Câu 1: Nêu khái niệm về nuôi cấy mô, tế bào thực vật? Các kỹ thuật nuôi cấy
chính và ứng dụng?
Khái niệm: nuôi cấy mô tế bào thực vật là phạm trù khái niệm chung cho tất cả
các loại nuôi cấy nguyên liệu thực vật hoàn toàn sạch các vi sinh vật, trên môi trường
dinh dưỡng nhân tạo, trong điều kiện vô trùng.
Nuôi cấy mô, tế bào thực vật còn gọi là nuôi cấy thực vật in vitro
Nuôi cấy mô, tế bào thực vật bao gồm hoang loạt các kỹ thuật khác nhau và có khả
năng ứng dụng rộng rãi trong rất nhiều lĩnh vực.
Các kỹ thuật nuôi cấy chính và ứng dụng của nó:
Nuôi cấy hạt giống: tăng khả năng nảy mầm của các hạt khó nảy mầm trong điều
kiện bình thường. Thúc đẩy quá trình này mầm bằng cách bổ sung các chất điều tiêt
sinh trưởng. Tạo ra cây con dùng cho nuôi cấy merisrem hoặc các bộ phận khác
Hoa cái: thụ phấn trong ống nghiệm phục vụ lai xa. Tạo đơn bội và tạo đa phôi
Hoa đực: tạo mô sẹo và cây đơn bội. Tạo đột biến ở mức đơn bội. Tạo dòng đồng
hợp tử
Phôi hợp tử: nuôi cấy cứu phôi khi lai xa. Nhân các dòng lai xa. Phá ngủ nghỉ của
hạt.
Mô sẹo: tạo phôi vô tính. Nuôi cấy tế bào đơn và tách tế bào trần. Tạo cây có biến
dị soma
Tế bào: tạo đột biến ở mức độ tế bào. Tạo tế bào trần để lai vô tính. Biến nạp gen.
Nuôi cấy tế bào đơn
Đỉnh chồi: tạo nhân nhanh dòng đồng nhất về di truyền. Làm sạch virus. Nguyên
cứu -sinh lý phát triển
Phân hóa phôi vô tính: là đường hướng tái sinh chủ yếu. ứng dụng: nhân nhanh,
sản xuất hạt nhân tạo. Cung cấp vật liệu để tạo các protoplast có khả năng sinh phôi.
Cho phép cơ khí hóa quá trình nuôi cấy và sử dụng bioreactor
Đột biến soma: phân lập các biến dị có ích ở kiểu hình lý tưởng song còn thiếu một
số tính trạng mong muốn. Phân lập các biến dị có tích để sản xuất các hợp chất
chống chịu stress tốt hơn. Tạo các biến dị di truyền không qua lại hữu tính ở những
dòng ưu tú
Câu 2: Nêu những ưu điểm của phương pháp nuôi cấy mô – tế bào thực vật so

trúc và chức năng của tất cả mọi cơ thể sống
- Tế bào là đơn vị cấu trúc và chức năng của cơ thể thực vật bởi tế bào rất đa dạng
nhưng tổ chức theo nguyên tác cấu trúc thống nhất và có tất cả các đặc tính của thệ
thống sống:
- Trao đổi chất và năng lượng
- Sinh trưởng, phát triển và sinh sản
- Di truyền cho thế hệ sau đặc tính của mình
- Có khả năng tồn tại độc lập và phân chia trên môi trường dinh dưỡng. Trong
điều kiện nuôi cấy thích hợp tế bào có thể tái sinh và phát triển thành cơ thể
nguyên vẹn.
* Tính toàn năng của tế bào (totipotency): Haberlandt (1902), lần đầu tiên quan niệm
răng: Mỗi một tế bào bất kỳ của một cơ thể sinh vật đa bào đều có khả năng tiềm
tàng để phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh.
- Theo quan niệm của sinh học hiện đại: Mỗi tế bào riêng rẽ đã phân hóa đều
mang toàn bộ lượng thông tin di truyền cần thiết và đủ của cả cơ thể sinh vật
đó. Khi gặp điều kiện thích hợp, mỗi tế bào đều có thể phát triển thành một cá
thể hoàn chỉnh.
- Tính toàn năng của tế bào mà Haberlandt nêu ra chính là cơ sơ lý luận của
phương pháp nuôi cấy mô - tế bào.
