ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA
KHOA CÔNG NGHỆ HÓA HỌC
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

ĐỒ ÁN CHUYÊN NGÀNH

NGHIÊN CỨU CỐ ĐỊNH Saccharomyces
cerevisiae TRÊN TÁO VÀ ỨNG DỤNG SẢN
XUẤT RƯỢU DÂU TẰM

GVHD: PGS.TS.NGUYỄN ĐỨC LƯỢNG
SVTH: HOÀNG NGÂN HÀ
MSSV: 60600569


CHƯƠNG 2: NẤM MEN Saccharomyces cesrevisiae ............................................. 3
2.1 Hình thái và kích thước ..................................................................................... 3
2.2 Cấu tạo nấm men............................................................................................... 3
2.2.1 Thành tế bào ............................................................................................... 4
2.2.2 Màng nguyên sinh chất ............................................................................... 5
2.2.3 Chất nguyên sinh ........................................................................................ 6
2.2.4 Nhân tế bào ................................................................................................. 6
2.2.5 Không bào .................................................................................................. 6
2.2.6 Ty thể.......................................................................................................... 7
2.2.6 Mạng lưới nội chất ...................................................................................... 7
2.3 Thành phần hóa học của tế bào nấm men .......................................................... 7
2.4 Dinh dưỡng nấm men ...................................................................................... 10
2.4.1 Dinh dưỡng cacbon ................................................................................... 10
2.4.2 Dinh dưỡng nito ........................................................................................ 10
2.4.3 Dinh dưỡng các nguyên tố vô cơ ............................................................... 11
2.4.4 Dinh dưỡng chất sinh trưởng ..................................................................... 11
2.5 Hình thức sinh sản ........................................................................................... 11
2.5.1 Sinh sản bằng hình thức nảy chồi .............................................................. 11
2.5.2 Sinh sản bằng bào tử ................................................................................. 13

iii

CHƯƠNG 3: KỸ THUẬT CỐ ĐỊNH NẤM MEN ............................................... 14
3.1 Sơ lược về kỹ thuật cố định tế bào vi sinh vật .................................................. 14
3.2 Chất mang trong kỹ thuật cố định tế bào vi sinh vật ........................................ 14
3.2.1 Chất mang hữu cơ ..................................................................................... 15
3.2.2 Chất mang vô cơ ....................................................................................... 17
3.3 Các phương pháp cố định tế bào vi sinh vật..................................................... 18
3.3.1 Phương pháp cố định tế bào vi sinh vật trên bề mặt chất mang .................. 19
3.3.2 Phương pháp cố định tế bào vi sinh vật trong cấu trúc gel ......................... 21

5.2 Tình hình nghiên cứu trong nước .................................................................... 86
CHƯƠNG 6: KẾT LUẬN ...................................................................................... 87
TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................... 88

v

DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1: Thành phần phân tử của nấm men rượu (theo Reed Elsevier) ............... 8
Bảng 3.1: Sản lượng táo (theo tấn) ở các quốc gia trên thế giới............................ 27
Bảng 3.2: Thành phần các chất có trong 100g táo ................................................ 27
Bảng 4.1: Thành phần của quả dâu tằm (trong 100g quả) .................................... 37
Bảng 4.2: Thành phần vitamin trong quả dâu ...................................................... 37
Bảng 4.3: Ảnh hưởng của nồng độ cồn đến một số loại nấm men ....................... 52
Bảng 5.1: So sánh lượng sản phẩm phụ của phương pháp lên men liên tục và
phương pháp truyền thống.................................................................................... 76
vi DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1: Saccharomyces cerevisiae .................................................................... 3
Hình 2.2: Cấu tạo tế bào Saccharomyces cerevisia ............................................... 4
Hình 2.3: Sự sinh sản bằng hình thức nảy chồi ................................................... 12
Hình 2.4: Chu kì nảy chồi của nấm men .............................................................. 12

Hình 5.10: b)Tế bào nấm men cố định trên trái sung dưới kính hiển vi điện tử .... 81
Hình 5.11: So sánh giữa phương pháp sử dụng tế bào cố định và tự do ............... 81 Chương 1: Mở đầu

