Thực Hành Vi Sinh Môi Trường
Bài 1:
VI SINH VẬT TRONG CÁC HỆ THỐNG XỬ LÝ
NƯỚC THẢI
1.1 XÁC ĐỊNH CHỈ SỐ LẮNG CỦA BÙN HOẠT TÍNH HIẾU KHÍ SVI
1.1.1 Ý nghĩa của chỉ số SVI
Chỉ số SVI đặc trưng cho khả năng lắng của bùn hoạt tính hiếu khí.Chỉ số SVI tính bằng
công thức:
SVI=
gVSS
V
1.1.2 Xác định thể tich bùn lắng
- Mẫu bùn trong bể xử lý bùn hoạt tính hiếu khí được khuấy đều trước khi múc ra ngoài bằng
xô.
- Khuâý đều xô mẫu và lấy:
+ 30ml vào beaker nhỏ để phân tích VSS
+ 0,5 lít cho vào ống đong 500ml hoặc nón Imhoff
- Định giờ và đọc thể tích bùn lắng trong ống đong (hoặc nón Imhoff) sau 30 phút (Vml)
1.1.3 Xác định VSS
-Sử dụng giấy lọc VSS có ghi sẵn số thứ tự
- Lọc V(ml) mẫu(sau khi trộn đều) bằng bộ lọc chân không
- Sấy ở 105
0
C trong 1h, chuyển sang bình hút ẩm khoảng 1h
- Cân xác định trọng lượng m
1
- Mẫu giấy tiếp tục được nung ở 550
0
C trong 1h
- Chuyển sang bình hút ẩm khoảng 1h và cân xác định trọng lượng m
2

mlV
mm
VSS =
×−
=
×−
=
Chỉ số SVI:
)/(75
04,1
78
gml
gVSS
V
SVI ===
Đánh giá khả năng lắng của bùn hoạt tính dựa vào chỉ số SVI như bản sau:
St
t
Loaị bùn SVI
1 Bùn lắng tốt < 100
2 Có hiện tượng nổi ít 100-200
3 Bùn nổi bề mặt nhiều >200
So với bảng trên thì chỉ số SVI = 75 <100 nên bùn lắng tốt
1.2 PHA CHẾ MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY VI SINH VẬT
1.2.1 Pha chế môi trường PCA
Thành phần môi trường PCA
Stt Hóa chất Đơn vị Số lượng
1 Casein Enzymic Hydrolyse g/l 5.0
2 Yeast Extract g/l 2.5
3 Dextrose g/l 1.0

- Lấy ra để nguội
- Bảo quản tủ lạnh
Nhận xét:
Môi trường lỏng, có màu vàng nhạt
Muc đích của hấp khử trùng là ở nhiệt độ 121
0
C thì bảo đảm môi trường không
bị nhiễm khuẩn
1.2.2 Pha chế môi trường BGBB
Dụng cụ pha chế
- Beaker 250ml
- Ống đong 250ml
- Đũa thủy tinh
- Ống nghiệm
- Bông gòn, thun, giấy gói
Thao tác
Mỗi nhóm pha chế 200ml môi trường BGBB (20 ống nghiệm)
- Cân bột BGBB hoặc BGBL: 8g
- Đong nước cất: 200ml, cho nước và agar vào beaker
- Khuấy cho bột tan đều
- Đặt beaker lên bếp điện, khuấy cho đều tay cho đến khi dung dịch trong suốt
- Nhắc beaker khỏi bếp điện, để nguội khoảng 10 phút ở 45-50
0
C
- Cho ống dulham vào từng ống nhiệm
- Chế môi trường vào các ống nghiệm (10ml/ống nghiệm)
- Đậy nút gòn, gói giấy
- Hấp khử trùng 121
0
C, 1atm, trong 15 phút