*Sự biểu hiện tính toàn năng của tế bào trong nuôi cấy in vitro:
• Quá trình từ nguồn vật liệu ban đầu là tế bào hoặc mô thực vật nuôi cấy phân
hóa thành cây hoàn chỉnh được gọi là sự biểu hiện về tính toàn năng của tế
bào thực vật.
2
Kh nng biu hin tớnh ton nng ca cỏc t bo, mụ ca c th l khỏc
nhau.
Tớnh ton nng ca t bo nuụi cy in vitro biu hin tri qua 3 giai on:
+ T bo phn bit húa vi s phỏt sinh t bo kh bin
+ nh hng phõn húa t bo
+ Phỏt sinh hỡnh thỏi, phỏt sinh c quan

nguyên tố đại lợng
Các nguyên tố: N, P, K, S, Mg, Ca, là cần thiết vàthay đổi tùy theo đối tợng nuôi cấy. Nói
chung, nồng độ mỗi nguyên tố nói trên trong môi trờng > 30ppm. Chúng là nguyên liệu
để tế bào xây dựng nên thành phần cấu trúc của mình.
Các nguyên tố vi lợng: Các nguyên tố khoáng m thực vật cần thiết có nồng độ nhỏ hơn 0,5
mM/l gọi l nguyên tố vi l ợng.Fe, Cu, Zn, Mn, Mo, Bo, I, Co l các nguyên tố vi l ợng
thờng đợc dùng trong môi trờng nuôi cấy in vitro. Các nguyên tố ny đóng vai trò quan
3
trọng trong các hoạt động của enzym. Chúng đợc dùng với nồng độ mỗi nguyên tố <30ppm
v tuỳ thuộc v o loại môi tr ờng m h m l ợng v tỷ lệ của chúng sẽ thayđổi
Trong môi trờng nuôi cấy, Fe thờng đợc dùng dới dạng muối phức (chelat): Fe-EDTA,
Fe-citrate
Nguồn các bon hữu cơ:
Khi nuôi cấy in vitro tế b o, mô thực vật sống chủ yếu theo ph ơng thức dị dỡng. Vì vậy,
cần nguồn cac bon hữu cơ v th ờng dùng l đ ờng saccaroza v với liều l ợng 20 -30g/lít.
Trong một số trờng hợp đặc biệt, có thể sử dụng nguồn đờng khác nh glucoza, maltoza ,
galactoza v lactoza
Các vitamin.
Mô, tế b o nuôi cấy in vitro có thể tự tổng hợp vitamin nh ng không đủ cho hoạt động sống
của chúng nên cần bổ sung thêm vitamin v o môi tr ờng nuôi cấy Đáng chú ý l các vitamin:
thiamin, axit nicotinic, pyridoxin v riboflavin. Nồng độ th ờng dùng khoảng 1mg/lít. Các
vitamin n y đóng vai trò quan trọng trong tế b o vì chúng l các co-enzym. Myo-inositol cần
đợc bổ xung vo một lợng khá lớn 50 - 100mg/lít, chất n y tỏ ra có tác dụng khá rõ đến sự
phân chia của tế bo.
Các chất điều tiết sinh truởng.
Các chất điều tiết sinh trởng l yếu tố quan trọng nhất trong môi tr ờng quyết định kết quả
nuôi cấy auxin v xytokinin đ ợc sử dụng nhiều hơn cả trong nuôi cấy invitro.
*Auxin kích thích sự hình th nh mô sẹo v tạo rễ bất định, kích thích sự d_n của tế b o. Các
auxin thờng sử dụng l : 2,4 - Dicloro phenoxy axetic axit (2,4D), -naphtylaxetic axit ( -
NAA), Indolaxetic axit (IAA). Nồng độ sử dụng:10-5-10-7 M/l *Xytokinin kích thích sự phân

A. Nhóm auxin
Môi trường nuôi cấy được bổ sung các auxin khác nhau như: 1H- indole-3-acetic
acid (IAA), 1-naphthaleneacetic acid (NAA), 1H-indole-3-butyric acid (IBA), 2,4-
dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D) và naphthoxyacetic acid (NOA)
Vai trò:
- Kích thích phân chia và kéo dài tế bào
- Chồi đỉnh cung cấp auxin gây ra ức chế sinh trưởng của chồi bên. Ưu thế chồi đỉnh
làm ức chế sinh trưởng của chồi nách. Nếu ngắt bỏ chồi đỉnh sẽ dẫn đến sự phát
chồi nách. Nếu thay thế vai trò của chồi đỉnh (đã bị ngắt bỏ) bằng một lớp chất keo
có chứa IAA thì chồi nách vẫn bị ức chế sinh trưởng. Cơ chế ức chế của chồi đỉnh
liên quan đến một chất điều hoà sinh trưởng khác là ethylene. Auxin (IAA) kích thích
chồi bên sản sinh ra ethylen làm ức chế sinh trưởng của chồi đỉnh.
