣờng nền trở lại.

2.5.4. Phân tích và tính toán dữ liệu [10]
2.5.4.1. Định tính
Để phát hiện đƣợc các amino acid, phƣơng pháp thông thƣờng là dựa vào thời
gian lƣu của chuẩn đã đƣợc thực hiện chạy sắc ký trƣớc. sau đó, thời gian lƣu của mẫu
đƣợc so sánh với chuẩn này và từ đo xác định từng amino acid tƣơng ứng với từng
diện tích peak để định lƣợng.

2.5.4.2. Định lƣợng
Thành phần của từng amino acid đƣợc thể hiện bằng phần trăm về số mol
(mol%) so với tất cả những phần khác trong mẫu protein hay peptide. Chẳng hạn nhƣ
nếu protein có 5 nmol Ala tổng số tất cả các amino acid trong protein là 200 nmol kể
cả Ala thì phần trăm số mol của Ala là 2.5. Kết quả thu đƣợc sẽ tạo nên một profile
riêng biệt đối với tất cả các amino acid trong một protein hay peptide cụ thể.

2.6. Phân tích amino acid trên nấm bào ngƣ
Thành phần amino acid trên nấm bào ngƣ đã đƣợc tiến hành phân tích từ rất lâu,
nhất là khi kỹ thuật sắc ký ra đời.
.Năm 1962, Zakia Bano và cộng sự, viện nghiên cứu công nghệ thực phẩm
Mysore, Ấn Độ đã tiến hành phân tích trên sắc ký giấy tròn. Và ông đã phát hiện trong
nấm này chứa đến 17 amino acid. Trong đó hiện hiện đầy đủ 10 amino acid cần thiết [15].

Thr: Threonine
Ser: Serine
Gly: Glycine
Asp: Aspartic acid
Arg: Agrinine,
Pep: Peptide
Lys:Lysine,
His: Histidine
Cys: Cysteine

3.2. Hóa chất, dụng cụ và thiết bị
3.2.1. Hóa chất
HCl 6N
Phenol
PITC (phenylisothiocyanate).
Methanol
Ethanol
Nƣớc khử ion
TEA (Triethylamine)
Chuẩn hỗn hợp 17 amino acid
ACN (Acetonitril).
Glucose
Saccharose
KH
2
PO
4
MgSO
4
Sodium acetate
HNO
3
đậm đặc
EDTA 24
3.2.2. Thiết bị và dụng cụ
Thiết bị
Tủ cấy vô trùng

Môi trƣờng giá môi
Khoai mì
Cám gạo
KH
2
PO
4
MgSO
4
CaCO
3

Môi trƣờng giá thể
Mùn cƣa
Cám gạo
KH
2
PO
4

MgSO
4
25
3.3.2. Phƣơng pháp

4
, MgSO
4
với tỉ lệ nhất
định ( 2% đối với MgSO
4
và 1 % đối với KH
2
PO
4
).
- Hấp khử trùng ở 121
o
C , 1,2 atm trong 90 phút.
- Khi tơ nấm phát triển đầy bình tam giác, tạo ra màu trắng mịn trong bình, cấy
sang môi trƣờng giá môi.

3.2.2.4. Chuẩn bị môi trƣờng nuôi trồng
- Mùn cƣa đƣợc sàn lọc loại bỏ rác và những mảnh có kích thƣớc lớn.
- Ngâm trong nƣớc vôi 5%

trong 24 giờ
- Bổ sung cám gạo, bột bắp, cho vào túi ny lông hoặc bình thủy tinh.
- Hấp khử trùng trong 90 phút, 1atm, 121
o
C để 2 ngày sau hấp khử trùng tiếp nhƣ
lần thứ nhất. 26
Tƣới đón nấm
Thu quả thể
Môi trƣờng hạt
- Lúa nấu (88 %)
- CaCO
3
(2%)
- Cám gạo (10%)

Môi trƣờng giá môi
- Cọng mì (87 %)
- MgSO
4
( 2%)
-

KH
2
PO
4
(1 %)
- Cám gạo (10 %)

- Mùn cƣa (84 %)
- Cám gạo (10 %)
-

Bột bắp

dung dịch mẫu.
- Thủy phân ở 152
o
C trong 1h.
- Lấy ra, để nguội, lọc qua giấy lọc.
- Cho vào lọ, dán nhãn và để trong tủ mát.
Với nhiệt độ cao và trong điều kiện acid có nồng độ cao (HCl 6N), các protein sê
đƣợc phân cắt thành những amino acid đơn (Hình 2.10).