1

CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU

1.1 Tính cấp thiết của đề tài
Từ xưa, người ta dùng từ ‘Wine’ hay ‘Rượu Vang’ để chỉ các sản phẩm lên
men cồn từ dịch chiết của nho bằng nấm men. Theo định nghĩa trong từ điển
Oxford, rượu vang được định nghĩa ngắn gọn là thức uống lên men từ quả nho.
Rượu vang đóng một vai trò quan trọng trong nền văn minh của nhân loại.
Ngành sản xuất rượu vang đã có từ lâu đời, kỹ thuật sản xuất lúsc này chủ
yếu là lên men tự nhiên nước quả và sử dụng chính hệ vi sinh vật trong quả nho để
lên men. Đến thế kỷ thứ mười chín, ngành sản xuất rượu vang mới được đưa vào
sản xuất ở quy mô công nghiệp. Hiện nay có hai phương pháp lên men rượu vang
cơ bản là: lên men tự nhiên và lên men nhờ các chủng nấm men thuần khiết. Theo
tài liệu của tổ chức quốc tế về nghề trồng nho và làm rượu vang, nhiều quốc gia
trên thế giới như Pháp, Italia, Mexico, Bồ Đào Nha,…chỉ dùng nấm men có sẵn
trong nước quả để lên men. Nhưng phương pháp sử dụng nấm men thuần khiết để
sản xuất rượu vang có rất nhiều triển vọng: thời gian lên men nhanh, quá trình lên
men không bị dừng ở giữa chừng, hàm lượng đường trong dịch quả được lên men
triệt để, nồng độ cồn thu được trong vang cao hơn lên men tự nhiên từ 0,1 ÷1,
vang sáng màu nhanh hơn, có thể cho hương vị thanh khiết hơn. Nấm men thuần
khiết được bổ sung vào lên rượu thường ở dạng tự do, nhưng hiện nay người ta rất
qua tâm đến việc sử dụng nấm men cố định và đã có rất nhiều các nghiên cứu cố
định nấm men thuần khiết trên các loại chất mang khác nhau và ứng dụng trong

pháp cố định nấm men trên trái táo và khả năng ứng dụng trong sản xuất rượu dâu
tằm
1.4 Nội dung đề tài
Đề tài này tập trung làm rõ những nội dung sau: Nấm men Saccharomyces
cerevisia và quá trình cố định nấm men trên táo và ứng dụng của nấm men cố định
trong sản xuất rượu vang dâu tằm.
Chương 2: Nấm men Saccharomyces cerevisiae

3

CHƯƠNG 2: NẤM MEN Saccharomyces cesrevisiae

2.1 Hình thái và kích thước
Nấm men S.cerevisiae có cơ thể đơn bào. Chúng phân bố rộng rãi khắp nơi.
Đặc biệt thấy chúng có mặt nhiều ở đất trồng nho và các nơi trồng hoa quả. Ngoài
ra thấy chúng có mặt trên trái cây chín, trong không khí, trong nhụy hoa và cả nơi
sản xuất rượu vang. [1]
S. cerevisiae là các tế bào trong hình elip, với đường kính lớn từ 5 đến 10
m, và đường kính nhỏ từ 1-7 m. Tế bào nấm men thường có kích thước lớn gấp
5 – 10 lần tế bào vi khuẩn. Kích thước của tế bào nấm men thay đổi theo điều kiện
nuôi cấy, theo tuổi sinh lý. Thể tích của tế bào là 29 m
3
cho một tế bào đơn bội, và
55 m
3
cho một tế bào lưỡng bội. Nấm men thể hiện hầu hết các cấu trúc và chức
năng của tế bào nhân chuẩn, và được sử dụng như là một mô hình chung cho các tế
bào nhân chuẩn sinh học. [1]

Hình 2.1: Saccharomyces cerevisiae [28]

