Kĩ thuật hiển vi huỳnh quang | Trang 1/5
Kĩ thuật hiển vi huỳnh quang

Khi các mẫu vật, sống hay không sống, hữu cơ hoặc vô cơ, hấp thụ rồi tái
phát xạ ánh sáng, quá trình được gọi là hiện tượng phát sáng quang hóa. Nếu sự
phát xạ ánh sáng vẫn kéo dài tới vài giây sau khi năng lượng (ánh sáng) kích thích
thôi tác dụng, thì hiện tượng được gọi là lân quang. Còn hiện tượng huỳnh quang
mô tả sự phát xạ ánh sáng chỉ tiếp tục diễn ra khi đang hấp thụ ánh sáng kích thích.
Khoảng thời gian giữa lúc hấp thụ ánh sáng kích thích và lúc tái phát xạ ánh sáng
trong hiện tượng huỳnh quang là cực kì ngắn, thường dưới một phần triệu giây.

Hình 1. Quan sát của Stoke

Hiện tượng huỳnh quang được biết đến vào giữa thế kỉ 19. Nhà khoa học
người Anh George G. Stoke lần đầu tiên quan sát thấy khoáng vật fluorite biểu hiện
huỳnh quang khi được rọi bằng ánh sáng tử ngoại, và ông đã đặt ra từ “huỳnh
quang”. Stoke nhận thấy ánh sáng huỳnh quang có bước sóng dài hơn ánh sáng kích
thích, một hiện tượng trở nên nổi tiếng dưới cái tên sự lệch Stoke. Trong hình 1,
một photon bức xạ tử ngoại (màu tím) va chạm với một electron trong một nguyên
tử, kích thích và đưa electron lên mức năng lượng cao hơn. Sau đó, electron kích
thích rơi xuống mức thấp hơn và phát ra ánh sáng dưới dạng một photon năng lượng
thấp hơn (màu đỏ) trong vùng ánh sáng khả kiến. Hình 2 là biểu đồ biểu diễn vùng
ánh sáng khả kiến của bức xạ điện từ, với bước sóng trải rộng từ xấp xỉ 400 đến 700
nanomét. Bao quanh vùng khả kiến là ánh sáng tử ngoại có năng lượng cao hơn và
ánh sáng hồng ngoại có năng lượng thấp hơn.

Hình 2. Phổ ánh sáng “trắng”
Hiển vi huỳnh quang là một phương pháp tiên tiến để nghiên cứu vật chất có
thể làm cho phát huỳnh quang, hoặc dưới dạng tự nhiên (gọi là sự tự phát huỳnh
quang, hoặc huỳnh quang sơ cấp), hoặc sau khi xử lí với các hóa chất có khả năng
huỳnh quang (gọi là huỳnh quang thứ cấp). Hiển vi huỳnh quang là sáng chế vào

lọc chắn không cho ánh sáng tử ngoại phản xạ đi qua. Cần chú ý rằng đây là phương
thức hiển vi duy nhất trong đó mẫu vật, sau khi bị kích thích, tạo ra ánh sáng riêng
của nó. Ánh sáng phát xạ tỏa ra theo mọi hướng (góc 360 độ), không cần biết đến
hướng của ánh sáng kích thích.

Hình 3. Nguyên lí kích thích và phát xạ

Hiển vi huỳnh quang là công cụ nghiên cứu vô giá và phổ biến nhanh chóng.
Lợi thế của nó dựa trên những thuộc tính mà các công nghệ hiển vi quang khác
Kĩ thuật hiển vi huỳnh quang | Trang 3/5
không dễ gì có được. Việc sử dụng fluorochrome khiến nó có thể nhận dạng được
các tế bào và các thành phần tế bào hạ hiển vi và những thực thể khác có mức độ
đặc trưng cao nằm giữa vật chất không huỳnh quang. Hơn nữa, hiển vi huỳnh quang
có thể phát hiện sự có mặt của chất huỳnh quang với độ nhạy tinh vi. Một số lượng
rất nhỏ phân tử huỳnh quang (cỡ 500 phân tử trên micro mét khối) có thể được phát
hiện. Trong một mẫu vật cho trước, qua việc sử dụng phẩm nhuộm bội, các đầu dò
khác nhau sẽ phát hiện sự có mặt của từng phân tử mục tiêu một. Mặc dù kính hiển
vi huỳnh quang không cho độ phân giải không gian dưới giới hạn nhiễu xạ của mẫu
vật tương ứng, nhưng sự có mặt của các phân tử huỳnh quang ở dưới giới hạn đó
vẫn có thể nhìn thấy rõ rệt.
Kĩ thuật hiển vi huỳnh quang có thể áp dụng cho chất hữu cơ, chất sống (sinh
vật) thuở xưa, hoặc cho các chất sống (với việc sử dụng huỳnh quang trong ống
nghiệm hoặc trong cơ thể sống) hoặc cho chất vô cơ (đặc biệt trong việc nghiên cứu
các chất gây ô nhiễm trong bánh xốp bán dẫn). Cũng có một số nghiên cứu đang
tăng triển sử dụng đầu dò huỳnh quang để ghi lại sự thay đổi nhanh chóng sự tập
trung ion sinh lí, như calcium và magnesium, và độ pH trong tế bào sống.
Nhiều mô thực vật và động vật, cũng như các mẫu vật chất, vốn đã huỳnh
quang khi bị rọi sáng bằng ánh sáng bước sóng ngắn (huỳnh quang tự phát hay sơ
cấp). Sự huỳnh quang tự phát cũng tìm thấy ứng dụng trong nghiên cứu thực vật,
hóa thạch than đá, thạch học đá trầm tích, và trong công nghiệp bán dẫn. Trong