3.3.3.2. Tạo dẫn xuất
Khi phân tích thành phần amino acid trên HPLC, mẫu phải đƣợc tạo dẫn xuất
với PITC để có thể phát hiện thông qua detector. Quá trình tạo dẫn xuất đƣợc thực
hiện nhƣ sau:
- Hút 2µl mẫu cho vào bình quả lê có đáy nhọn.
- Làm khô bằng hỗn hợp dung dịch ethanol, nƣớc và TEA với tỷ lệ tƣơng ứng
2:2:1. Quá trình này đƣợc thực hiện trong điều kiện có thổi khí trơ để loại bỏ những
acid còn thừa lại trong quá trình thủy phân cũng nhƣ giúp cho PITC có thể bắt với
từng amino acid dễ dàng hơn. Bởi vì dƣới tác động của phức hợp này đăc biệt là TEA
giúp cho những amino sẽ bị khử 1 proton, khi đó PITC sẽ gắn vào.
- Mẫu đƣợc tạo dẫn xuất với dung dịch ethanol: nƣớc: TEA: PITC = 7:1:1:1
khoảng 5 đến 10 phút ở trong tối. Khi đó PITC sẽ gắn vào đầu amin của các amino
acid (Hình 2.11), Theo Molnar-Perl, (1994), phản ứng gắn này rất bền, nếu bảo quản
trong điều kiện lạnh chúng sẽ ổn định ít nhất 6 tháng). 28
- Mẫu phân tích đƣợc đem đi thổi khô với khí trơ. Bƣớc quan trọng nhất trong
quá trình tạo dẫn xuất là loại bỏ những tác nhân sau khi dẫn xuất. Điều này đƣợc thực
hiện trong điều kiện chân không thổi khí trơ hoặc trích với heptane (Thomas
T. Andersen, 1995). Với điều kiện phòng thí nghiệm chúng tôi tiến hành bằng phƣơng

Chỉ bơm chuẩn 1 lần, ghi lại các diện tích peak thu đƣợc trên sắc ký đồ sau khi
phân tích kết thúc. Sau đó lặp tỷ lệ giữa diện tích peak và nồng độ của chuẩn và mẫu,
từ đó tính đƣợc nồng độ từng amino acid trong mẫu. 30
PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1. Kết quả trồng nấm
4.1.1. Sự tăng trƣởng của hệ sợi trên các môi trƣờng
Sau khi chúng tôi thực hiện nuôi trồng theo quy trình ở mục 3.2.2.5, chúng tôi đạt
đƣợc một số kết quả trình bày ở bảng 4.1.
Nhận xét:
Tất cả các loài nấm đều đƣợc thực hiện đều đƣợc tiến hành trên các thiết bị
giống nhau tƣơng ứng với từng môi trƣờng (môi trƣờng lúa trong bình tam giác, môi
trƣờng cọng mì trên túi ny lông) khi chuyển sang môi trƣờng nuôi trồng, chúng tôi
thực hiện Pleurotus floridanus, Pleurotus abalonus trên túi ny lông, đồng thời với hai
loại Pleurotus flabellatus, Pleurotus pulmonarius chúng tôi thực hiện trên những lọ
bằng thủy tinh. Vì thế, chúng tôi chỉ so sánh trên hai môi trƣờng đầu với 4 dòng nấm
còn môi trƣờng nuôi trồng chúng tôi phân ra từng cặp để so sánh.
Với kết quả thu đƣợc (Bảng 4.1), chúng tôi nhận thấy rằng:
Thời gian tăng trƣởng trên môi trƣờng hạt của Pleurotus abalonus là chậm
nhất, kế đến là Pleurotus floridanus; Pleurotus flabellatus và Pleurotus pulmonarius
có thời gian tăng trƣởng tƣơng đƣơng nhau. Cả 3 dòng nấm Pleurotus floridanus;
Pleurotus flabellatus và Pleurotus pulmonarius đều có hệ sợi tơ trắng nhƣng Pleurotus
floridanus thì trắng hơn và hệ sợi không thƣa nhƣ hai dòng còn lại (Hình 4.1)
Khi cấy sang môi truờng giá môi, thì kết quả cũng giống nhƣ trên môi trƣờng
hạt, thời gian sinh trƣởng của Pleurotus abalonus vẫn là chậm nhất. Và trên môi
trƣờng này, thì nấm này vẫn khác so với các nấm còn lại là trên đầu mỗi sợi nấm có
màu đen, trong đó chứa các bào tử.( Hình 4.2 và Hình 4.3).