5

Protit: Protit thường được liên kết với các thành phần khác, ví dụ như
manan. Trong thành phần của chúng chứa nhiều acid amine khác nhau, như
glycine, alanine, tyrosine, leucine, isoleucine, asparagines, glutamine,
phenylalanine, và một lượng nhỏ serine, histidine, tryptophan. Phức hợp protein-
manan rất bền vững do đó tế bào nấm men rất khó bị phá vỡ. Thường thì các
polysaccharide nằm phía ngoài và protit nằm phía trong gần bào tương.
Kitin: Thường nằm ở phần nảy chồi. Chúng chiếm một số lượng rất nhỏ,
khoảng 3%. Đây là chất rất bền vững, không bị enzyme phân hủy, vì vậy chúng có
tác dụng bảo vệ chồi trong khi chồi còn non. Khi tế bào con phát triển, tách khỏi tế
bào mẹ, nơi tạo ra tế bào con này sẽ tạo ra vết sẹo và không bao giờ ở vị trí này tạo
ra một chồi mới. Ngoài ra còn thấy trong thành tế bào nấm men có lipit ở dạng
phospholipit, chúng chiếm khoảng 1÷10%.
2.2.2 Màng nguyên sinh chất
Xung quanh tế bào chất được bao quanh một lớp màng mỏng, chiều dày
không quá 0,1nm (1 nm = 10
-9
m). Màng có cấu tạo từ những hợp chất phức tạp
như protein, phospholipit, enzyme permease. Trong thời kì còn non, màng nguyên
sinh chất bám sát lấy thành tế bào, làm cho khả năng trao đổi chất của nấm men trở
nên rất mạnh. Ngược lại ở thời kì tế bào già, màng nguyên sinh chất co lại, tạo ra
một khoảng trống giữa thành tế bào và chất nguyên sinh, vì thế mà khả năng trao
đổi chất của nấm men gặp khó khăn. [1]
Màng nguyên sinh chất có 4 chức năng cơ bản: tác dụng như rào chắn thẩm
thấu, điều chỉnh chất dinh dưỡng từ môi trường vào trong tế bào và ngược lại cho
các sản phẩm trao đổi chất ra ngoài tế bào, thực hiện sinh tổng hợp một số hợp
phần của tế bào (các cấu tử của vỏ tế bào), nơi khu trú một số enzyme và cơ quan
của tế bào (như ribosome). Vận chuyển chất qua màng liên quan đến tính thẩm thấu
của màng. Đặc tính này trước hết phụ thuộc vào các enzyme phospholipase và

đầy dịch tế bào, bên ngoài được bao bọc bởi một lớp màng hypoprotein gọi là màng
không bào. Hình dạng không bào có thể thay đổi tùy theo tuổi và trạng thái sinh lý
của tế bào. Vị trí của không bào cũng khác nhau. Không bào là nơi chứa đựng các
protease. Các enzyme này tham gia quá trình thủy phân rất mạnh. [1]
Chương 2: Nấm men Saccharomyces cerevisiae

7

2.2.6 Ty thể
Ty thể có dạng hạt nhỏ, dạng que hoặc dạng sợi mảnh phân bố trong tế bào
chất ở khoảng giữa vỏ tế bào và không bào. Có thể thấy chúng ở tất cả các giai
đoạn sinh trưởng của tế bào nấm men: thời kì yên tĩnh, nảy chồi, sinh bào
tử…chiều dài của sợi ty thể là 0,2 -7,5 m. Hình dáng của chúng có thể thay đổi
trong quá trình nuôi cấy, có thể là từ các hạt hoặc que hay sợi đơn đến kết hợp
thành chuỗi.
Bình thường số lượng ty thể trong tế bào nấm men dao động rất lớn: từ 1
đến 50. Ở S. cerevisiae nếu có 1 ty thể thì thể tích của nó chiếm tới 88% thể tích tế
bào.
Ty thể có cấu tạo chủ yếu từ khoảng 30% chất béo và 60-70% protein. [2]
2.2.6 Mạng lưới nội chất
Trong tế bào của nấm men có chứa hệ thống màng hai lớp, được gọi là mạng
lưới nội chất bao gồm hang dãy màng kép có gai cong dày. Một số màng có kết
hợp với ribosome. Mặc dù mạng lưới nội chất của nấm men cũng giống như các vi
sinh vật khác có tham gia hoạt động của tế bào. Song mối quan hệ giữa mạng lưới
này với các cơ quan nội bào khác vẫn chưa biết rõ. [2]
2.3 Thành phần hóa học của tế bào nấm men
Cũng như các cơ thể sống khác, thành phần cơ bản và chủ yếu của tế bào
nấm men là nước- khoảng 75% khối lượng chung.
Thành phần sinh khối khô của nấm men như sau: độ ẩm, 2-5%; protein, 42-
46%; carbohydrate, 30-37%; nucleic acid, 6-8%; lipid, 4-5%; khoáng chất, 7-8%.