- IAA đóng vai trò kích thích sự phân hoá của các mô dẫn (xylem and phloem).
- Auxin kích thích sự mọc rễ ở cành giâm và kích thích sự phát sinh chồi phụ trong
nuôi cấy mô.
- Auxin có các ảnh hưởng khác nhau đối với sự rụng lá, quả, sự đậu quả, sự phát
triển và chín của quả, sự
ra hoa trong mối quan hệ với điều kiện môi trường.
- Tạo và nhân nhanh mô sẹo (callus)
- Kích thích tạo chồi bất định (ở nồng độ thấp)
- Tạo phôi soma (2,4-D)
B. Nhóm các cytokinin
Các cytokinin là dẫn xuất của adenine, đây là những hormone liên quan chủ yếu đến
sự phân chia tế bào, sự thay đổi ưu thế ngọn và phân hóa chồi trong nuôi cấy mô.
Các cytokinin được sử dụng thường xuyên nhất là 6-benzylaminopurine (BAP) hoặc
6-benzyladenin (BA), 6-γ-γ-dimethyl-aminopurine (2-iP), N-(2-furfurylamino)-1-H-
purine-6-amine (kinetin), và 6-(4-hydroxy-3-methyl-trans-2-butanylamino)purine
(zeatin). Zeatin và 2-iP là các cytokinin tự nhiên, còn BA và kinetin là các cytokinin
nhân tạo
Chức năng chủ yếu của các cytokinin được khái quát như sau:

- ABA thường được sản sinh khi có các yếu tố ức chế cây trồng như mất nước
và nhiệt độ thấp đóng băng
- Tham gia vào sự ngủ nghỉ, kéo dài thời gian ngủ nghỉ và làm chậm sự nảy
mầm của hạt
- Ức chế sự kéo dài thân và được sử dụng để kiểm soát sự kéo dài thân cành
- Gây ra sự đóng khí khổng
6
E. Ethylene
- Gây già hoá lá, kích thích sự rụng lá và quả
1 - Làm chín quả
1 - Sinh tổng hợp ethylene được tăng cường khi quả đang chín, cây đang bị úng,
lão hoá, tổn thương cơ giới và bị nhiễm bệnh
2- Điều khiển sự chín của một số loại quả
3- Ethylene kìm hãm sự ra hoa của đa số cây. Tuy vậy, sự ra hoa của xoài, dứa,
một số cây cảnh lại được kích thích bởi ethylene.
4 - Kích thích nở hoa, kích thích sự lão hoá của hoa và lá
5
Câu 6: Nêu khái niệm về nhân giống vô tính in vitro? Nêu các bước chính trong
quy trình nhân giống vô tính in vitro
a. Nhân giống vô tính in vitro
Khái niệm chung: Nhân giống vô tính in vitro là quá trình sản xuất một lượng lớn
cây hoàn chỉnh, từ các bộ phận, cơ quan như: chồi, mắt ngủ, vảycủ, đoạn thân,
lá, của cây mẹ ban đầu thông qua kỹ thuật nuôi cấy in vitro.
Nhân nhanh in vitro được ứng dụng vào:
 Duy trì và nhân nhanh các kiểu gen quí làm vật liệu cho công tác giống.
 Nhân nhanh các loài hoa, cây cảnh khó trồng bằng hạt.
 Duy trì nhân nhanh các dòng bố mẹ và các dòng lai để tạo hạt giống cây rau,
cây hoa và cây trồng khác.
 Nhân nhanh kết hợp với làm sạch virus.
 Bảo quản nguồn gen in vitro

trường tạo rễ. Môi trường tạo rễ thường được bổ sung một lượng nhỏ auxin.
Một số chồi có thể phát sinh rễ ngay sau khi chuyển từ môi trường nhân nhanh
giàu cytokinin sang môi trường không chứa chất điều tiết sinh trưởng.
