Các phương pháp dùng cho bảo quản nấm sợi a. Phương pháp cấy truyền:
Phương pháp này thường được ứng dụng với các sợi nấm có bào tử. Các
chủng nấm sợi được nuôi trên môi trường thạch thích hợp và để cho sợi nấm phát
triển đến mức độ cực đại, sau đó là quá trình hình thành bào tử, các ống giống này
sẽ được bảo quản theo các cách khác nhau:
- Các ống thạch được để trong tủ lạnh (4-7
O
C).
- Bảo quản trong thạch dưới lớp dầu: Các ống thạch được bảo quản
dưới lớp dầu parafin có tỷ trọng tương đối là 0.83- 0.89 đã được khử
trùng ở nhiệt độ 121
O
C trong 15 phút. Lớp dầu cách bề mặt thạch
khoảng 1 cm. Nhiệt độ bảo quản là 15-20
O
C.
- Bảo quản trong nước, nấm sợi được nuôi trên môi trường thạch đĩa.
Sau khi sợi phát triển cực đại thì cắt thành từng miếng nhỏ kích thước
khoảng 6 mm
2
và cho vào lọ nước đã thanh trùng. Bảo quản tại nhiệt độ
phòng.
b. Bảo quản nấm sợi có bào tử trong silicagel:
Chuẩn bị:
1, Lọ đựng silicagel (10-15ml) có nắp chịu nhiệt (sắt hay nhựa) thanh trùng
ở nhiệt độ 170
O
C trong 3 giờ.

°
C, dùng que cấy vô trùng lấy ra 3 hạt silicagel để trên mặt
thạch môi trường mầm thóc (Maltagar), lắc đều cho hạt silicagel tiếp xúc lên mặt
môi trường. Để ở nhiệt độ thích hợp, kiểm tra tra khuẩn lạc nấm theo thời gian
thích hợp.
c. Bảo quản nấm sợi có bào tử theo phương pháp đông khô (freez-
drying):
Chuẩn bị:
1, Ống đông khô rửa sạch (sonic cleaner) trong 15 phút sau đó khử trùng
170
O
C trong 3 giờ.
2, Môi trường sữa tách bơ (Skimmilk) 20% khử trùng ướt (115
O
C/20 phút).
3, Ống thạch nghiêng (có thể đĩa petri) chứa bào tử nấm sợi, tuỳ theo từng
chủng môi trường nuôi cấy mà thời gian thu bào tử thích hợp khác nhau (10-15
ngày).
Cách tiến hành:
1, Dùng pipet pasteur lấy khoảng 3-4 ml sữa thanh trùng cho vào ống
nghiệm chứa bào tử nấm sợi, dùng que cấy tạo dịch huyền phù bào tử có mật độ
cao nhất (đối với một số chủng có số lượng bào tử thấp thì có thể tạo dịch bào tử
từ một vài ống thạch bào tử khác nhau).
2, Dùng pipet pasteur lấy dịch bào tử cho vào ống đông khô (0,2 - 0,3 ml),
thông thường chuẩn bị 13 ống cho mỗi chủng. Dán nhãn, ghi các thông tin cần
thiết như mã số chủng, ngày bảo quản, môi trường và nhiệt độ thích hợp. Sau đó
đậy bằng nút bông hay giấy bạc.
3, Giữ ở -80
°
C trong 3 giờ trước khi tiến hành đông khô, đồng thời bật máy

C.
Kiểm tra độ sống sót sau khi đông khô:
1, Mở ống đông khô bằng cách đốt nóng đầu hàn trên đèn cồn và làm lạnh
đột ngột bằng cồn đốt.
2, Dùng pipet pasteur lấy khoảng 1ml nước cất vô trùng từ ống nghiệm chứa
9,8 ml nước cất vô trùng làm tan đều mẫu đông khô. Hút toàn bộ dịch huyền phù
sang ống nghiệm chứa 9,8 ml nước cất. Trộn đều và nhỏ vào 3 vị trí khác nhau
(mỗi vị trí 3 giọt) trên môi trường thạch đĩa thích hợp và nghiêng cho dịch chảy
đều dọc theo một hướng như hình vẽ:

3, Sau đó đậy nắp đĩa, bao quanh bằng parafil và để ở nhiệt độ thích hợp.
4, Cách đánh giá:
Rất tốt: ≥ 100 khuẩn lạc.
Khá: 50 – 100 khuẩn lạc.
Trung bình: 10-50 khuẩn lạc.
Kém: < 10 khuẩn lạc.
Không mọc.
Bảo quản được thực hiện với các mẫu từ khá trở lên. Tuy nhiên, có một số
nấm sợi mà khuẩn lạc mọc tràn lan thì có thể đánh giá như sau: Nếu các khuẩn lạc
mọc đều khắp trên bề mặt đĩa là tốt. Mẻ đông khô là thành công nếu như số khuẩn
lạc mọc chiếm ít nhất là nửa bề mặt môi trường trong đĩa petri. Các mẫu có số
lượng khuẩn lạc mọc dưới mức trên phải làm tăng mật độ bào tử trước khi đông
khô như thay đổi môi trường sinh bào tử, hoặc chuẩn bị dịch huyền phù bào tử từ
3-4 ống nghiệm bào tử nấm sợi.
d. Bảo quản nấm sợi bằng phương pháp đông khô trực tiếp:
Phương pháp đông khô trực tiếp thực hiện tương tự như phương pháp đông
khô đã trình bày ở trên và được thực hiện như sau:

