Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn
1. GIỚI THIỆU CHUNG
Vào ngày 14-9-1990, nhóm nghiên cứu tại học viện sức khỏe quốc gia Mỹ
(U.S.National Instituse of Helth) đã tiến hành chuỗi thử nghiệm liệu pháp gen đầu
tiên cho bé Ashanti Desilva 4 tuổi. Sinh ra với căn bệnh di truyền hiểm nghèo có tên
là severe combined immune deficiency SCDI, cô bé thiếu hệ thống miễn dịch và có
thể bị tổn thương khi mắc phải bất kỳ mầm bệnh nào. Trẻ em mắc bệnh này thường
không chống lại được sự lây nhiễm của bệnh tật và rất khó sống đến tuổi trưởng
thành, tuổi thơ của chúng luôn mắc bệnh tật. Ashanti được lập một hành lang bảo vệ
xung quanh, không tiếp xúc với những người ngoài gia đình, trong môi trường vô
trùng tại nhà và được điều trị thường xuyên với kháng sinh liều cao.
Trong thủ tục liệu pháp gen của Ashanti, bác sĩ đã tách các tế bào máu trắng ra
khỏi cơ thể cô ta, cho chúng phát triển trong phòng thí nghiệm, gắn gen thiếu vào các
tế bào này và sau đó chuyển các tế bào đã được biến đổi di truyền trở lại máu của
bệnh nhân. Những kiểm tra trong phòng thí nghiệm đã cho thấy liệu pháp này đã làm
tăng hệ thống miễn dịch của Ashanti, cô ta không bị cảm lạnh trở lại, có thể đến
trường và đã miễn dịch với chứng ho. Thủ tục này không phải là một phương thuốc,
những tế bào máu trắng được xử lý về mặt di truyền chỉ làm việc trong một vài tháng
và quá trình này phải lặp lại.
Mặc dù sự giải thích đơn giản về liệu pháp gen này dường như có kết quả khả
quan, nhưng nó mở đầu cho một cuộc tranh luận kéo dài; con đường để liệu pháp gen
được chấp nhận chứa đầy những cuộc tranh luận. Liệu pháp gen sinh học ở người là
rất phức tạp, một số công nghệ cần được phát triển và những căn bệnh cần được hiểu
biết cặn kẽ hơn trước khi liệu pháp gen có thể được sử đụng một cách thích đáng.
Tuy nhiên, không thể phủ nhận rằng, ngày nay liệu pháp gen là một lĩnh vực
khổng lồ với cơ hội sinh lời lớn cho các nhà đầu tư có hiểu biết. Bằng chứng là sự
phát triển của các nghiên cứu về liệu pháp gen trong hơn một thập kỷ qua. Lĩnh vực
này có tiềm năng vô cùng to lớn, một số người đã so sánh tiềm năng đầu tư trong
công nghệ sinh học đặc biệt là liệu pháp gen với kinh nghiệm về công nghệ những
năm 1980.
2. LIỆU PHÁP GEN LÀ GÌ?
Liệu pháp gen có thể được tiến hành thông qua một số cách sau:
Chuyển trực tiếp gen vào mô người bệnh.
Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn
Tạo véctơ virus để chuyển gen một cách hiệu quả tới tế bào (in vivo).
Virus xâm nhiễm trực tiếp vào tế bào bằng cách gắn với chúng và “bơm” thông tin di
truyền của chúng vào tế bào. Vì các virus tự nhiên tự sinh sản bên trong tế bào chủ
nên gây hại với vật chủ mang chúng. Tuy nhiên, có thể xoá hay làm mất các phần có
hại của virus, ngăn không cho chúng tái bản trong tế bào chủ. Ngày nay các virus
không có khả năng tái bản này được sử dụng chung cho các nghiên cứu liệu pháp gen
trên người và động vật.
Sử dụng các kỹ thuật khác nhau để chuyển gen vào tế bào bên ngoài
người bệnh, sau đó chuyển các tế bào đã được biến đổi này vào người
bệnh (ex vivo). Phương pháp này được sử dụng chung để phân phối các
nhân tố phát triển và các phân tử khác tới các vùng đặc hiệu của cơ thể.