 Đối với các phôi vô tính thường chỉ cần gieo chúng trên môi trường không có
chất điều tiết sinh trưởng hoặc môi trường có chứa nồng độ thấp của cytokinin
để phôi phát triển thành cây hoàn chỉnh
Bước 5. Huấn luyện và đưa cây ra trồng ở vườn ươm
 Để đ-a cây từ ống nghiệm ra v-ờn -ơm với tỷ lệ sống cao, cây sinh tr-ởng tốt
cần đảm bảo một số yêu cầu:
 Cây trong ống nghiệm đ_ đạt những tiêu chuẩn hình thái nhất định (số lá, số rễ,
chiều cao cây).
 Có giá thể tiếp nhận cây invitro thích hợp: giá thể sạch, tơi xốp, thoát n-ớc.
 Phải chủ động điều chỉnh đ-ợc ẩm độ, sự chiếu sáng của v-ờn ươm cũng nh-
có chế độ dinh d-ỡng phù hợp.
Câu7: Nêu nguyên lí làm sạch virus và các kỹ thuật làm sạch virus trong
nuôi cấy mô, tế bào thực vật in vitro?
Nguyên lý làm sạch virus qua nuôi cấy meristem
Virus tồn tại ở mọi tế bào sống. Tuy nhiên, những nghiên cứu của White
(1934), Limasset và Cornuet (1950), Morel và Martin (1952) cho thấy:
 Nồng độ virus trong tế bào các cây bị bệnh phụ thuộc và tốc độ phân chia tế
bào và khả năng sinh trưởng của tế bào. Tế bào càng phân chia mạnh thì nồng
độ virus càng thấp, nghĩa là những tế bào càng gần đỉnh sinh trưởng thì càng
chứa ít virus hơn.
 Từ đây các ông đã đề xuất kỹ thuật: nuôi cấy meristem (mô phân sinh đỉnh) để
tạo ra cây hoàn toàn sạch virus từ cây đã bị nhiễm bệnh.
 White (1934) đã sử dụng phương pháp lây nhiễm nhân tạo để nghiên cứu sự
phân bố virus trong rễ cây cà chua bị bệnh virus Aucuba gây khảm lá. Kết quả
cho thấy 2 cm ở đầu rễ hầu như không phát hiện ra virus.
8
 Limasset và Cornuet (1950) đã dùng phương pháp huyết thanh định lượng,

- Nhạy, đặc hiệu (kết quả thu được trong 48 giờ), chi phí thấp.
- Không cần có nhà cách ly nuôi cây chỉ thị
Hạn chế:
- Có thể lẫn với một số dạng kết tủa khác.
- Phản ứng khó xảy ra ở nồng độ virus trong dịch cây bệnh thấp.
4. Phương pháp kính hiển vi điện tử
Ưu điểm
 Thao tác đơn giản, nhanh
 Khá chính xác
9
Hn ch:
Ch phỏt hin c cỏc loi hỡnh a, hỡnh si
Nhiu loi virus cú cựng hỡnh dng, kớch thc.
5. Phng phỏp ELISA
Da vo phn ng khỏng nguyờn khỏng th nhng õy khỏng th c liờn kt
vi mt enzyme (enzyme linked). Phc khỏng nguyờn khỏng th enzyme d
dng nhn bit qua phn ng to mu do chớnh enzyme ú xỳc tỏc.
6. Phng phỏp lai AND
Xỏc nh trc tip s cú mt ca ARN lừi ca virus.
Chớnh xỏc, t tin.
S nguyờn lý:
ARN virus lai vi mu dũ >>> Phn ng lai nhn bit khi mu dũ gn ng v
phúng x hoc cht phỏt hunh quang.
Cõu 9. Trỡnh by k thut bo qun ngun gen thc vt in vitro?
Đây là giải pháp công nghệ có triển vọng trong việc bảo quản nguồn gen thực vật nhất là với
các cây nhân giốngvô tínhvà có hạt mất sức nảy mầm ở nhiệt độ và ẩm độ thấp (recalcitrant).
Trong vòng 20 năm gần đây công nghệ này đã đợc phát triển rộng và áp dụng với hơn 1000
loài th c vật khác nhau (F. Engelmann,1997)
Quá trình chuẩn bị mẫu bo qun:
- Thu thập nguồn gen trong tự nhiên hoặc thông qua quá trình trao đổi giống

ngọn
Các giai đoạn của kỹ thuật của bảo quản ngừng sinh trởng tạm thời
Xử lý chống đông cho tế b o, mô của mẫu:
- Xử lý trực tiếp
- Xử lý gián tiết
- Chất chống đông: DMSO, Glycerol, Proline,, Mannitol, and ethylene glycol .
