TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG
VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC & MÔI TRƯỜNG
BÀI GIẢNG
THỰC HÀNH HÓA SINH MÔI TRƯỜNG
Người biên soạn: Phạm Thị Lan
Bộ môn: CNKTMT
Nha Trang, tháng 3 năm 2012
1
QUY TẮC LÀM VIỆC TRONG PHÒNG THÍ NGHIỆM HÓA SINH
I. An toàn khi làm việc với axit và kiềm
1. An toàn khi làm việc với axit:
Phải làm việc trong tủ hút bất cứ khi nào đun nóng axit hoặc thực hiện phản ứng
với các hơi axit tự do. Khi pha loãng, luôn phải cho axit vào nước trừ phi được dùng trực
tiếp. Giữ để axit không bắn vào da hoặc mắt bằng cách đeo khẩu trang, găng tay và kính
bảo vệ mắt. Nếu làm văng lên da, lập tức rửa ngay bằng một lượng nước lớn. Luôn phải
đọc kỹ nhãn của chai đựng và tính chất của chúng. H
2
SO
4
: Luôn cho acid vào nước khi
pha loãng, sử dụng khẩu trang và găng tay để tránh phòng khi văng acid. Các acid dạng
hơi (HCl) thao tác trong tủ hút và mang găng tay, kính bảo hộ.
2. An toàn khi làm việc với kiềm
Kiềm có thể làm cháy da, mắt gây hại nghiêm trọng cho hệ hô hấp. Mang găng tay
cao su, khẩu trang khi làm việc với dung dịch kiềm đậm đặc. Thao tác trong tủ hút, mang
mặt nạ chống độc để phòng ngừa bụi và hơi kiềm. Amoniac: là một chất lỏng và khí rất
ăn da, mang găng tay cao su, khẩu trang, thiết bị bảo vệ hệ thống hô hấp. Hơi amoniac
dễ cháy, phản ứng mạnh với chất oxy hoá, halogen, axit mạnh. Amoni hydroxyt: chất
lỏng ăn da, tạo hỗn hợp nỏ với nhiều kim loại nặng: Ag, Pb, Zn và muối của chúng.
Kim loại Na, K, Li, Ca: phản ứng cực mạnh với nước, ẩm, CO
2

- Sạch phân tích (PA): độ sạch < 99%
- Sạch hóa học (PC): độ sạch > 99%
Hóa chất có độ tinh khiết khác nhau được sử dụng phù hợp theo những yêu cầu
khác nhau và chỉ nên sử dụng hóa chất còn nhãn hiệu.
2
2. Nhãn hiệu hoá chất:
Hóa chất được bảo quản trong chai lọ thủy tinh hoặc nhựa đóng kín có nhãn ghi
tên hoá chất, công thức hóa học, mức độ sạch, tạp chất, khối lượng tịnh, khối lượng
phân tử, nơi sản xuất, điều kiện bảo quản.
3. Cách sử dụng và bảo quản hoá chất:
Khi làm việc với hóa chất, nhân viên phòng thí nghiệm cũng như sinh viên cần hết
sức cẩn thận, tránh gây những tai nạn đáng tiếc cho mình và cho mọi người. Những điều
cần nhớ khi sử dụng và bảo quản hóa chất được tóm tắt như sau:
- Hóa chất phải được sắp xếp trong kho hay tủ theo từng loại (hữu ơ, vô cơ,
muối, acid, bazơ, kim loại, ) hay theo một thứ tự a, b, c để khi cần dễ tìm.
- Tất cả các chai lọ đều phải có nhãn ghi, phải đọc kỹ nhãn hiệu hóa chất trước khi
dùng, dùng xong phải trả đúng vị trí ban đầu.
- Chai lọ hóa chất phải có nắp. Trước khi mở chai hóa chất phải lau sạch nắp, cổ
chai, tránh bụi bẩn lọt vào làm hỏng hóa chất đựng trong chai.
- Các loại hóa chất dễ bị thay đổi ngoài ánh sáng cần phải được giữ trong chai lọ
màu vàng hoặc nâu và bảo quản vào chổ tối.
- Dụng cụ dùng để lấy hóa chất phải thật sạch và dùng xong phải rửa
ngay, không dùng lẫn nắp đậy và dụng cụ lấy hóa chất.
- Khi làm việc với chất dễ nổ, dễ cháy không được để gần nơi dễ bắt lửa. Khi cần
sử dụng các hóa chất dễ bốc hơi, có mùi, phải đưa vào tủ hút, chú ý đậy kín nắp sau khi
lấy hóa chất xong.
- Không hút bằng pipette khi chỉ còn ít hóa chất trong lọ, không ngửi hay nếm thử
hóa chất.
- Khi làm việc với acid hay base mạnh:
Bao giờ cũng đổ acid hay base vào nước khi pha loãng (không được đổ nước vào

