MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài
Đậu xanh (Vigna radiata L.Wilczek) là một trong ba cây đậu đỗ chính
trong nhóm các cây đậu ăn hạt. Đây cũng là cây trồng có vị trí quan trọng
trong nền nông nghiệp của nhiều nước, trong đó có Việt Nam [7], [11].
Trồng đậu xanh không những cung cấp nguồn thực phẩm giàu đạm,
đáp ứng nhu cầu về dinh dưỡng của con người và vật nuôi mà còn có tác dụng
cải tạo và bồi dưỡng đất, do rễ cây đậu xanh có các nốt sần chứa vi sinh vật cố
định đạm sống cộng sinh [4], [5].
Hiện nay, các giống đậu xanh trồng ở Việt Nam chủ yếu là các giống có
khả năng chịu hạn kém và thường bị nhiễm một số bệnh như: sâu keo, sâu xanh…
Trong những năm gần đây, có một số công trình nghiên cứu về đậu
xanh đã tiếp cận phân tích các đại phân tử protein và DNA như: nghiên cứu
tính đa hình protein của các giống đậu xanh địa phương bằng kỹ thuật phân
tích thành phần điện di protein dự trữ trong hạt, nghiên cứu hiện tượng đa
dạng DNA được nhân bản ngẫu nhiên [6], [10], [17]. Một số nghiên cứu về
khả năng chịu hạn đã được tiến hành trên một số loại cây trồng như đậu
tương, ngô, lúa… [1], [2], [9]. Các nghiên cứu đều thống nhất rằng đặc tính
chịu hạn của cây trồng rất phức tạp do nhiều gen quy định, trong đó có gen
LTP (Lipid Transfer Protein).
LTP là gen liên quan đến sinh tổng hợp lớp biểu bì. Khi gặp stress hạn,
LTP kích thích tăng tổng hợp ngoại bì làm thực vật có thể giảm mất nước nhờ
tăng độ dày của lớp vỏ ngoài [36]. Tuy nhiên, các nghiên cứu về mối liên quan
giữa đặc điểm sinh lí, hoá sinh và sinh học phân tử của gen LTP với khả năng
chịu hạn của cây đậu xanh còn hạn chế.
Xuất phát từ những cơ sở trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài:
“Đánh giá chất lượng hạt và nghiên cứu đặc điểm cấu trúc gen LTP ở
đậu xanh (Vigna radiata L.Wilczek)” nhằm phục vụ việc thiết kế vector
chuyển gen mang gen LTP góp phần tạo cây đậu xanh chịu hạn.
1
2. Mục tiêu nghiên cứu

Phân loại khoa học của cây đậu xanh:
- Giới (regnum): Plantae
- Ngành (division): Magnolyophita
- Lớp (class): Magnolyopsida
- Bộ (order): Fabales
- Họ (Familia): Fabaceae
- Chi (genus): Vigna
- Loài (species): V. radiata
Chi Vigna là một trong những chi lớn trong họ Đậu, bao gồm khoảng
150 loài thuộc 7 chi phụ là Vigna; Plectotropis; Ceratotropis; Lasionspron;
Sigmoidotropis; Haydonia; Macrohynchus, trong đó đậu xanh là một trong số
16 loài của phân chi Ceratotropis [5].
1.1.2. Đặc điểm nông sinh học của cây đậu xanh
Cây đậu xanh thuộc loại cây thân thảo, là loại cây trồng cạn thu quả và
hạt bao gồm các bộ phận rễ, thân, lá, hoa, quả, hạt.
 Đặc điểm của rễ
Hệ rễ đậu xanh thuộc loại rễ cọc bao gồm rễ chính và các rễ phụ. Rễ
chính thường ăn sâu khoảng 20 - 30 cm, trong điều kiện thuận lợi có thể ăn
sâu tới 70 - 100 cm. Rễ phụ thường gồm 30 - 40 cái, dài khoảng 20 - 25 cm.
3
Trên rễ phụ có nhiều lông hút do biểu bì rễ biển đổi thành, có vai trò
tăng cường sức hút nước và các chất dinh dưỡng cho cây. Tuy nhiên, bộ rễ
của cây đậu xanh yếu hơn nhiều so với các cây đậu đỗ khác nên khả năng
chịu hạn và chịu úng của cây đậu xanh tương đối kém. Nếu bộ rễ phát triển
tốt thì bộ lá xanh lâu, cây ra nhiều hoa, quả, hạt mẩy. Ngược lại, bộ rễ phát
triển kém thì cây sẽ chóng tàn, các đợt ra hoa sau sẽ khó đậu quả hoặc quả sẽ
bị lép [7], [11]. Trên rễ cây họ Đậu có nhiều nốt sần chứa vi khuẩn cổ định
đạm Rhizobium. Các nốt sần trên rễ bắt đầu hình thành khi cây có 2 - 3 lá thật
và đạt tối đa khi cây ra hoa rộ. Trên mỗi cây có khoảng 10 - 20 nốt sần, tập
trung chủ yếu ở cổ rễ. Kích thước của các nốt sần không giống nhau, đường