Xử lý lạnh đến nhiệt độ cần thiết (-300C, -400C)
L m lạnh chậm(1-0,1oC/phút)
L m lạnh nhanh( 720 oC/phút)
Bảo quản mẫu trong nitơ lng(-196oC).
Phục hồi mẫu bảo quản
- L m tan băng nhanh (120 oC/phút) cho các mẫu bảo quản ở nhiệt độ 37oC 40oC (1-2
phút)
- Ngâm rửa trong dung dịch saccarose hoặc môi trờng nuôi cấy trong 30 phút
- Nuôi cấy mẫu trên môi trờng thích hợp v tái sinh cây ho n chỉnh
Cõu 10: Khỏi nim bin d dũng soma? Cỏc nguyờn nhõn chớnh gõy nờn bin di dũng soma
trong nuụi cy mụ v ng dng?
A. Khái niệm: Biến dị dòng soma (somaclone variation) l khái niệm dùng để chỉ tất cả các
biến dị thể hiện ở các tế b o, mô nuôi cấy v cây có nguồn gốc từ nuôi cấy mô (Larkin v
Scowcropt, 1981). Biến dị dòng soma còn đợc gọi l biến dị dòng vô tính .
B. Các nguyên nhân chính gây biến dị dòng soma
1.Sự đa dạng di truyền tự nhiên của các tế b o nuôi cấy
Các mẫu cấy trên thực tế bao gồm nhiều loại tế b o khác nhau nh l phloem, xylem, nhu
mô, mô vỏ Những tế b o n y có thể có mức độ bội thể khác nhau. Nói cách khác, có sự đa
dạng tế b o giữa các loại tế b o trong cùng một mẫu cấy. Sự đa dạng tế b o nh vậy thờng
gọi l "polysomatic" (đa bội vô tính). Các lo i nh lúa mỳ, thuốc lá đó đợc công bố l có
các mô đa bội vô tính nh thế.
Nhiều thực vật tồn tại ở dạng thể khảm. Chúng chứa những lớp tế b o hoặc mô có cấu trúc di
truyền khác nhau đợc phát triển từ meristem có chứa lớp hay bộ phận mô bị đột biến.Hiện
tợng n y đặc biệt phổ biến ở các cây thân gỗ.

Nuôi cấy bao phấn trên môi trờng đặc: callus v cây đơn bội xuất hiện trên bề mặt bao phấn
Nuôi cấy bao phấn trong môi trờng lỏng v lắc: hạt phấn giải phóng v o môi tr ờng, callus
v cây đơn bội xuất hiện từ hạt phấn Nuôi cấy hạt phấn tách rời trong môi tr ờng lỏng v lắc
hoặc trong môi trờng bán lỏng: callus v cây đơn bội xuất hiện từ hạt phấn
Nuôi cấy bao phấn
Qui trinh chung tạo cây đơn bội từ bao phấn:
Chọn bao phấn: tốt nhất l chọn bao phấn chứa hạt phấn ở giai đoạn sắp phân b o nguyên
nhiễm lần một. Bao phấn của những hoa đầu tiên của cây cho kết quả cao hơn hoa muộn.
Xử lý nụ hoa: Xử lý lạnh sẽ kích thích nhân dinh dỡng phân chia.Chế độ xử lý nhiệt độ phụ
thuộc v o loại cây. Ví dụ: lúa Japonica xử lý ở 10oC trong 2-3 tuần; lúa Indica xử lý ở 7oC
trong 1 tuần; ngô xử lý ở 4 oC trong 1 tuần
Chọn môi trờng nuôi cấy thích hợp: Tuỳ theo đối, tợng nuôi cấy khác nhau m sử dụng
môi trờng tơng ứng. Tuy nhiên có một số qui luật chung:
- Các cây ho th o cần nhiền auxin, đặc biệt l 2,4 D ở nồng độ cao để khởi động sự
phân chia đầu tiên (đối với lúa mỳ: 10-5mol 2,4 D trong 12 ng y), cây họ c cần ít hơn
(10-6 mol).