Dụng cụ pha chế
- Beaker 100ml
- Petri nhỏ
- Ống đong 100ml
- Đũa thủy tinh
- Bông gòn, thun, giấy gói
Thao tác
Mỗi nhóm pha chế 25ml môi trường Les Endo Agar (cho vào 3 đĩa petri nhỏ)
- Cân bột Les Endo Agar: 1.3g
- Đong thêm nước cất cho đủ 25ml
- Khuấy cho bột tan đều
- Đặt beaker lên bếp điện, khuấy cho đều tay cho đến khi dung dịch trong suốt
- Nhắc beaker khỏi bếp điện, để nguội khoảng 10 phút ở 45-50
0
C
- Thêm 0.5ml cồn
- Chế môi trường vào các petri nhỏ(5ml/đĩa), để yên cho đến khi môi trường đặc lại
- Lật ngược đĩa petri
- Gói giấy từng hộp
- Bảo quản
- Không hấp khử trùng
Nhận xét:
Môi trường đông đặc,có màu tím
Thêm 0,5ml cồn để khử trùng
Lật ngược đĩa petri để tránh hơi nước rơi xuống môi trường nuôi cấy
4
Thực Hành Vi Sinh Môi Trường
1.2.4 Pha chế môi trường pepton
Dụng cụ pha chế
- Beaker 100ml

- Ống đong 100ml
- Đũa thủy tinh
- Bông gòn,thun,giấy gói
Thao tác
Mỗi nhóm pha chế 50ml môi trường cimon citrate agar
- Cân bột cimon citrate agar: 1,2g
- Đong thêm nước cất cho đủ 50ml
- Khuấy cho bột tan đều
- Đặt beaker lên bếp điện, khuấy cho đều tay cho đến khi dung dịch trong suốt
- Nhắc beaker khỏi bếp điện, để nguội khoảng 10 phút ở 45-50
0
C
- Chế môi trường vào các ống nghiệm (10ml/ống nghiệm), để yên cho đến khi môi trường
đặc lại
- Đậy nút gòn, gói giấy, ghi nhãn
- Hấp khử trùng 121
0
C, 1atm, trong 15 phút
- Lấy ra để nguội
- Bảo quản tủ lạnh
Nhận xét:
Môi trường đông đặc,có màu xanh đen
5
Thực Hành Vi Sinh Môi Trường
 Muc đích của hấp khử trùng là ở nhiệt độ 121
0
C thì bảo đảm môi trường không
bị nhiễm khuẩn
1.2.6 Pha chế môi trường Clark Lubs
Dụng cụ pha chế

Thực Hành Vi Sinh Môi Trường
Phép thử này nhằm xác định tổng số lượng tất cả các vi sinh vật hiếu khí có trong một
mẫu phân tích, bao gồm vi sinh vật hiếu khí và vi sinh vật tùy tiện
2.2 PHƯƠNG PHÁP THỬ
2.2.1 Nội dung phương pháp
- Sử dụng phương pháp đếm đĩa trực tiếp (petri)
- Nuôi cấy trên môi trường PCA
- Ủ mẫu ở nhiệt độ 37
0
C trong 24h
- Kết quả thể hiện số khuẩn lạc /1ml nước
2.2.2 Tiến hành thí nghiệm
Trước khi tiến hành thí nghiệm, mẫu phân tích cần được pha loãng ở một nồng độ nhất
định.Đối với nước sông cần phải pha loãng mẫu trung bình khoảng 10
-3
lần,đối với nước
thải tùy độ bẩn của nước trung bình pha loãng 10
-7
lần
Pha loãng mẫu nước sông
Pha loãng mẫu nước sông đến độ pha loãng 10
-1
, 10
-2
, 10
-3
, 10
-4
- Dùng pipet 10ml hút 9ml nước cất vô trùng cho vào từng ống nghiệm đã đánh số từ 1-4
ứng với các mẫu cần pha loãng trên

-Cho dd nuôi cấy vào môi trường(0,5ml) dàn đều trên bề mặt đĩa
-Xoay đĩa 5 vòng (2 chiều)
-Để đặc, úp ngược đĩa petri
-Gói, ghi nhãn,ủ ở 37
0
C
Chú ý: các thao tác phải gần đèn cồn để hạn chế nhiễm khuẩn
Ủ ở 37
0
C trong 48h đó là điều kiện thuận lợi cho vi sinh tổng phát triển
7
Thực Hành Vi Sinh Môi Trường
2.3 ĐẾM SỐ KHUẨN LẠC
- Đếm số khuẩn lạc sau 24h nuôi cấy
♦ Cách 1: Cho dd nuôi cấy → Môi trường nuôi cấy
- Pha loãng 10
0
: 102 khuẩn lạc
→ VS tổng = N.f = 102.1= 102 (khuẩn lạc/ml)
- Pha loãng 10
-3
: 36 khuẩn lạc
→ VS tổng = N.f = 36.1000 = 36000 (khuẩn lạc/ml)
- Pha loãng 10
-4
: 2 khuẩn lạc
→ VS tổng = N.f = 2.10000 = 20000 (khuẩn lạc/ml)
♦ Cách 2: Cho môi trường nuôi cấy → Cho dd nuôi cấy
- Pha loãng 10
-3