Ví dụ: dung dịch NH
4
Cl 5% (w/w) là trong 100g dung dịch có chứa 5g NH
4
Cl
ii) Nồng độ % khối lượng thể tích (w/v): là số g chất tan có trong 100ml dung dịch.
Ví dụ: dung dịch CuSO
4
10% (w/v) là trong 100ml dung dịch chứa 10g CuSO
4
iii) Nồng độ phần trăm thể tích - thể tích, % (v/v): là số ml dung chất có trong 100ml
dung dịch.
Ví dụ: dung dịch glycerine 10% (v/v) là trong 100ml dung dịch chứa 10ml glycerine.
b) Nồng độ gam-lit, (g/L): là số gam chất tan có trong 1 lít dung dịch.
c) Nồng độ phân tử gam hay nồng độ mol, (Mol/L) hay M: là số phân tử gam (hay số
mol) chất tan trong 1 lít dung dịch.
Ví dụ: Dung dịch KH
2
PO
4
M/15 là trong 1000ml dung dịch chứa M/15 phân tử gam
KH
2
PO
4
d) Nồng độ đương lượng (N): là số đương lượng gam (đlg) chất tan có trong 1 lit dung
dịch. Số đương lượng chất tan = số mol (n) x hệ số đương lượng (z)
Hệ số đương lượng (z): phụ thuộc vào bản chất của chất đó và phản ứng mà chất đó
tham gia.
i) Nếu phản ứng là phản ứng acid, base: z là số ion H

2
S
2
O
3
+ I
2
→ Na
2
S
4
O
6
+ 2NaI
I + 1e → I
-
z = 1
S
2+
- 1e → S
+
z = 1
e) Nồng độ dung dịch bão hòa: là nồng độ dung dịch khi tối đa chất hòa tan có mặt trong
dung dịch.
f) Đơn vị nồng độ dùng trong các phép phân tích vi lượng :
- Nồng độ mg/mL: số mg chất tan trong 1mL dung dịch
- Miligam phần trăm, mg%: mg chất hòa tan trong 100g dung dịch.
- Microgam phần trăm, µg%: là số µg chất hòa tan trong 100g dung dịch.
- Phần nghìn,0/00: số g chất hòa tan trong 1000g dung dịch.
- Phần triệu, ppm: số mg chất hòa tan trong 1kg hay 1 lít dung dịch.

M(CuSO
4
) = 160 và M(CuSO
4
.5H
2
O) = 250
Lượng CuSO
4
khan để pha dung dịch là: X = (10*320)/100 = 32g
Lượng CuSO
4
.5H
2
O cần dùng: Y = (250*32)/160 = 50g
Lượng nước cất thêm vào: 320 -50 = 270g (hay ml)
Vậy, cân 50g CuSO
4
.5H
2
O, đong 270ml nước cất, hòa tan ta được 320g dung dịch
CuSO
4
10%.
5
b) Pha dung dịch loãng từ một dung dịch đậm đặc hơn:
Ví dụ: Pha 500g dung dịch NaOH 5% từ dung dịch NaOH 10%
Lượng NaOH cần để pha dung dịch 5% là: X = (5*500)/100 = 25g
Lượng dung dịch NaOH 10% cần dùng là: Y = (100*25)/10 = 250g
Lượng nước cất thêm vào: 500-250 = 250g

