0

Trường Đại học Công nghiệp
thực phẩm TP.HCM

2010

ThS. Lê Thùy Linh

THỰC HÀNH PHÂN TÍCH

VI SINH THỰC PHẨM

Lưu hành n
ộ
i b
ộ

Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM

Biên soạn: Lê Thùy Linh Page | 1
Homepage: http://lethuylinh.weebly.com

NỘI DUNG Trang
Bài 1: Định lượng Coliforms và E. coli 2
1.1. Tóm tắt kiến thức cơ bản 2
1.2. Quy trình định lượng Coliforms và E. coli bằng phương pháp MPN 3
1.3. Cách tiến hành thí nghiệm 4

1.1 Tóm tắt kiến thức cơ bản
1.1.1 Định nghĩa
Coliforms là những trực khuẩn gram âm không sinh bào tử,
hiếu khí hoặc kỵ khí tùy ý, có khả năng lên men lactose sinh acid và
sinh hơi ở 37
0
C trong 24 – 48 giờ. Coliforms được xem là nhóm vi
sinh vật chỉ thị: số lượng hiện diện của chúng trong thực phẩm, nước
hay các loại mẫu môi trường được dùng để chỉ thị khả năng hiện
diện của các loại vi sinh vật khác. Nhóm Coliforms gồm 4 giống là:
E. coli, Citrobacter, Klebsiella, Enterobacter. Tính chất sinh hóa
đặc trưng của nhóm này được thể hiện qua các thử nghiệm Indol (I),
Methyl Red (MR), Voges-Proskauer (VP) và Citrate (iC) thường được gọi là IMViC.
Coliforms chịu nhiệt là những Coliforms có khả năng lên men lactose sinh hơi
trong khoảng 24h khi ủ ở 44
0
C trong môi trường canh EC.
Coliforms phân (Faecal Coliforms) là Coliforms chịu nhiệt có khả năng sinh
indole khi ủ khoảng 24h ở 44
0
C trong canh Trypton. E. coli là Coliforms phân cho kết
quả thử nghiệm IMViC là ++ (Indol +, Methyl Red +, Voges-Proskauer -, Citrate -)
1.1.2 Phương pháp Most Probable Number (MPN)
Đây là phương pháp định lượng dựa trên kết quả định tính của một loạt thí nghiệm
được lặp lại ở một số độ pha loãng khác nhau. Thông thường, việc định lượng này được
thực hiện lặp lại 3 lần ở 3 độ pha loãng bậc 10 liên tiếp, tổng cộng 3 x 3 = 9 ống nghiệm.
Quy trình thực hiện như sau:

ủ
a vi sinh v
ậ
t c
ầ
n
ki
ể
m đ
ị
nh

Ghi nhận số lượng ống nghiệm dương tính
ở từng độ pha loãng. Tra bảng Mac Crady
Mật độ vi sinh vật MPN/100 ml hay MPN/1g mẫu
Hình 1: phát hiện Coliforms và E.
coli trong thực phẩm hay nước bằng
môi trường CHROMagar ECC
Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM

Biên soạn: Lê Thùy Linh Page | 3
Homepage: http://lethuylinh.weebly.com

Chú ý:
Đa số các bảng MPN cung cấp số liệu ở dạng số MPN trong 100ml dung dịch
được sử dụng để phân tích ở các liều lượng là 10ml, 1ml, 0.1 ml. Trên thực tế phân tích,
người ta thường dùng 1ml cho mẫu đã pha loãng 10
-1
, 10
-2

1.2 Quy trình định lượng Coliforms và E. coli bằng phương pháp MPN
Chuẩn bị dịch đồng nhất hoặc pha loãng mẫu để có độ
pha loãng 10
-1
, 10
-2
, 10
-3
…

Chuyển 1ml dung dịch 10
-
1
, 10
-
2
, 10
-

ở 44.5
0
C ± 0.2
0
C, 24 giờ
Số ống (+)(sinh hơi )ở
m
ỗ
i đ
ộ

pha loãng

Số ống (+) ở mỗi độ pha loãng
Coliforms
Cấy lên thạch EMB, ủ ở 37
0
C,
24 giờ
Xem
trang
sau
Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM

Biên soạn: Lê Thùy Linh Page | 4
Homepage: http://lethuylinh.weebly.com


LSB
(Lauryl Sulphate
Broth)
Tryptose: 20g
Lactose: 5g
Sodium chloride: 5g
KH
2
PO
4
: 2.75g
K
2
HPO
4
: 2.75g
Lauryl sulphate: 0.1g
1000 ml nước
cất
pH 6.8 ± 0.2
Phân phối 90ml LSB cho
mỗi tổ (10ml/ống nghiệm)
trước khi khử trùng. (buổi 1)

BGBL
Peptone: 10g 1000 ml nước Phân phối 90ml BGBL cho
Tiếp
theo
Chọn khuẩn lạc (tròn, dẹt hình đĩa và có
ánh kim xanh), cấy vào Trypton, MR-VP,

Lactose: 5g
KH
2
PO
4
: 1.5g
K
2
HPO
4
: 4g
NaCl: 5g
1000 ml nước
cất
pH 6.9
Phân phối 90ml BGBL cho
mỗi tổ (10ml/ ống nghiệm có
chứa ống Durham) trước khi
khử trùng. (buổi 1)
EMB
(Eosin Methylene
Blue Agar)
Pancreatic digest of
gelatin: 10g
Lactose: 10g
K
2
HPO
4
: 2g