, 10
-2
, 10
-3
, 10
-4
. Như bài 2;
● Lọc mẫu: dùng kẹp gắp đã khử trùng, đặt giấy lọc trên phễu lọc (phần có kẻ gạch
vuông ở phía trên), kẹp phễu lọc cho chắc, tráng phễu lọc bằng nước cất đã khử trùng. Lọc 1ml
mẫu qua màng lọc vi sinh, mỗi mức độ pha loãng 1 tờ giấy lọc (Thực hiện ở độ pha loãng 10
-2
,
10
-3
). Chú ý trải đều mẫu trên bề mặt có kẻ ô vuông của giấy lọc;
● Lấy giấy lọc ra khỏi bộ lọc và đặt trên đĩa petri nhỏ đã có sẵn thạch Les
Endo Agar. Tránh tạo bong bóng khí dưới màng lọc. Quay mặt có kẻ sọc lên trên;
● Gói giấy, ghi chú lên mẫu và ủ ở 37
0
C trong 24 giờ.
Đếm số khuẩn lạc
Khuẩn lạc coliform tiêu biểu có màu hồng cho đến đậm hoặc có cả ánh kim trên bề mặt. Ánh
kim có thể bao phủ toàn bộ hoặc chỉ là một chấm nhỏ trên khuẩn lạc. Các khuẩn lạc không có
màu hồng, đỏ hoặc ánh kim được xem như không phải coliform.
Tính mật độ coliform/100ml = Số khuẩn lạc đếm được x 100 x độ pha loãng.
3.2.3 Phương pháp lên men nhiều ống (MPN)
Nội dung phương pháp
● Dựa vào khả năng lên men Lactose của vi sinh vật trong môi trường BGBB;
● Ủ ở nhiệt độ 37
0

1. Đem dãy số 3-1-1 này di tra bảng MPN để xác định kết quả;
● Vì trong bảng thống kê MPN thực hiện với dãy 1 có số lượng mẫu là 10ml
trong khi chúng ta thí nghiệm với dãy 1 có độ pha loãng là 10
-1
. Vậy kết quả thu được phải dược
nhân với 100
NHẬN XÉT THAO TÁC THÍ NGHIỆM
Thao tác có thể không chính xác
- Pha loãng không chính xác do ta canh pipet, có thể khi làm ta không lắc
đều mẫu. - Khi khử trùng kẹp gắp ta dùng ngay có thể kẹp gắp chưa nguội làm
ảnh hưởng VSV ko sống được.
- Chỉ lọc 1ml mẫu có thể sẽ không đều trên tờ giấy lọc.
- Khi đặt giấy lọc vào petri (đã có môi trường
nuôi cấy) nếu đặt không khéo sẽ tạo bong bóng khí.
Kết quả:
♦ Phương pháp màng lọc
Coliform độ pha loãng 10
-3
: 18 khuẩn lạc
Mật độ coliform = 18 x 100/2 x 1000 = 900000 (khuẩn lạc/ml)
♦ Phương pháp MPN
10
Thực Hành Vi Sinh Môi Trường
Dãy 1: Có 1 ống dương tính
Dãy 2: Có 0 ống dương tính
Dãy 3: Có 0 ống dương tính
→ Kết quả: 1-0-0 Tra bảng MPN ta được: 4
f =10/10
-2
= 1/10