Việc cân không thuận lợi, có thể đưa về đơn vị thể tích theo công thức
V = M/d
V: Thể tích chất lỏng; M: khối lượng chất lỏng cần cân; d: tỷ trọng chất lỏng
Chú ý: Các hóa chất lỏng bán trên thị trường thường không ở dạng nguyên chất mà là các
dung dịch đậm đặc. Giới hạn hòa tan tối đa được tính bằng % thể tích và thay đổi tùy
theo loại hóa chất. Ví dụ như H
2
SO
4
: 95-98%; HCl: 37%. Do đó khi pha các dung dịch
từ các loại hóa chất này ta phải chú ý đến nồng độ của dung dịch đậm đặc.
Ví dụ: Pha 440ml dung dịch HCl 1% từ dung dịch HCl 37% (d=1,19g/ml)
Lượng HCl cần để pha dung dịch 1% là: X= (1*440)/100 = 4,4g
Lượng dung dịch HCl 37% cần dùng là : Y = (100*4,4)/37 = 11,9g
= 11,9/1,19 = 10 ml
Lượng nước cất thêm vào:440-10 = 430ml
Vậy, dùng ống đong lấy 10ml dung dịch HCl 37%, và 430ml nước cất ta được 440 ml
HCl 1%
6
Do việc sử dụng các loại bình định mức làm cho việc pha chế dung dịch thí nghiệm
trở nên đơn giản và chính xác vì vậy ngày nay đa số các dung dịch thí nghiệm được pha
chế theo nồng độ khối lượng - thể tích (w/v).
e) Pha dung dịch nồng độ phân tử gam
i) Chất tan là chất rắn khan
Muốn pha dung dịch nồng độ 1M của một chất nào đó, ta tính khối lượng phân tử chất đó
(hoặc tra bảng) theo đơn vị gam. Cân chính xác lượng chất tan, qua phễu cho vào bình
định mức có dung tích 1 lít. Cho vào từng lượng nước cất nhỏ, lắc để hòa tan hoàn
toàn và đưa nước cất tới mức. Chuyển dung dịch sang bình chứa, lắc để trộn đều đồng
nhất.
Khi phải đun nóng dung dịch để hòa tan, hoặc quá trình hòa tan có toả nhiệt thì

Dung dịch chuẩn là các dung dịch được chuẩn bị sẵn, đảm bảo chính xác và được
dùng để định chuẩn các dung dịch tự pha chế khi làm thí nghiệm. Các chất dùng trong
dung dịch chuẩn phải khá bền vững sao cho nồng độ của chúng không thay đổi nhanh
chóng theo thời gian.
Pha dung dịch chuẩn, ta phải dùng ống chuẩn. Ống chuẩn là một ống ampun thủy
tinh hay nhựa đóng kín. Bên trong chứa một lượng cân chính xác chất tan hoặc dung dịch
chất tan. Khi chuyển hết lượng chất tan trong ống vào bình định mức và pha thành 1 lít ta
được dung dịch chuẩn có nồng độ đã ghi trên nhãn ngoài ống.
Cách pha dung dịch chuẩn từ ống chuẩn :
- Dùng đinh thủy tinh chọc thủng ampun, hứng lên phểu vào bình định mức, dùng bình
tia rửa sạch chất tan có trong ampun vào bình định mức 1 lit, vừa thêm nước cất vừa lắc
và đưa nước cất tới vạch mức.
- Đối với các hợp chất bền vững, có thành phần không thay đổi như NaCl, AgNO
3
, acid
oxalic, có thể pha dung dịch chuẩn trực tiếp bằng cách cân chính xác chất cần pha, pha
loãng và định mức tới thể tích đúng.
- Đối với các chất như NaOH, HCl, không thể pha ngay được dung dịch chuẩn, do các
chất này thường không bền vững và dễ thay đổi thành phần, vì vậy sau khi pha phải hiệu
chỉnh lại nồng độ.
Ví dụ: NaOH thường nhiễm một lượng Na
2
CO
3
rất dễ chảy nước, HCl dễ bay hơi,
Na
2
S
2
O