Sắt 0,005

Nước ở trong tế bào có 2 dạng: nước liên kết ( chủ yếu) và nước tự do.
Trong phần nước liên kết thì nước ở thể keo của tế bào chất chiếm tới 46÷53% và
phần giữa của tế bào 22 27%. Thay đổi độ ẩm của nấm men sẽ kéo theo sự thay đổi
tỷ lệ nước trong nội bào và phần giữa của tế bào. Khi loại bỏ 85% lượng nước từ
nấm men ở nhiệt độ dưới 50 C hầu như không ảnh hưởng đến hoạt động của chúng.
Chất khô của tế bào nấm men gồm có 23 ÷28% là chất hữu cơ và 5 ÷7 %
chất tro. [2]
 Protein: nấm men có hàm lượng protein nguyên liệu trung bình khoảng
50% (tính theo chất khô) và khoảng 45% hoàn chỉnh. Các dẫn xuất của acid nucleic
như bazo purin và pyrimidin, các acid amine tự do đều được gọi là protein nguyên
liệu.
 Glycogen: Là những chất dự trữ nguồn cacbon (hydratcacbon của nấm
men). Khi môi trường thiếu nguồn cacbon dinh dưỡng glycogen sẽ được huy động
tham gia vào quá trình tiêu hóa của nấm men, và giải phóng ra nước, khí cacbonic.
 Tregaloza: Hợp chất thường kết hợp với hàng loạt glycogen làm nguồn
dự trữ cacbon di động. Ở cùng một pH hàm lượng tregaoza tăng thì nito giảm.
Chương 2: Nấm men Saccharomyces cerevisiae

9

 Chất béo: Chất béo trong tế bào nấm men có các acid oleic, lioelic,
palmitic. Trong chất béo có tới 30 40% phosphtit.
 Tro: Trong nấm men thấy có các oxide sau đây (%) P
2
O
5
khoảng 25-60,
CaO 1-8, MgO 4-6, Na

đổi chất nito, lưu huỳnh và chất béo trong tế bào nấm men.
 Canxi: Canxi đóng vai trò hoạt hóa trong tế bào vi sinh nói chúng, cũng
như tế bào nấm men. Canxi được tìm thấy trong sinh vật nhân chuẩn ở dạng tự do,
nhưng chủ yếu ở dạng liên kết với protein, hydratcacbonn và lipit.
Chương 2: Nấm men Saccharomyces cerevisiae

10

 Các nguyên tố vi lượng: Các nguyên tố vi lượng có vai trò quan trọng
đối với sinh sản và hoạt động sống của nấm men. Chúng tham gia vào thành phần
của nhiều enzyme, vitamin và nhiều hợp chất khác nữa trong quá sinh tổng hợp các
sản phẩm của tế bào.
 Vitamin và nhân tố sinh trưởng: Để cho nấm men được phát triển và
lên men bình thường cần phải có các vitamin làm cofactor trong các enzyme của tế
bào nấm men. Nấm men có thể tổng hợp tất cả vitamin trong chừng mực nào đó,
ngoại trừ biotin (vitamin H). Vì vậy, trong môi trường dinh dưỡng nhất định phải
có vitamin. Hàm lượng protein trong tế bào nấm men khô như sau (g/g men khô):
Inozit: 6000÷15000, biotin (vitamin H): 0,6÷0,7, riboflavin (vitamin B
2
): 30 ÷60,
acid pantotenic (vitamin B
3
): 2÷19, tiamin (vitamin B
1
): 24÷50, pyridoxine
(vitamin B
6
): 14 ÷39, nicotamin (vitamin B
5
): 370÷750.