Chúng cũng được sử dụng để tạo ra các dòng tế bào đã bị biến đổi hoàn
toàn cho cấy ghép. Giống như trong liệu pháp gen in vivo, các tế bào được
chuyển có thể gây biểu hiện các protein lạ gây sưng tấy hay đáp ứng miễn
dịch.
Các nhóm chuyên gia đã chia liệu pháp gen thành các mức khác nhau:
Chuyển gen với sự hoà nhập (gen được kết hợp chặt chẽ với DNA của
vật chủ)
Chuyển gen không hoà nhập (gen không kết hợp chặt chẽ với DNA của
vật chủ)
Sử dụng các oligonucleotide tổng hợp nhân tạo gọi là các phân tử
ribozyme/antisense không có các thành phần điều hoà (sự biểu hiện gen đã
bị biến đổi).
2.2. Các bước cơ bản trong liệu pháp gen
Trong thực nghiệm, người ta dùng các vector virus để chuyển các gen vào tế bào
động vật theo 2 bước:
Bước 1: Tạo vector tái tổ hợp mang gen cần chuyển. Trước đó, các virus đã được
Kay, M., Glorioso, J., Naldini, L. Nature Medicine 7 (1) 2001
3.1. Các cơ sở của sinh học phân tử:
Thông tin di truyền dưới dạng DNA tồn tại trong mỗi tế bào của cơ thể (trừ các tế
bào máu). Mỗi tế bào chứa đựng các thông tin để xây dựng bất cứ dạng tế bào hay
mô đặc hiệu nào của sinh vật. Vì các tế bào và mô khác nhau quy định sự sản xuất
của các khối cấu trúc (building block) khác nhau nên DNA chứa đựng thông tin liên
Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn
quan đến khối các cấu trúc để sản xuất các mô đặc hiệu. Sự tiến hoá đã cung cấp một
giải pháp tuyệt vời cho vấn đề này. DNA được tạo nên từ một chuỗi bốn phân tử
khác nhau: adenine, guanine, cytosine và thymine. Sự kết hợp của các phân tử này tạo
nên “ngôn ngữ” của DNA. Gen, được tạo nên từ DNA mã hoá tất cả các protein, là
khối cấu trúc của tế bào. Các promoter cho phép hoạt hoá của các gen và qua đó các
protein đặc hiệu được biểu hiện. Các vùng khác của DNA không mang mã và là phần
quan trọng để bảo tồn cấu trúc nhiễm sắc thể. Thành phần này của của DNA vô cùng
quan trọng trong các dự án về bộ gen, tính tuần hoàn đoạn của DNA trong các vùng
không mang mã có thể được kết hợp với các gen đã biểu hiện, cho chúng ta phương
pháp tìm kiếm các gen chưa biết.
Tự nhiên đã phát triển một cách thức rất thông minh mà qua đó các protein
đặc hiệu chỉ được biểu hiện trong các mô dặc hiệu. DNA sắp thành các sợi dài gọi là
nhiễm sắc thể. Có hai bản sao của mỗi gen tồn tại trong tế bào. Tuy nhiên có một số
trường hợp ngoại lệ, các gen tồn tại trong các nhiễm sắc thể X và Y (nhân tố quyết
định giới tính) có thể chỉ có duy nhất một bản sao.
Thông tin được truyền từ DNA đến các cơ quan phức tạp hơn. Quá trình phiên
mã được bắt đầu bởi các phân tử nhận biết đặc hiệu có tên là các nhân tố phiên mã
(nhân tố gắn với các chuỗi điều hoà của gen và cho phép sự sao chép được tiến
hành). Bản sao được tạo thành từ phân tử ban đầu gọi là RNA trong nhân tế bào. Bản
sao sau đó ra khỏi nhân tế bào, chuyển đến lưới nội chất, nơi mà nó sẽ được dịch mã
tổng hợp thành protein.