- H m l ợng đờng cao: đối với ngô 60 - 120 g saccaroza/ l, lúa 50 -60g saccaroza/ l,
cây họ c 20 - 40 g saccaroza/l.
Bổ sung các hỗn hợp chất tự nhiên: n ớc dừa, pepton
Kỹ thuật tách rời tiểu b o tử :
12
Các bao phấn vô trùng được nghie n hoặc ép trong môi trường lỏng để giảià
phóng hạt phấn ra ngoài bao phấn. Tách hạt phấn ra khỏi bã túi phấn bằng
cách rót dung dòch trên qua lưới lọc có kích thước phù hợp
Dung dòch sau lọcđược ly tâm 800-1000rpm trong 3-5 phút để tách và làm sạch
hạt phấn. Thành pha n nhẹ nổi trên được gạn đi trong khi hạt phấn lắng dướià
đáy được rửa sạch bằng môi trường mới và được ly tâm thêm 2 la n nữa đểà
loại bỏ các chất ức chế trong túi phấn.
Tạo huye n phù hạt phấn với mật độ 104 – 105 tế bào/mlà
Mét sè chó ý khi nu«i cÊy h¹t phÊn

Câu 13. Trình bày phương pháp tách, ni cấy tế bào trần và ứng dụng?
Phư¬ng ph¸p t¸ch tÕ b o trÇn b»ng enzymà
1. Nguyªn t¾c:
- Sư dơng hçn hỵp enzym: xellulolaza, emixellulolaza vµ pectinaza ®Ĩ ph©n gi¶i thµnh tÕ bµo
vµ gi¶i phãng c¸c tÕ bµo trÇn
13
- Một nguyên tắc cơ bản là sau khi thành tế bào đợc tách ra, tế bào trần phải đợc phóng
thích vào môi trờng có áp suất thẩm thấu cao để tránh nớc xâm nhập vào không bào, gây vỡ
tế bào chất, bằng việc bổ sung các chất tạo áp suất thẩm thấu nh saccarose, mannitol,
sorbitol, Ca2+, v.v
- Nồng độ chất tạo áp suất thẩm thấu và thời gian lu giữ tối đa hay đổi cho thích hợp với từng
đối tợng cây trồng
Đây là phơng pháp dùng phổ biến và có hiệu quả cao: từ 1g lá tơi có thể thu nhận đợc từ
6-12 triệu tế bào trần
2. Các bớc tiến h nh:
- Chọn nguyên liệu: ex vitro: mô lá non (cần phải khử trùng), in vitro: lá, mô sẹo, tế bào
huyền phù
- Xử lý gây co nguyên sinh chất (CaCl2 , đờng, manitol 0,5 - 0,7M )
- Xử lý hỗn hợp enzym ( xellulolaza, hemixellulolaza, pectinaza )
- Tách và làm sạch protoplast: lọc, ly tâm
- Kiểm tra khả năng sống ( fluorescein diacetate ) và tạo huyền phù protoplast có mật độ phù
hợp (104 - 107/ml)
Nuôi cấy protoplast:
Thờng chia 2 giai đoạn:
Giai đoạn 1: Nuôi cấy để protoplast tái sinh thành (vỏ ) tế bào và phân chia tạo cụm nhỏ tế bào
( 4 - 10 tế bào): nuôi cấy trong tối hay trong điều kiện ánh sáng yếu, trong môi trờng lỏng có
lắc hay môi trờng bán lỏng. Môi trờng cần giàu dinh dỡng và áp suất thẩm thấu phù hợp.
Nhiều trờng hợp cần dùng lớp nuôi trợ dỡng
Giai đoạn 2: Nuôi cấy tạo mô sẹo ổn định và tái sinh cây hoàn chỉnh: nuôi cấy trong điều kiện
chiếu sáng tốt với quang chu kỳ phù hợp, trên môi trờng đặc. Cần chú ý đến hàm lợng và tỷ

v o đó l DMSO (dimethyl sulfuside )
2. Phơng pháp dùng xung điện (Zimmermann,Scheurich,1982)
Zimmerman (1982) là ngời đầu tiên đề xớng phơng pháp dung hợp tế bào trần nhờ xung
điện (electrofusion).