đèn chỉ thị cho phép). Khi độ chân không đạt 45-48 minitor, nhiệt độ -55
o
C tiến
hành quá trình làm khô trong 3 giờ.
4, Hàn kín ampoule mẫu:
Khi máy cô Dura-Dry đang chạy để đảm bảo độ chân không cần thiết, lần
lượt khoá van cho từng ampoule mẫu và tiến hành hàn với các mẫu này tại vị trí
ống bị thắt. Dùng ngọn lửa gas để đốt nóng phần ống thắt cho đều các phía và
xoay đều cho thuỷ tinh chảy bịt kín ống. Sau đó dùng ngọn lửa gas để cắt rời phần
trên (nối với manifold) và phần dưới chứa mẫu. Hết đợt lại khoá các van của các
ampoule mẫu tiếp theo và hàn lần lượt như trên.
Kiểm tra chất lượng ngay sau khi bảo quản:
- Để kiểm tra độ sống sót của mẫu nấm sợi bảo quản, có thể thực hiện
theo cách đã được mô tả ở phần đông khô.
- Kiểm tra độ thuần chủng: các mẫu được cấy trên môi trường thích
hợp và quan sát hình thái và các đặc điểm sinh học đặc trưng cần thiết
để đánh giá khả năng tạp nhiễm và đặc tính sinh học.
- Thí nghiệm đánh giá nhanh thời gian bảo quản: các mẫu sau đông
khô trực tiếp được giữ ở 37
o
C trong 2 tuần. Độ sống sót của mẫu bảo
quản giảm trong 2 tuần ở 37
o
C tương đương với bảo quản 10 năm ở
4
o
C.
e. Bảo quản nấm sợi bằng phương pháp lạnh sâu -80
o
C và nitơ lỏng (-196

o
C hay nitơ lỏng (-196
o
C).
Chú ý: Việc bảo quản theo phương pháp lạnh sâu thích hợp với hầu hết các
nấm sợi sinh bào tử và tế bào có vách ngăn. Nhưng phương pháp này tỏ ra không
thích hợp với các nấm sợi không sinh bào tử và không có vách ngăn. Trong trường
hợp này cần nuôi cấy nấm sợi trên môi trường thích hợp để tạo bào tử. Nếu không
khắc phục được thì phải tiến hành nuôi trên môi trường dịch thể để thu lấy sinh
khối và giữ trong glycerol 10% như trên.
Đánh giá khả năng sống của mẫu bảo quản:
1, Làm tan mẫu (mẫu lấy từ tủ lạnh sâu -80
o
C hoặc nitơ lỏng -196
o
C) trong
bể ổn nhiệt 37
o
C trong 2 phút.
2, Dùng que cấy lấy các miếng môi trường thạch đặt vào 3 vị trí khác nhau
trên môi trường thạch đĩa thích hợp. Để ở nhiệt độ thích hợp và xem khả năng mọc
sau thời gian thích hợp (2-4 ngày). Chú ý khi lấy mẫu cần lấy cả sợi nấm để đưa
vào môi trường thạch đĩa.
Một số điều chú ý đối với bảo quản nấm sợi:
- Ảnh hưởng của ánh sáng với quá trình hình thành bào tử: Phần lớn
trường hợp thì sự thành công của phương pháp bảo quản phụ thuộc vào
số lượng bào tử. Ánh sáng là một tác nhân quan trọng đối với quá trình
hình thành bào tử của nấm sợi, ánh sáng có bước sóng ngắn có tác dụng
kích thích quá trình hình thành bào tử, ánh sáng gần vùng cực tím (3100
– 4000 nm) có tác dụng thay đổi màu sắc và kích thước khuẩn lạc.

- Sau đó các mẫu được giữ ở 4
o
C.
- Thông thường theo cách này thời gian bảo quản các chủng thường
thay đổi từ 2- 6 tháng.
Cấy truyền trên môi trường thạch:
Cấy truyền trên môi trường thạch tương tự như môi trường dịch thể nhưng ở
đây môi trường được bổ sung thạch (1.6%). Giống sau khi cấy được giữ trong 72
giờ ở nhiệt độ thích hợp để đạt độ phát triển cần thiết, sau đó được để ở 4-8
o
C.
Theo phương pháp này giống có thời gian sống lâu hơn phương pháp cấy truyền
dịch thể, thông thường giống được bảo quản từ 3-6 tháng.
Thời gian bảo quản có thể được kéo dài từ 2-3 năm nếu như các ống giống
được bảo quản trong dầu parafil đã thanh trùng và được đổ lên trên môi trường
thạch sao cho tạo một lớp dày khoảng 1cm.
b. Phương pháp bảo quản trong lạnh sâu và đông khô (xem phần các
phương pháp dùng cho bảo quản vi khuẩn và xạ khuẩn).