men P là nguyên tố được quan tâm trước, sau đó là K, Mg, S,…Phospho tham gia
vào thành phần quan trọng của tế bào như acid nucleoproteit, acid nucleic,
phospholipid,...Lưu huỳnh là thành phần của một số acid amin và là nhóm phụ của
(-SH) của một số enzyme CoA. Môi trường nuôi cấy nấm men thường có
(NH
4
)
2
SO
4
làm nguồn lưu huỳnh và amon. Các ion kali, canxi, magie cũng cấn có
trong môi trường nuôi cây, thông thường được bổ sung cùng với muối phosphate
hoặc sulphate, còn ion Ca
2+
và Mg
2+
có trong nước sinh hoạt. [2]
2.4.4 Dinh dưỡng chất sinh trưởng
Những chất kích thích sinh trưởng là các vitamin, các bazo purin và
pyrimidin. Những nhân tố sinh trưởng cơ bản đối với nấm men không có sắc tố là 6
vitamin nhóm B, ngoài ra còn cần các sắc tố đỏ là tiamin, và còn có cả axit
paraaminobenzic
Hàm lượng tối thiểu của vitamin cần cho sự phát triển bình thường của nấm
men trong môi trường tổng hợp là: vitamin H 0,0001; vitamin B
8
5; vitamin B
3

0,25; vitamin B
1


chiều dài biến đổi, trong đó các bào quan tế bào phát triển bình thường. Pha G1 đại
diện cho thời kỳ sau khi tế bào đơn đã tách ra tế bào mẹ, và ngay trước khi bắt đầu
quá trình phân chia. Ngay sau khi sự tổng hợp DNA đã được hoàn thành, theo định
nghĩa, tế bào bước vào giai đoạn G2. Việc kiểm soát trong chu kỳ tế bào, gọi là
'START', diễn ra vào cuối giai đoạn G1, và buộc một tế bào để trải qua phân chia.
Sau khi bắt đầu START, yếu tố môi trường, chẳng hạn như áp lực bên ngoài và môi
trường nghèo chất dinh dưỡng, làm cho tế bào phân chia. Sau khi hoàn thành giai
đoạn START, tế bào phát triển vượt quá mức kích thước tối thiểu, tế bào sẽ tiến
hành tổng hợp DNA và sự chuyển sang pha S. Sau khi hoàn thành DNA đã được
tổng hợp và tế bào chuyển sang pha S, chồi bắt đầu phát triển , nhân của tế bào
cũng nhân lên trong pha M. Giai đoạn cuối cùng là tế bào phân chia, chồi tách ra,
tạo thành tế bào mẹ và tế bào con. [11]
2.5.2 Sinh sản bằng bào tử
Đối với giống nấm men Saccharomyces cerevisia, tế bào sinh dưỡng đơn bội
sinh sản theo cách nảy chồi. Sau đó hai tế bào kết hợp với nhau xảy ra quá trình
giao chất và giao nhân tạo thành tế bào dinh dưỡng lưỡng bội. Tế bào này chuyển
thành bào tử túi. Nhân phân cắt giảm nhiễm sinh ra bốn bào tử túi rồi chuyển thành
tế bào dinh dưỡng và tiếp tục sinh sản bằng cách nảy chồi. [1]

Hình 2.5: Vòng đời sinh sản của Saccharomyces cerevisiae
Chương 3: Kỹ thuật cố định nấm men

14

CHƯƠNG 3: KỸ THUẬT CỐ ĐỊNH NẤM MEN

3.1 Sơ lược về kỹ thuật cố định tế bào vi sinh vật
Kỹ thuật cố định tế bào vi sinh vật được định nghĩa là kỹ thuật bao bọc hoặc
định vị các tế bào nguyên vẹn vào một vùng không gian nhất định nhằm bảo vệ các