Lấy 10ml H
2
SO
4
0,1N cho vào erlen, thêm ba giọt chỉ thị màu phenolphtalien, dùng
burette chuẩn độ bằng NaOH được 11 ml NaOH
Vậy nồng độ thực tế NaOH đã pha là : Ct = (10*0,1)/11 = 0,091 N
Hệ số điều chỉnh K: K= 0,091/0,1 = 10/11 = 0,91
1.2. Dung dịch đệm:
1.2.1. Định nghĩa dung dịch đệm
pH môi trường làm thay đổi cấu trúc không gian protein vì một số amino acid có
mạch nhánh phân ly (COO
-
và NH4+ tạo liên kết ion). Họat động tối ưu của protein phụ
thuộc vào cấu trúc không gian nhất định trong môi trường, nghĩa là phụ thuộc vào tỉ lệ
phân ly của mạch nhánh thành ion, hay nói tóm lại là phụ thuộc vào pH môi trường.
Dung dịch đệm là dung dịch có pH không thay đổi nhiều lắm khi một lượng nhỏ
acid (H
+
) hoặc base (OH
-
) được thêm vào. Như vậy, dung dịch đệm bao gồm một cặp
acid base liên hợp (acid yếu và muối của acid yếu này hoặc base yếu và muối của base
này) và tỉ lệ của chúng sẽ quyết định pH của dung dịch.
Việc pha dung dịch đệm tuân theo nguyên tắc chọn cặp acid – base có hằng số
phân ly pK A/B gần với pH đệm muốn pha và phối trộn chúng với số mol bằng nhau.
Thí dụ, để có đệm pH ở giá trị 4.75, chọn cặp acid – base CH
3
COOH
(0,1M)/CH

+ OH
-
Dung dịch đệm có pH thay đổi rất ít khi thêm một lượng acid hoặc base. Khi
thêm một lượng acid mạnh (H
3
O
+
), base liên hợp kết hợp với nó cho acid yếu (cân
bằng chuyển dịch theo chiều nghịch) pH của dung dịch giảm không đáng kể. Trái lại,
khi thêm một lượng base mạnh (OH
-
), acid điện li cho H
3
O
+
(cân bằng chuyển dịch theo
9
chiều thuận), ion hidroni H
3
O
+
trung hòa OH
-
cho base yếu H2O. Kết quả pH của dung
dịch tăng không đáng kể.
III. Bài nộp
1. Ghi chép phương pháp pha các dung dịch thực chuẩn bị.
2. Làm các bài tập sau:
1. Pha 1 L dung dịch NaOH 40% (w/v): cân … g NaOH khô
2. Pha 0,5 L dung dịch H2SO4 2M cần bao nhiêu ml H2SO4 đậm đặc, biết rằng H

5 ống nghiệm cỡ >10ml đánh số thứ tự từ I – V
c. Tiến hành:
Số TT Số ml
CH
3
COOH
0.1N
Số ml nước Số ml
casein 0.4%
trong
CH
3
COOH
0.1N
pH Mức độ kết tủa
1
2
3
4
5
0.1
0.2
1
4
8
8.9
8.8
8.0
5
1

(NH
4
)
2
SO
4
tinh thể
Ống nghiệm sạch loại >10ml
c. Tiến hành
- Cho vào mỗi ống nghiệm
5ml lòng trắng trứng
5ml (NH
4
)
2
SO
4
bão hòa, lắc đều, xuất hiện kết tủa globulin
- Để 5 phút, lọc (thấm ướt trước giấy lọc bằng dung dịch (NH
4
)
2
SO
4
, thu kết tủa
globulin
- Cho tiếp 3g tinh thể (NH
4
)
2