2
đất) có ảnh hưởng lớn đến hiệu suất quang hợp và năng suất thu hoạch.
Số lượng lá, kích thước, hình dạng và chỉ số diện tích lá thay đổi tuỳ thuộc
vào giống, đất trồng và thời vụ [5], [11].
 Đặc điểm của hoa
Hoa đậu xanh là loại hoa lưỡng tính, tự thụ phấn, mọc thành chùm to,
xếp xen kẽ nhau ở trên cuống. Các chùm hoa chỉ phát sinh ra từ các mắt thứ
ba ở trên thân, nhiều nhất là ở mắt thứ tư, còn ở các cành thì tất cả các mắt
đều có khả năng ra hoa. Thường sau khi cây mọc 18 - 20 ngày thì mầm hoa
hình thành , sau 35 - 40 ngày thì nở hoa. Trong một chùm hoa, từ khi hoa đầu
tiên nở đến hoa cuối cùng kéo dài 10 - 15 ngày. Mỗi chùm hoa dài từ 2 - 10
cm và có từ 10 - 125 hoa. Khi mới hình thành hoa có hình cánh bướm, màu
xanh tím, khi nở cánh hoa có màu vàng nhạt [11]. Hoa đậu xanh thường nở
rải rác, các hoa ở thân nở trước, các hoa ở cành nở sau, chậm hơn, có khi còn
chậm hơn các chùm hoa cuối cùng ở ngọn cây. Trên cùng một cành, các chùm
hoa cũng nở chênh lệch nhau có khi đến 10 - 15 ngày. Trong một chùm hoa
cũng vậy, từ khi hoa đầu tiên nở đến hoa cuối cùng có thể chênh 10 - 15 ngày.
Hoa nở được 24h là tàn, sau khi nở hoa và thụ tinh khoảng 20 ngày là quả
chín. Số lượng hoa dao động rất lớn, từ 30 đến 280 hoa trên một cây. Công
thức hoa là: K5C5A10G1. Thời gian nở hoa có thể chia thành 3 nhóm:
- Nhóm ra hoa tập trung: Hoa nở kéo dài < 16 ngày.
- Nhóm ra hoa không tập trung: Hoa nở liên tiếp > 30 ngày.
5
- Nhóm ra hoa trung gian: Hoa nở từ 16 đến 30 ngày.
 Đặc điểm của quả
Quả đậu xanh thuộc loại quả giáp, có dạng hình trụ, dạng tròn hoặc
dạng dẹt với đường kính 4 - 6 mm, dài 8 - 14 cm, dài khoảng 8 - 10 cm, có 2
gân nổi rõ dọc hai bên quả, đa số là quả thẳng, có một số hơi cong, khi còn
non quả có màu xanh, khi chín vỏ quả có màu nâu vàng hoặc xám đen, đen...
gặp nắng rễ bị tách vỏ. Một cây trung bình có khoảng 20 - 30 quả, mỗi quả có