vi sinh vật vừa tăng khả năng tiếp xúc giữa cơ chất và enzyme, nhờ đó làm tăng
hoạt tính enzyme và số lần tái sử dụng.
 Chất mang có cấu trúc siêu lỗ.
3.2.1 Chất mang hữu cơ [3]
3.2.1.1 Chất mang hữu cơ tự nhiên
Chất mang là polysaccharide: là nhóm chất mang đang rất thịnh hành và
được sử dụng rộng rãi nhất hiện nay, đó là cellulose, agarose, dextran và các dẫn
xuất của chúng.
 Cellulose
Cellulose được sử dụng rất rộng rãi làm chất mang để cố định tế bào.
Cellulose là thành phần cấu tạo chủ yếu của các vật liệu như sau: rơm, bã
mía, dăm bào, trấu, mạt cưa,… Đây là nguyên liệu dễ kiếm, rẻ tiền ở Việt Nam
Các cellucose là một loại homopolyme của β-D-glucose. Các gốc β-D-
glucose được nối kết với nhau qua liên kết β-D-1,4-glucan. Mức độ polymer hóa
của phân tử cellulose thay đổi nhiều, trung bình là 3000. Tùy theo từng loại thực
vật mà các phân tữ cellulose có khối lượng phân tử khác nhau rất nhiều ( từ 50000
đến 2500000). Nhờ phương pháp phân tích bằng tia Ronghen người ta biết rằng
cellulose có cấu tạo sợi. Các sợi này liên kết thành các bó nhỏ người ta gọi là
microfibrin co cấu trúc không đồng nhất. Chúng có những phần đặc ( phần kết tinh)
và những phần xốp hơn ( phần vô định hình). Cellulose là một trong các hợp chất
tự nhiên khá bền vững. Nó không tan trong nước mà chỉ bị phồng lên do hấp thụ
nước. Cellulose bị phân hủy khi đốt nóng với acid hoặc kiềm ở nồng độ khá cao.
Cellulose cũng bị phân hủy ở nhiệt độ thường hoặc ở nhiệt độ 40-50C nhờ
các enzyme phân hủy cellulose gọi là cellulose.
Cellulose và các dẫn xuất của chúng như CM-cellulose, DEAE- cellulose có
tính chất cơ lý khá bền vững nhưng lại không đồng nhất nên thường chỉ sử dụng ở
dạng sợi và vi hạt.
Chương 3: Kỹ thuật cố định nấm men

16

thước siêu lỗ…Tuy nhiên polymer tổng hợp cũng bộc lộ những nhược điểm nhất
định như một số có giá thành cao như polyacrylamide, polyhydroxyethylacrylate có
Chương 3: Kỹ thuật cố định nấm men

17

khả năng tương hợp sinh học kém và một nhược điểm nữa là do quá bền vững,
không thể phân hủy trong tự nhiên vì vậy gây ô nhiễm môi trường. Đây là một vấn
đề quan trọng đặt ra đòi hỏi con người cần quan tâm và giải quyết.
 Polyacrylamide
Là một polymer rất đồng nhất, độ trương tốt, kích thước của lỗ gel có thể
điều chỉnh được và diện tích tiếp xúc bể mặt lớn. Đây cũng là đối tượng đầu tiên
được sử dụng làm chất mang cố định tế bào vi sinh vật.
 Polyhydroethylmethacrylate (PHEMA)
PHEMA là một loại vật liệu hydrogel, nó được chế tạo từ monomer
hydroethylmethacrylate (HEMA). Ngoài phương pháp polymer hóa thông thường
dùng chất khơi mào hóa học, nó còn được polymer hóa bằng phương pháp polymer
hóa bức xạ.
PHEMA có nhiều ứng dụng trong các lĩnh vực như trong y học, làm giá thể
thải chậm dược phẩm, nội tiết tố trong điều trị làm contact lens, làm vật liệu sụn,
mô nhân tạo,…Nhưng để làm giá thể trong việc cố định thì PHEMA được chế tạo
bằng kỹ thuật polymer hóa bức xạ nhiệt độ thấp ( -78C)
PHEMA khi được điều chế bằng phương pháp này thì có cấu trúc mạng
lưới, mềm xốp, màu trắng đục, với nồng độ HEMA <80% ( nồng độ monomer càng
nhỏ thì kích thước lỗ cảng lớn). Nếu trên nồng độ này thì vật liệu cứng, màu trong
suốt như thủy tinh nhưng trở thành trạng thái mềm dẻo hơn khi trương trong nước.
Độ trương nước bão hòa của PHEMA giảm dần khi tăng nồng độ HEMA.
3.2.2 Chất mang vô cơ [3]
3.2.2.1 Chất mang vô cơ tự nhiên
Zeolit: Là các Aluminosilicate có cấu trúc tinh thể theo không gian 3 chiều,