- Để lắng kết tủa, gạn dung môi, hòa tan lại kết tủa trong nước.
- Làm lại ở nhiệt độ phòng (20-30
o
C), quan sát và so sánh kết quả.
12
1.2.2. Biến tính protein
Biến tính chỉ trạng thái biến đổi cấu trúc bậc cao của phân tử protein, dẫn đến sự
thay đổi các tính chất của protein như tính tan, hoạt tính sinh học… Khi biến tính, protein
thường đông tụ thành dạng keo không hòa tan.
- Tác dụng ở nhiệt độ cao
a. Nguyên tắc
b. Hóa chất, dụng cụ
Ống nghiệm sạch V>5ml
Giấy lọc
Dung dịch lòng trắng trứng 5% đã được lọc qua giấy lọc nhiều lần
CH3COOH 1% và 10%
NaOH 10%
NaCl bão hòa
c. Tiến hành
Cho vào 5 ống nghiệm, mỗi ống 2ml dung dịch lòng trắng trứng 5%
Ống I: đun và quan sát kết tủa xuất hiện
Ống II: 1 giọt axit acetic 1% và đun. Kết tủa hình thành nhiều và nhanh hơn
Ống III: 0.5ml axit axetic 10%; ống IV: 0.5ml NaOH 10%. Đun và quan sát thấy kết
tủa không hình thành cả khi đun và sôi
Ống V: 0.5ml axit axetic 10% và 3-4 giọt NaCl bão hòa. Đun và quan sát kết tủa xuất
hiện nhanh và mạnh.
d. Kết quả
So sánh và giải thích kết quả tạo thành
- Kết tủa protein bằng axit vô cơ đặc
a. Nguyên tắc

3
5%
Pb(CH
3
COO)
2
5%
CuSO
4
7%
c. Tiến hành
Cho vào 3 ống nghiệm 2ml dung dịch lòng trắng trứng 5%
Thêm vào ống I: 1 giọt dung dịch FeCl
3
5%
Ống II: 1 giọt chì axetat 5%
Ống III: 1 giọt CuSO
4
7%
Quan sát, thêm 1 lượng muối kim loại nặng tương ứng vào từng ống, kết tủa tan.
d. Kết quả
So sánh và giải thích kết quả thu được ở các ống.
Bảng tóm tắt các phản ứng kết tủa protein
TT Tên yếu tố làm kết
tủa protein
Hóa chất Màu của kết
tủa
Ghi chú
1 Muối trung tính
2 Nhiệt độ

dung dịch CuSO4 1%, lắc kỹ, quan sát.
- Định lượng: sử dụng chất chuẩn là albumin huyết thanh bò.
- Lập đồ thị chuẩn protein: cho vào 5 ống nghiệm 3ml các nồng độ 0mg/ml,
20μg/ml, 50 μg/ml, 100 μg/ml, 150 μg/ml, 200 μg/ml, 300 μg/ml và 400 μg/ml
albumin chuẩn. Làm phản ứng biure, đo độ hấp thụ trên máy so màu ở λ=540nm,
vẽ đồ thị.
d. Kết quả
Quan sát sự tạo phức màu đỏ. Tính nồng độ protein tổng số trong lòng trắng trứng.
1.3.2. Phản ứng Adamkievic đặc trưng cho triptophan
15
a. Nguyên tắc
Trong môi trường axit, triptophan cho phản ứng với nhiều loại aldehit tạo thành các
sản phẩm có màu đỏ tím đặc trưng.
Hóa thức:
B1: Tác dụng với
b. Hóa chất, dụng cụ
Dung dịch lòng trắng trứng 1%
Dung dịch gelatin 1%
Axit axetic đặc
H2SO4 đặc
CuSO4 5%
c. Tiến hành
- Cho vào 2 ống nghiệm
Ống nghiệm I: 1ml dung dịch lòng trắng trứng 1%
Ống nghiệm II: 1ml gelatin 1%
- Thêm vào cả 2 ống 1ml axit axetic đặc (có chứa axit glioxilic dạng vệt), lắc đều
(có thể đun nóng và để nguội), thêm vài giọt CuSO4, lại lắc.
- Cầm nghiêng ống nghiệm, nhỏ theo thành ống 1ml H
2
SO