Casein Pancreatic
Digest: 3.5g
Peptic digest of animal
tissue:3.5g
Dextrose: 5g
Potassium phosphate: 5g
1000ml nước
cất.
pH 6.9 ± 0.2
Mỗi tổ chỉ dùng 30ml, phân
phối 10ml/ống nghiệm.
Kiểm tra lại môi trường cung
cấp nào để pha môi trường.
(buổi 3)
Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM

Biên soạn: Lê Thùy Linh Page | 6
Homepage: http://lethuylinh.weebly.com

pH 6.9 ± 0.2
Môi trường 3:
Peptone: 5g
Glucose: 5g
Phosphate buffer: 5g
pH 7.5 ± 0.2
SCA
(Simmons Citrate
Agar)
Sodium citrate: 2g
NaCl: 5g

Bước 2: khử trùng dụng cụ và môi trường đã pha.
Bao gói dụng cụ và phân phối môi trường vào dụng cụ, gắn nút và bao gói. Hấp
tiệt trùng ở 121
0
C trong 15 phút.
1.3.2 Cách tiến hành:
Bước 3: pha loãng mẫu

Hình 2: quy trình pha loãng mẫu
Pha loãng mẫu thành 3 nồng độ pha loãng 10
-1
, 10
-2
, 10
-3
.
ống
mẫu
10
-
1

10
-
2

10
-
3


-1
, 10
-2
, 10
-3
vào ống 10ml canh LSB, mỗi nồng độ có 3
ống lặp lại, ủ ở 37
0
C, 48 giờ. Bước 5: Định lượng Coliform và E. coli
Định lượng Coliform Định lượng E. coli
Ghi nhận số ống có sinh hơi (+) Ghi nhận số ống có sinh hơi (+)
Dùng que cấy vòng cấy chuyển dịch mẫu
từ các ống LSB (+) sang các ống có chứa
canh BGBL và ủ ở 37
0
C ± 1
0
C, 48 giờ
Dùng que cấy vòng cấy chuyển dịch mẫu
từ các ống LSB (+) sang môi trường canh
EC, ủ ở 44.5


10
-
3

Hình 3: Sơ đồ cấy mẫu từ các độ pha loãng
Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM

Biên soạn: Lê Thùy Linh Page | 8
Homepage: http://lethuylinh.weebly.com Bước 6: thử nghiệm IMViC

Hình 5: Kết quả IMViC của Escherichia coli sau 24giờ ủ ở 37°C. (Anne Hanson, University of Maine, Orono)
Ống A: dương tính thử nghiệm indole trên môi trường tryptone. Xuất hiện lớp màu đỏ trên bề mặt môi
trường sau khi nhỏ thuốc thử Kovács.
Ống B: dương tính thử nghiệm methyl red xuất hiện màu đỏ của methyl red.
Ống C: âm tính thử nghiệm Voges-Proskauer biểu hiện qua sự không thay đổi màu sau khi cho thuốc
thử Barritt’s A và Barritt’s B.
Ống D: âm tính thử nghiệm citrate biểu hiện qua sự thay đổi màu sắc và không có khuẩn lạc trong ống
nghiệm.
a. Thử nghiệm Indol (I):
Nguyên tắc: Tryptophan là một acid amin có thể bị oxi hóa bởi một số vi sinh vật
có hệ enzyme tryptophanase tạo nên các sản phẩm chứa gốc indol. Việc phát hiện indol
được thực hiện bằng phản ứng của phân tử này với các thuốc thử chứa p-
Dimethylaminbenzaldehyde (p-DMABA) tạo nên một phức chất dạng quinone có màu
đỏ.
Phương pháp tiến hành: Môi trường sử dụng cho thử nghiệm này là nước
tryptone. Sinh khối chủng thuần được cấy vào môi trường lỏng tryptone, ủ ở nhiệt độ

đỏ methyl red (0.02% trong hỗn hợp cồn nước có tỷ lệ 3:2, bảo
quản ở 4
0
C) vào trong ống nghiệm dịch nuôi cấy, đọc kết quả
ngay.
Đọc kết quả: (+) môi trường có màu đỏ sau khi bổ sung
thuốc thử. (-) khi có màu vàng. Trường hợp màu cam, cần tiếp
tục ủ ống môi trường có giống trong 4 ngày và thực hiện lại
thử nghiệm.
c. Thử nghiệm Voges-Proskauer (VP) (xem mục 3.3, bài 3)
d. Thử nghiệm Citrate (iC)
Nguyên tắc: sự biến dưỡng citrate bởi vi sinh vật sẽ tạo ra CO
2
làm kềm hóa môi
trường. Mặt khác mọi VSV có khả năng sử dụng citrate làm nguồn carbon duy nhất đều
có khả năng dùng muối ammonium làm nguồn đạm duy nhất. Sự phân giải của muối
ammonium dùng làm nguồn đạm trong môi trường sẽ sinh NH
3
làm kiềm hóa môi
trường. Sự gia tăng giá trị pH này được chỉ thị bằng sự đổi màu của chỉ thị pH trong môi
trường.
Hình 6: thử nghiệm Indol
Hình 7: thử nghiệm MR
Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM

Biên soạn: Lê Thùy Linh Page | 10
Homepage: http://lethuylinh.weebly.com

Phương pháp tiến hành: Môi trường sử dụng cho thử nghiệm này là môi trường
lỏng SCA. Dùng que vòng cấy ria một lượng nhỏ khuẩn lạc lên
Hình 8: thử nghiệm Citrate
Hình 9: S. aureus trên BPA