● Sử dụng màng lọc vi sinh vô trùng có kích thước lỗ lọc 0,45 µm;
● Ủ ở nhiệt độ 44,5 ± 0,5
0
C trong 24 giờ;
● Đơn vị tính Ecoli: số KL/100ml.
Thao tác
● Pha loãng mẫu ở các cấp độ 10
-1
, 10
-2
, 10
-3
, 10
-4
. Như bài 2;
● Lọc mẫu: dùng kẹp gắp đã khử trùng, đặt giấy lọc trên phễu lọc (phần có kẻ gạch
vuông ở phía trên), kẹp phễu lọc cho chắc, tráng phễu lọc bằng nước cất đã khử trùng. Lọc 1ml
mẫu qua màng lọc vi sinh, mỗi mức độ pha loãng 1 tờ giấy lọc (Thực hiện ở độ pha loãng 10
-2
,
10
-3
). Chú ý trải đều mẫu trên bề mặt có kẻ ô vuông của giấy lọc;
● Lấy giấy lọc ra khỏi bộ lọc và đặt trên đĩa petri nhỏ đã có sẵn thạch Les
Endo Agar. Tránh tạo bong bóng khí dưới màng lọc. Quay mặt có kẻ sọc lên trên;
● Gói giấy, ghi chú lên mẫu và ủ ở 44,5 ± 0,5
0
C trong 24 giờ.
4.2.3 Phương pháp lên men nhiều ống (MPN)
Nội dung phương pháp

● Xác định số ống nghiệm dương tính trong 3 dãy và tra bảng MPN. Ví dụ: dãy 1
có 3 ống dương tính, dãy 2 có 1 ống dương tính và dãy 3 có 1 ống dương tính, như vậy ta có 3-1-
1. Đem dãy số 3-1-1 này di tra bảng MPN để xác định kết quả;
● Vì trong bảng thống kê MPN thực hiện với dãy 1 có số lượng mẫu là 10ml
trong khi chúng ta thí nghiệm với dãy 1 có độ pha loãng là 10
-1
. Vậy kết quả thu được phải dược
nhân với 100
Kết quả: ♦ Phương pháp màng lọc
Ecoli độ pha loãng 10
-3
: 1 khuẩn lạc
Mật độ Ecoli = 1 x 100/2 x 1000 = 50000 (khuẩn lạc/ml)
♦ Phương pháp MPN
Dãy 1: Có 2 ống dương tính
Dãy 2: Có 1 ống dương tính
Dãy 3: Có 0 ống dương tính
→ Kết quả: 2-1-0 Tra bảng MPN ta được: 15
f =10/10
-1
= 1/10
-2
= 0,1/10
-3
= 100
E.coli = 15x100 = 1500 MPN/100ml
4.2.4 Thử phản ứng sinh hóa E.coli
● Môi trường nuôi cấy
+ Pepton: 4 ống
+ Clark lub: 8 ống

5.1 KIỂM TRA KẾT QUẢ E.COLI
5.1.1 Thử kết quả phản ứng sinh hóa E.coli
 Thuốc thử sinh hóa:
• Kovac : 20 giọt
• Methyl red : 20 giọt
14
Thực Hành Vi Sinh Môi Trường
• VP- Voges proskauer- 5% (gồm 60% α-naptol và 40%KOH) : 20 giọt
 Thử phản ứng Indol ( thuốc thử Kovac) Thuốc thử có màu vàng
- Môi trường pepton sau khi cấy E.coli, ủ ở nhiệt độ 37
0
C trong 24h; ta thấy dung dịch có
màu vàng đục như ban đầu.
- Lắc đều môi trường lên, nhỏ 5 giọt thuốc thử vào môi trường pepton. (đặt môi trường
nằm nghiêng, thuốc thử chảy thành dòng trên thành bình)
 Kết quả : cả 4 ống nghiệm chứa môi trường đều cho kết quả âm tính
Bề mặt của môi trường không đổi màu, giữ nguyên màu vàng trước đó.
 Thử Methyl red: thuốc thử có màu đỏ
- Môi trường Clark lubs đã nuôi cấy E.coli ( ủ ở nhiệt độ 37
0
C trong 24h) có biến đổi về
màu sắc: 3 ống vẫn đục, có bột khí; 1 ống không đổi màu (giữ nguyên màu vàng nhạt như
ban đầu)
- Lắc đều môi trường lên, nhỏ 5 giọt Methyl red vào môi trường Clark lubs. (đặt môi
trường nằm nghiêng, thuốc thử chảy thành dòng trên thành bình)
 Kết quả : 3 ống nghiệm dương tính- bị vẫn đục thì phía bề mặt có màu đỏ.
1ống nghiệm âm tính- không đổi màu thì chuyển sang màu vàng chanh.
 Thử VP: thuốc thử có màu nâu xám
- Môi trường Clark lubs đã nuôi cấy E.coli ( ủ ở nhiệt độ 37
0