37

PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

5.1 Kết luận
Sau khi thu thập dịch tiết từ Fasciola gigantica và xác định nồng độ
protein trong dịch tiết bằng phương pháp Bradford, ta thu được xấp
xỉ 6,5 mg protein tiết/ 1 con sán/ 24 giờ.
Dịch tiết của sán lá gan lớn chứa những thành phần protein trội có
trọng lượng phân tử trong khoảng từ 27-29 kDa.
Đặc tính kháng nguyên tiết trong thành phần protein này đặc hiệu
hơn so với kháng nguyên thân của Fasciola sp nên có thể sử dụng để
chẩn đoán bệnh sán lá gan lớn ở người chính xác hơn.
Với protein tiết, một giá sắc ký ái lực đã được thực hiện. Giá sắc ký
này đã cho phép tinh chế từ huyết thanh bệnh nhân kháng thể (IgG),
đặc hiệu với protein tiết của sán.
Các kháng thể này đã được sử dụng để thực hiện một hệ thống thử
nghiệm miễn dịch cộng hợp enzyme (ELISA) để sử dụng trong chẩn
đoán.

5.2 Đề nghị
Gia tăng độ nhạy của phản ứng ELISA. Sử dụng kháng nguyên tiết để
phát hiện kháng thể trong huyết thanh bệnh nhân nhiễm Fasciola sp.
Thử nghiệm phát hiện kháng nguyên tiết trong phân bệnh nhân.
Xác định lại hoạt tính và tinh chế enzyme cystein-protease trong dịch
tiết của sán lá gan lớn.
Trên cơ sở đó ứng dụng những kỹ thuật phân tử để nghiên cứu những
đặc tính của enzyme trong mục đích chẩn đoán và điều chế vaccine


5. A.Y. SHEHAB et al, 1999. Serogiagnosis and assessment of antigens in the
sera of patients with fascioliasis by IELISA.Tropical Medicine and
International Health Volume 4, N
0
10; pp 686 – 690. Medical Research
Institute, University of Alexandria, Egypt.
6. B. GÖNEç. H. O. SARIMEHMETOĞLU. M. KARA. F. KIRCALI, 2003. Comparison
of Crude and Excretory/Secretory Antigens for the Diagnosis of Fasciola hepatica in
Sheep by Western Blotting. Turk J Vet Anim Sci. 28 (2004) 943-949, Turkey.
39

7. Bradford, M.M. (1976). A rapid and sensitive method for the quantitation of
microgram quantities of protein utilizing the principle of protein dye binding. A
ral. Biochem. 72: 248-254.
8. Peter R.Collins, Colin M. Stack et al, 2004. Cathepsin L1, the Major Protease Involved in
Live Fluke (Fasciola hepatica) Virulence. The Journal of Biological Chemistry Vol. 279,
N
o
. 17, Issue of April 23, pp 17038-17046, USA.
9. Cooper, Terrance G.(1977). The tools of Biochemistry. John Willey and Sons,
Interscience publication, United State of America. pp 36-307.
10. John P. Dalton, Sharon J. Andrew. Induction of protective immunity in cattle
against infection with Fasciola hepatica by vaccination with cathepsin L
proteinase and with Hemoglobin. Infection and Immunity, Dec. 1996, pp 5066-
5074. United Kingdom.
11. ESPINO et al. Dynamics of Antigenemia and Coproantigens during a human


41
PHỤ LỤC
Phụ lục 1: Môi trƣờng nuôi sán lá gan Fasciola gigantica để thu đƣợc kháng nguyên tiết
Môi trường RPMI 1640 1X (104,3 g/10 lít) bổ sung 2g NaHCO
3
/1lít
Thành phần
Đơn vị (mg/l)

L-Leucine
L-Lysine HCl
L-Méthionine
L-Phénylalanine
100,00
400,00
48,84
6000,00
800,00
2000,00
1,00
5,00
241,86
50,00
20,00
65,15
20,00
300,00
10,00
15,00
20,00
50,00
50,00
40,00
15,00
15,00
42

35,00
1,00
1,00
1,00
0,20
1,00
0,005

(Theo Catalogue 1996-97 Culture Cellulaire – Hãng Gibco BRL. Code 51800 –
035. Produced in U. K by life Technologies LTD, P. O. Box 35 PAISLEY).
Pha 500 ml môi trường RPMI 1640 1X (m = 5,215g + 1g NaHCO
3
).
Chỉnh pH = 7,3 bằng HCl đặc.
Bổ sung 300 µl Penicillin 1000000U (nồng độ 200 000 U / 1 ml).
Thêm vào 300 µl Streptomycin 1000000 µg (nồng độ 200 mg / 1 ml).
Cho dung dịch qua lọc vô trùng 0,22 µm để khử trùng.
Phân phối đều vào các ống nghiệm, mỗi ống 5 ml giữ trong 4
0
C.
Tất cả các thao tác đều thực hiện trong điều kiện vô trùng.
43 45

Phụ lục 5: Các giếng thực hiện phản ứng ELISA để phát hiện kháng nguyên tiết
trong huyết thanh của bệnh nhân