3.2. Cơ sở của liệu pháp gen
Để chuyển gen, cần hội đủ một số điều kiện sau đây:
gen. Hiện nay đích ứng dụng quan trọng nhất của liệu pháp gen là các bệnh hiểm
nghèo, ở đó mô bệnh dễ dàng bị ảnh hưởng và những bệnh mà sự điều hoà chính xác
của gen được chuyển là không cần thiết. Đúng như mong muốn, hiệu quả của liệu
pháp trong các trường hợp này dễ dàng quản lý.
Sự tinh vi của chúng ta trong thiết kế vector và promotor ngày càng tăng, mở ra
nhiều triển vọng mới cho những ứng dụng điều trị các bệnh hiểm nghèo (như bệnh
đái đường) thông qua sự tập hợp thông tin của các dự án về bộ gen người mà ở đó sự
điều hoà gen là phức tạp hơn.
Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn
Để chuyển gen, trong các nghiên cứu sử dụng các vector có hoặc không có bản
chất virus nhằm đưa gen mục tiêu đến các tế bào. Hiện nay, các nghiên cứu phân phối
gen nhờ retrovirus diễn ra nhiều nhất sau đó đến adenovirus.
3.3. Vector chuyển gen có bản chất virus
3.3.1. Các bước quan trọng để hoạt hóa thành công virus và chức năng
của nó
Sự sử dụng virus trong liệu pháp gen dựa trên các chức năng cơ bản của nó:
Chuyển đặc hiệu vật chất di truyền đến tế bào. Virus chứa vật chất
di truyền được bao quanh bởi lớp màng protein. Đầu tiên, virus gắn tới các
tế bào riêng biệt bằng sự tương tác với thụ thể (hay một chuỗi các điểm thụ
thể) trên bề mặt tế bào. Tiếp đó, virus vào tế bào bởi sự tương tác với các
phân tử bề mặt đặc hiệu trên tế bào, bằng cách này nó dễ dàng đi xuyên
qua lớp rào chắn màng tế bào.
Sự phụ thuộc vào dạng của vector virus được sử dụng, những gen được
mang bởi virus hoặc được nhân bản sử dụng nguyên liệu của chính các tế
bào hoặc được tiếp hợp tới nhân của tế bào, nơi mà các nhiễm sắc thể và
DNA nhân tồn tại. Các gen đặc hiệu được mang và được tiếp hợp bởi virus
sẽ phiên mã thổng hợp RNA và dịch mã tạo thành protein để tạo nên chức
năng mong muốn hay sản phẩm của liệu pháp.
Các virus khác nhau có mức độ khác nhau trên phương diện chuyển gen
của chúng tới các tế bào và tạo ra các sản phẩm gen. Hơn nữa, hiệu quả
hoà quá trình dịch mã của bộ gen. Các vector đã tách gen này cho phép mang gen dài
8kb. Trước đây, sự phát triển của các vector này dựa trên việc sử dụng virus giúp đỡ
(helper virus) để cung cấp các chức năng của gen bị huỷ. Tuy nhiên, ngày nay một
dòng tế bào có giá trị thương mại đã được tạo ra để mang các gen bị xoá dạng vector.
Sự phát triển của các dòng tế bào này có thể làm adenovirus có giá trị thương mại và
an toàn hơn. Khi đó rủi ro của việc sử dụng virus kiểu hoang dại được giảm bớt.
Trên hết, sản phẩm vector này có hiệu quả, với nồng độ 1x10
12
đoạn virus/ml
đang được sản xuất. Phép đo hoạt tính vector thực tế rất quan trọng trong liệu pháp
gen. Việc đo các phần tử vector đơn độc không bao hàm rằng tất cả các đoạn là
nhiễm và do đó, có hoạt tính. Hiện nay, có những cố gắng tiêu chuẩn hóa liều lượng
và hoạt tính của các vector virus.