1.4.1. Phản ứng biure
a. Nguyên tắc
Phản ứng đặc trưng của liên kết peptit: trong môi trường kiềm, các hợp chất có từ 2
liên kết peptit trở lên có thể phản ứng với CuSO
4
tạo thành phức chất màu xanh tím đến
màu đỏ tùy thuộc vào số lượng liên kết peptit ít hay nhiều. Vì màu của phức chất giống
nhau ở tất cả các protein nên khi đo độ hấp thụ phức màu ở bước sóng 540nm trên máy
so màu, so sánh với đường chuẩn của protein chuẩn thì có thể định lượng được protein
tổng số.
b. Hóa chất, dụng cụ
Dung dịch lòng trắng trứng 1%
Ure tinh thể
NaOH 10%
CuSO4 1%
c. Tiến hành
- Phản ứng với biure:
+ Bỏ 1 lượng tinh thể ure vào ống nghiệm khô, đun trên ngọn lửa yếu, ure nóng chảy,
khi bắt đầu cứng lại thì ngừng đun. Phản ứng giải phóng NH3, axit xianuric (ngửi mùi
hoặc thử bằng giấy quỳ).
+ Để nguội ống, thêm vào 2ml NaOH 10%, lắc cho tan. Thêm vào vài giọt CuSO4
1%, quan sát màu.
- Phản ứng với protein
Cho vào ống nghiệm 3ml dung dịch lòng trắng trứng 1%, 1ml NaOH 10% và 1-2 giọt
dung dịch CuSO4 1%, lắc kỹ, quan sát.
17
- Định lượng: sử dụng chất chuẩn là albumin huyết thanh bò.
- Lập đồ thị chuẩn protein: cho vào 5 ống nghiệm 3ml các nồng độ 0mg/ml,
20μg/ml, 50 μg/ml, 100 μg/ml, 150 μg/ml, 200 μg/ml, 300 μg/ml và 400 μg/ml
albumin chuẩn. Làm phản ứng biure, đo độ hấp thụ trên máy so màu ở λ=540nm,

H
10
O
5
)
n
+ nH
2
O → nC
6
H
12
O
6
90,0
12,180
1,162
==
F
1.1.2 Hóa chất
- Dung dịch HCl 5%
- Dung dịch NaOH 5%
- Dung dịch Pb(CH
3
COO)
2
10% hoặc Pb(NO
3
)
2

bão hòa. Thêm
nước cất tới vạch mức, lắc đều và lọc.
7. Định lượng đường glucose trong dung dịch (lấy 5ml hoặc 10ml) bằng phương
pháp Betrand, qua đó tính được hàm lượng tinh bột.
2.2.4 Tính kết quả
Hàm lượng tinh bột theo công thức sau:
19
WV
Va
X
*
9,0*100**
1
=
Trong đó:
X- hàm lượng tinh bột tính bằng %,
a- Số mg glucose tra bảng tính được (ứng với số ml KMnO
4
dùng chuẩn độ mẫu thí
nghiệm trừ đi số ml KMnO
4
dùng chuẩn độ mẫu đối chứng),
V
1
- thể tích dung dịch đường (sau khi thủy phân) lấy để xác định đường glucose (ml),
V- dung tích bình định mức,
W- khối lượng mẫu thí nghiệm (mg),
100- hệ số tính chuyển thành %,
0,9- hệ số quy chuyển glucose thành tinh bột,
1.2 Định lượng dextrin

Trong đó:
X- % dextrin trong mẫu,
a- Khối lượng của giấy lọc và kết tủa sau khi sấy (gam),
b- Khối lượng giấy lọc (gam),
V- thể tích định mức (ml),
V
1
- thể tích lấy xác định (ml),
W- khối lượng mẫu phân tích (gam).
Bài 4. Xác định hoạt tính enzyme phân giải protein của các chủng
vi sinh vật
Môi trường phân lập vi khuẩn
Môi trường TSB
Casein peptone 17g
Soya peptone 3g
NaCl 5g
K
2
HPO
4
4g
Glucose 2.5g
Bile Salts 1.5g
pH 7.4 ± 0.2
Agar-agar
2.2.3. Phương pháp tuyển chọn chủng vi khuẩn sinh protease mạnh nhất: được
đánh giá qua hoạt tính sinh protease
• Phương pháp xác định hoạt tính sinh protease: theo phương pháp đo đường
kính phân giải casein
Vi khuẩn được nuôi cấy lắc 180 vòng/phút ở 30