Có 2 giai đoạn sinh trưởng và phát triển chủ yếu ở đậu xanh:
- Các giai đoạn sinh trưởng sinh dưỡng (SD)
- Các giai đoạn sinh trưởng sinh thực (ST)
Bảng 1.1. Các giai đoạn sinh trưởng và phát triển của cây đậu xanh
Sinh trưởng sinh dưỡng Sinh trưởng sinh thực
Ký hiệu Thể hiện bên ngoài Ký hiệu Thể hiện bên ngoài
SD
m
Hạt nảy mầm ST
1
Cây bắt đầu ra hoa
SD
l
Lá mầm xuất hiện ST
2
Hoa phát triển đầy đủ
SD
1
Hình thành đốt thứ nhất ST
3
Bắt đầu hình thành quả
SD
2
Hình thành đốt thứ hai ST
4
Quả phát triển đầy đủ
SD
3
Hình thành đốt thứ ba ST
5

cuống lá ngắn nhất. Các lá thật trên thân đều có 3 lá chét, mọc cách trên thân
chính với cuống lá dài [5], [11].
1.1.4. Đặc điểm hoá sinh của hạt đậu xanh
Hạt đậu xanh chứa 23 - 28% protein, 1,3% lipid, 56 - 60% glucid, 12%
nước, các vitamin B1, B2, C… các muối khoáng như Ca, Na, Fe, K … [11].
Đối với cây trồng thu hạt nói chung và cây đậu xanh nói riêng, đánh giá
chất lượng hạt được thực hiện bằng những phân tích thành phần hoá sinh
trong hạt như: hàm lượng protein, lipid, đường, thành phần amino acid, hàm
lượng và hoạt độ của các enzyme trong hạt ở giai đoạn nảy mầm... Trong đó,
hai thành phần quan trọng có ảnh hưởng lớn đến sự nảy mầm của hạt và sự
phát triển của cây là protein và lipid.
1.1.4.1. Protein
Protein thực vật nói chung và protein đậu xanh nói riêng là nguồn
cung cấp đạm dễ tiêu hoá cho con người và một số vật nuôi. Trong hạt đậu
xanh, các phân tử protein chiếm khoảng 23 - 28% và được chia thành hai
nhóm: nhóm protein đơn giản và nhóm protein phức tạp. Trong nhóm protein
đơn giản chủ yếu là globulin, chiếm từ 60 - 80%, còn lại là albumin và một số
loại khác. Chức năng chính của protein dự trữ là cung cấp amino acid và nitơ
cho quá trình nảy mầm của hạt [11]. Protein đậu xanh có chứa đầy đủ các tính
chất chung nhất của protein. Ngoài ra, protein đậu xanh còn có một số tính
chất riêng biệt như khả năng hút nước và dầu tạo nhũ tương, khả năng hoà tan
8
trong nước. Đó là một trong những yếu tố quan trọng trong nghiên cứu và
công nghệ sản xuất các sản phẩm từ đậu xanh.
Protein đậu xanh được đánh giá là có chất lượng tốt do có chứa đầy đủ
các amino acid không thay thế và hàm lượng của chúng tương đối trùng với
tiêu chuẩn dinh dưỡng dành cho trẻ em do tổ chức nông lương thế giới (FAO)
và tổ chức y tế thế giới (WHO) đưa ra [20].
1.1.4.2. Lipid
Lipid là những hợp chất hữu cơ có trong tế bào sống, không hoà tan

1.1.6.1. Tình hình nghiên cứu chọn tạo giống đậu xanh trên thế giới
Hiện nay, công tác chọn tạo giống đậu xanh trên thế giới được tiến
hành theo một số hướng chính sau: tạo giống cho năng suất cao, tạo giống
nâng cao chất lượng, tạo giống có khả năng chống chịu tốt, tạo giống có khả
năng kháng sâu, bệnh hại [1], [10].
Để tạo các giống đậu xanh có khả năng chống chịu tốt với điều kiện
ngoại cảnh bất lợi, các nhà khoa học đã tập trung vào nghiên cứu các đặc
điểm sinh lý, sinh hoá và các gen liên quan đến khả năng chống chịu của cây
đậu xanh.
Nghiên cứu về khả năng chịu hạn, cơ chế chịu hạn và phân lập gen
liên quan đến tính chịu hạn của cây đậu xanh cũng được nhiều nhà khoa học
trên thế giới quan tâm nhằm chọn tạo ra các giống đậu xanh có khả năng
chịu hạn tốt.
Liu K.H. và cs (2003) đã phân lập và đọc trình tự gen LTP ở đậu xanh,
đặt tên là Vrltp1 và Vrltp2 [41].
Pandurangam V. và cs (2006) đã nghiên cứu biểu hiện gen Rubisco ở
đậu xanh [47].
Chen Y.J. và cs (2004) đã tiến hành phân lập ba gen Hsc70 ở đậu xanh
là VrHsc70 - 1, VrHsc70 - 2, VrHsc70 - 3 nhằm nghiên cứu cơ chế và chọn
tạo giống đậu xanh có khả năng chịu hạn, chịu nóng [28].
10
Kim Y. J. và cs (2003) đã phân lập và đọc trình tự gen PLC3 với chiều
dài của gen là 5213 nucleotide, vùng mã hoá gồm 1776 nucleotide mã hoá
cho 591 amino acid, có khối lượng phân tử 67,4 kDa [40].
Kang S. J. và cs (2002) đã phân lập gen cystatin ở đậu xanh với mã số
AF454396 trên Ngân hàng gen quốc tế [37].
Gần đây, nhiều nhà khoa học cũng bàn luận về mối liên quan giữa
cystatin với hạn, lạnh, muối, sự già và bảo vệ thực vật, chống côn trùng, vi
sinh vật gây bệnh.
Malgorzata G. và cs (2004) đã tiến hành phân lập gen mã hoá cystatin ở