- Nguyên tắc: các protoplast tích điện nên dịch chuyển trong điện trờng v tạo chuỗi giữa
hai thanh điện cực, dùng xung điện để lm thủng mng của hai protoplast sát cạnh nhau khiến
chúng ho trộn v o nhau
- Thiết bị: máy tạo xung điện, kính hiển vi đảo pha, buồng dung hợp
- Tạo điện trờng: đặt trong buồng dung hợp các điện cực platin có khoảng cách 0,2 - 1,0mm
v nối với nguồn điện có hiệu điện thế 200V/cm
- Tạo xung : hiệu điện thế: 500 - 1000V/cm, thời gian cực ngắn: 1 -200 miligiây
Hiệu quả dung hợp cao nhng đầu t thiết bị lớn
Cõu 15. Nờu khỏi nim v cỏc bc tin hnh ca phng phỏp th phn in vitro?
1.Khái niệm
Để khắc phục hiện tợng bất hợp trong lai xa (lai khác lo i v khác chi) có thể tiến h nh
thụ phấn in vitro hoặc nuôi cấy phôi in vitro.
Hiện tợng bất hợp trong lai xa thờng thể hiện ở hai khâu:
- Bất hợp của giao tử trớc khi thụ tinh: Nếu một hạt phấn lạ rơi trên núm nhụy, lập tức nhụy
sẽ tiết ra chất ức chế sự phát triển của ống phấn hoặc l m biến dạng ống phấn ngăn cản sự thụ
tinh.
- Bất hợp của giao tử sau khi thụ tinh: Trong một số trờng hợp, quá trình thụ tinh vẫn xảy ra
bình thờng khi hạt phấn rơi trên nhụy. Tuy nhiên phôi lai xa lại không phát trin c.
Nguyờn nhân l do giữa nội nhũ v phôi đó th nh một cơ chế ức chế sự phát triển của phôi.
2.Các bớc tiến h nh:
Lấy nụ hoa của cây mẹ ở thời điểm trớc khi nở hoa 2 ng y, khử trùng, tách lấy bầu quả hay
lá noón nuôi cấy in vitro
Lấy nụ hoa của cây bố v o ng y nở hoa, khử trùng, tách lấy bao phấn v để trong điều kiện
vô trùng đến khi chúng tung phấn
Lấy hạt phấn rắc trực tiếp lên mặt cắt của bầu quả hay lá noón để thụ phấn in vitro, hoặc dùng
cách cắt ngắn vòi nhị, ghép vòi nhuỵ khi thụ phấn Khi noón thụ tinh, chúng hình th nh hợp

Phng phỏp chuyn gen bng xung in:
- Thng c s dng cho vic chuyn gen vo t bo trn. T bo trn
(protoplast) l t bo c loi b thnh t bo bng vic x lý t bo vi enzyme
xenlulaza, pectinaza.
- S dng dũng in cú hiu in th cao phỏt xung trong thi gian cc ngn khong
5-6/1000 giõy to ra trờn b mt t bo trn tm thi cỏc l cú ng kớnh 30 m,
m qua ú cỏc ADN bin np cú th xõm nhp vo t bo.
+ u im: Hiu qu chuyn gen cao, n nh, c bit i vi cỏc gen n.
+ Nhc im: H thng tỏi sinh t bo trn ca nhiu loi thc vt cũn khú khn vi
tiờm Chuyn gen bng phng phỏp vi tiờm (micoinjection):
S dng cỏc thit b hin vi, vi thao tỏc. S dng cỏc kim tiờm rt mnh a cỏc
on ADN trc tip vo nhõn ca t bo trn, t bo tin phụi ca hp t hay ht
phn.
+ u im:
- Lng ADN c bin np tu ý v xỏc nh.
16
- ADN được đưa đúng vị trí mong muốn, thậm chí nhân tế bào.
- Có thể áp dụng đối với các tế bào có kích thước nhỏ bé như tế bào hạt phấn, phôi
non mà các kỹ thuật khác không thực hiện được.
+ Nhược điểm:
- Mỗi lần biến nạp chỉ đưa vào một tế bào duy nhất. Do vậy, đây là phương pháp tốn
nhiều thời gian và công sức.
- Chỉ có thể thực hiện bởi các kỹ thuật viên có kỹ năng cao.
- Đòi hỏi thiết bị tương đối đắt tiền.
hóa chất.