Thật không may, hệ thống vector adenovirus đã xuất hiện một vài bất cập. Sự sản
xuất của liệu pháp gen là giới hạn cho một chu kỳ thời gian ngắn và DNA đã được
chuyển không trở thành một phần của DNA trên tế bào chủ. Các tác động trở lại của
vector adenovirus cũng có thể gây ra đáp ứng miễn dịch mạnh trên vật chủ, có nguy
cơ dẫn tới các biến chứng nghiêm trọng. Trọng tâm nghiên cứu hiện nay nhằm cải
tiến vector adenovirus đích và giảm các phản ứng miễn dịch do virus gây ra, mang tới
thành công đầy hứa hẹn trong việc sự sử dụng các vector phá huỷ bên trong (gutted
vector) chỉ sử dụng vỏ ngoài của adenovirus.
Sự phát triển thú vị khác là khả năng điều khiển vector adenovirus đích tới các
nhóm tế bào đặc hiệu. Công nghệ “retargeting” bao gồm việc sản xuất kháng thể cho
protein thụ thể có vỏ adenovirus, nhân tố được sử dụng để gắn kết và gia nhập tế bào.
Kháng thể này được hợp nhất với kháng thể đơn dòng (monoclonal) chống lại protein
Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn
đặc hiệu tồn tại trên bề mặt của tế bào. Vector sau đó hoà trộn với kháng thể dung
hợp. Khi được sử dụng, chỉ những tế bào biểu hiện protein đặc hiệu được chữa trị
bằng vector này. Một số công ty (ví dụ: GenVec) sản xuất vector adenovirus đã biến
đổi bề mặt điểm thụ cảm, điểm sẽ kết hợp với các tế bào khác nhau. Việc phân loại
Hình 3: cấu trúc bộ gen của kiểu hoang dại (wild-type) và của vectorAAV.
Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn
(A) bản đồ bộ gen của AAV hoang dại chứa các khung đọc (reading
frames) Rep và Cap, các promoter (p5, p19, và p40), polyadenylation site
(pA), và inverted terminal repeats (ITR). Quá trình phiên mã của virus mã
hoá các protein Rep và Cap (VP1-3) khác nhau được vẽ dưới bộ gen. Các
protein Rep nhỏ hơn được dịch mã từ các điểm khởi đầu nội tại (internal
initiation sites).
(B) bản đồ của vector AAV, cho thấy sự thay thế các gen Rep và Cap
của virus với băng chuyển gen (promoter, transgene cDNA và
polyadenylation site).
(C) Cấu trúc bậc hai của AAV ITR, với các vùng gắn Rep (RBS) và
vùng tiêu tan cuối cùng (TRS) (terminal resolution site)
Thuận lợi chính của hệ thống vector AAV là nó hoà nhập với nhiễm sắc thể của tế
bào chủ. Điều này cho phép các vector được chuyển biểu hiện một cách ổn định và
lâu hơn. Nhưng thật không may, nếu AAV kiểu hoang dại hoà nhập tại điểm đặc hiệu
trong nhiễm sắc thể 19 thì các vector tái tổ hợp lại mất tính đặc hiệu này và hoà nhập
tuỳ tiện. Cho dù vậy, một vài thành công trong nghiên cứu trên động vật và người đã
cho thấy rằng, sụ biểu hiện ổn định có thể đạt được với vector này.
Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn
Hình 4: Quá trình phiên mã của vector AAV. Các bước khác nhau cần cho quá
trình phiên mã của vector AAV bao gồm: đầu tiên AAV tương tác với các receptor
đa dạng và các phân tử coreceptor trên bền mặt tế bào, sự tiếp thu virion, nhân vào
trong tế bào và giải phóng bộ gen mạch đơn vủa vector, sự lai của bộ gen đưa vào bổ
sung (complementary input genomes) và sự hoà nhập nhiễm sắc thể trước biểu hiện
gen có thể xảy ra từ khuôn xoắn kép DNA. Cấu trúc bậc hai tiềm tàng của bộ gen
vector bổ sung (episomal) xuất hịên như các phân tử vector RNA đã được mã hoá.
Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn
điều này đã được quan sát trên các động vật mẫu.
Copyright: Tài liệu đại học ©