nhãn sử dụng cho hiển vi huỳnh quang, cần phải ghi nhớ rằng fluorochrome được
chọn phải rất có thể hấp thụ và kích thích ánh sáng và vẫn phải gắn với phân tử mục
tiêu. Fluorochrome cũng phải có khả năng cho lượng ánh sáng huỳnh quang phát xạ
thỏa đáng.

Hình 4. Các chất fluorofore phổ biến
Một trong những ứng dụng quan trọng nhất của hiển vi huỳnh quang là trong
lĩnh vực huỳnh quang miễn dịch. Một sinh vật sống tạo ra vô số kháng thể được sử
dụng cùng với các tế bào bạch cầu để làm trung hòa các cá thể ngoại lai xâm nhập
vào như virus, vi khuẩn, và các protein ngoại lai, chứa hoặc sinh ra kháng nguyên.
Phản ứng kháng nguyên - kháng thể rất đặc trưng, thường có thể hình dung như mối
quan hệ giữa chìa khóa và ổ khóa. Huỳnh quang miễn dịch có sự thành công trong
việc kết hợp hài hòa giữa độ nhạy của kính hiển vi quang học và mức độ đặc trưng
cao biểu hiện bởi miễn dịch học.
Trong kĩ thuật huỳnh quang miễn dịch trực tiếp, một kháng thể nào đó được
đánh dấu bằng cách gắn hóa chất fluorochrome để tạo ra một cái gọi là một tiếp
hợp, sau đó phết lên bản kính của kính hiển vi nghi ngờ có mặt một kháng nguyên
nào đó, gọi là kích thích việc sản sinh kháng thể. Nếu kháng nguyên có mặt, thì tiếp
hợp kháng thể được đánh dấu sẽ kết hợp với kháng nguyên và vẫn gắn chặt trong
mẫu vật sau khi rửa sạch. Sự có mặt của tiếp hợp huỳnh quang được gắn bằng hóa
chất và kháng nguyên được chứng minh khi fluorochrome bị kích thích tại cực đại
kích thích của nó, và sau đó cường độ phát xạ ở các bước sóng khác nhau có thể
quan sát được bằng mắt hoặc ghi lại bằng một hệ máy dò (camera kĩ thuật số hoặc
camera truyền thống).
Một kĩ thuật cũng được sử dụng phổ biến nữa gọi là huỳnh quang miễn dịch
gián tiếp, trong đó huyết thanh có khả năng chứa kháng thể chưa đánh dấu và kháng
nguyên liên quan của nó, nhưng chưa rõ, ủ chung với nhau. Cho fluorochrome tiếp
hợp với kháng thể chống lại cơ thể người (nếu sử dụng mẫu vật của con người) rồi
đặt lên bản kính chứa kháng thể - kháng nguyên chưa được đánh dấu. Nếu thực là
như vậy thì sẽ có phản ứng kháng nguyên – khảng thể, kháng thể chống lại cơ thể

thể ghi lại ở một bước sóng phát xạ, bước sóng này được đo độc lập đối với mỗi dải
kích thích. Một máy tính chủ điều khiển kính hiển vi được dùng để tính toán tỉ lệ
giới hạn calcium nội bào tự do qua sự thay đổi cường độ phát xạ huỳnh quang. Lợi
thế của phương pháp tỉ lệ nằm ở chỗ là về cơ bản tất cả các yếu tố được giữ không
đổi, trừ khi các bước sóng kích thích kép tử ngoại gần, mỗi bước sóng tạo ra sự phát
xạ trong phần lục của phổ ánh sáng khả kiến. Một loại chụp ảnh tỉ số tương tự được
thực hiện với đầu dò có tên là Indo-1. Đối với chất fluorochrome này, cũng dùng để
xác định calcium liên kết hoặc không liên kết nội bào, người ta sử dụng một bước
sóng kích thích, nhưng sự phát xạ đo được có hai bước sóng phân biệt calcium liên
kết và calcium không liên kết.
Tác giả: Mortimer Abramowitz, Michael W. Davidson
()
hiepkhachquay dịch