Phương pháp chuyểng gen nhờ PEG (polyethylen glycol):là phương pháp chuyển
gen vào tế bào trần. Ở nồng độ cao PEG làm ADN cần biến nạp không còn ở trạng
thái hoà tan mà kết dinh lại trên màng sinh chất. Bằng cách loại bỏ PEG và xử lý
nồng độ cao của Ca2+ hoặc pH cao ADN biến nạp sẽ được chuyển vào trong tế bào
trần.

- Đoạn T-DNA của Ti-plasmid mang các gen điều khiển sinh tổng hợp auxin và
cytokinin cản trở sự tái sinh của cây trong qúa trình nuôi cấy. Nó còn chứa các gen
điều khiển tổng hợp opine sử dụng các nguyên liệu của cây ảnh hưởng đến năng
suất.
- Ti-plasmid không mang gen chỉ thị (reporter, seletion genes) nên khó chọn lọc cây
chuyển gen.
- Các điểm cắt của RE nằm rải rác nên khó thao tác.
Do đó, cần thiết kế lại Ti-plasmid tự nhiên để đáp ứng tiêu chuẩn cần thiết của một
vector chuyển gen thực vật. Quá trình thiết kế vector này như sau:
* Nguyên lý chung:
- Giữ lại các gen Vir cần thiết cho quá trình vận chuyển T-DNA gắn vào NST tế bào
thực vật.
- Giữ lại vùng bờ trái (LB), bờ phải (RB) và thay thế các gen cần thiết vào vùng T-
DNA
Có 2 loại hệ thống vector chuyển gen vi khuẩn A. tumefaciens:
Vector đồng liên hợp (co-integrated vector)
Dựa trên sự tái tổ hợp của 2 loại plasmid.
- Plasmid 1: Có nguồn gốc từ plasmid vi khuẩn E. coli nên tái bản được trong E. coli.
Có chứa phần bờ trái hoặc bờ phải, có các gen mục tiêu và các gen chỉ thị, có đoạn
ADN tương đồng Ti-plasmid.
- Plasmid 2: là Ti-plasmid cải tiến. Cắt bỏ toàn bộ phần T-DNA, giữa lại vùng bở phải
hoặc bờ trái, giữ lại vùng gen Vir, bỏ đi vùng tổng hợp enzyme di hóa opine. Vector
này được nhân dòng trong vi khuẩn A. tumefaciens.
Sau đó, cho tương tác 2 loại plasmid 1 và plasmid 2, kết quả tạo ra vector liên hợp
được sử dụng chuyển gen vào
Vetor nhị thể (Binary vector): là hệ thống dùng 2 plasmid riêng biệt:
- Plasmid 1: Có nguồn gốc từ E. coli nhưng được thiết kế lại:
+ Thêm gốc tái bản trong A. tumefaciens.
+ Gắn các gen mục tiêu, promoter, gen chỉ thị nằm giữa LB, RB.
- Plasmid 2: là Ti-plasmid được cắt bỏ toàn bộ các phần LB, RB, T-DNA, gen mã hóa

tinh dầu dùng trong dược, mỹ phẩm, cây Đăng lấy gỗ, Chè vang - một loại chè rất
khó trồng. Kĩ thuật này giúp lai tạo thành công giống lúa chịu hạn DR1, nhân bản
nhiều loại khoai tây, mía
- Chỉ với 3 người, Phòng nuôi cấy mô – Trung tâm Giống và Kĩ thuật cây trồng
Phú Yên có thể tạo 500.000 cây lan cấy mô theo yêu cầu cầu của khách hàng.
- Từ năm 2001 đến nay, Sở Khoa học – Công nghệ Lạng Sơn, hàng năm cung
cấp hàng vạn cây giống Bạch Đàn Europhylla.
- Trung tâm Ứng dụng và chuyển giao tiến bộ công nghệ tỉnh
Vĩnh Phúc vừa ứng dụng thành
công CNNCMTB để nhân giống cây Lô hội - một
loài dược liệu quý của địa phương.
Việt Nam có thể trở thành quốc gia sản xuất phong lan lớn trong khu vực.
- Hiện nay, 100% nông dân Đà Lạt sử dụng cây giống từ nuôi cấy mô.
Bước sang năm 2008 công nghệ nuôi cấy mô đã có những bước đột phá mới:
Nhân giống thành công giống sâm Ngọc Linh quý hiếm, khôi phục nhiều loài Lan
rừng quý hiếm khỏi nguy cơ tuyệt chủng đặc biệt là loài lan Hài hồng - loài lan hài
duy nhất có hương thơm trên thế giới
19