Chu Hoàng Mậu (2001), bằng phương pháp gây đột biến thực nghiệm
đã tạo được 2 dòng đậu xanh MX1103 và TX16012 có năng suất cao, ổn định
và có khả năng chịu hạn tốt [15].
Chu Hoàng Mậu (2001) đã tiến hành nghiên cứu hàm lượng protein,
thành phần và hàm lượng các amino acid trong hạt các giống đậu xanh đột
biến và giống gốc để đánh giá chất lượng hạt của các giống đậu xanh. Kết quả
cho thấy hạt của giống đậu xanh đột biến MX103 có hàm lượng protein là
20,58%, cao hơn so với các giống còn lại, hàm lượng amino acid của các
giống đậu xanh đột biến cũng cao hơn các giống đối chứng [16].
Nguyễn Vũ Thanh Thanh (2003) đã nghiên cứu một số chỉ tiêu hoá
sinh của 9 giống đậu xanh do Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam cung
cấp. Kết quả cho thấy hàm lượng protein của các giống này dao động trong
khoảng 20,72% - 26,86% [17].
Cùng với việc áp dụng kỹ thuật sinh học phân tử vào nghiên cứu đậu
xanh của các nước trên thế giới, ở Việt Nam bước đầu cũng có nhiều ứng
dụng và đã thu được những kết quả khá quan trọng. Các nhà khoa học đã
thành công trong việc phân lập các gen liên quan đến khả năng chống chịu
12
như gen chịu hạn, chịu nóng, chịu muối... và đánh giá quan hệ di truyền của
một số giống đậu xanh.
Điêu Thị Mai Hoa, Lê Trần Bình (2005) đã nghiên cứu tính đa dạng di
truyền của 57 giống đậu xanh bằng kỹ thuật RADP [6].
Nguyễn Vũ Thanh Thanh (2006) đã phân lập và đọc trình tự gen PLC3
(Phospholipase C3) có liên quan đến khả năng chịu hạn của hai giống đậu
xanh KP11 và MN93. Gen có chiều dài 4215 nucleotide gồm 8 đoạn intron và
9 đoạn exon, vùng exon gồm 1776 nucleotide mã hoá 591 amino acid [18].
Nguyễn Thị Thu Trang (2008) đã phân lập gen cystatin có khả năng
chịu hạn ở 2 giống đậu xanh là DX208 và PAEC3 [21].
1.1.6.3. Tình hình sản xuất đậu xanh trên thế giới
Tình hình sản xuất đậu xanh trên thế giới ngày một tăng. Đặc biệt, trong

Năm
2008
Diện tích (ha) 940188 938893 943149 938112 985679
Sản lượng (tấn) 6551886 6578870 6816377 6752646 6818948
Năng suất (kg/ha) 6968,6 7007 7227,2 7198,1 6918
Nguồn: FAOSTAT, 2008.
1.1.6.4. Tình hình sản xuất đậu xanh ở Việt Nam
Ở Việt Nam, cây đậu xanh cũng được trồng từ lâu đời ở các vùng đồng
bằng, trung du và miền núi trên khắp cả nước. Tuy nhiên, nó vẫn chỉ được xem
như một loại cây trồng phụ nhằm tận dụng đất đai, lao động dư thừa... Vì thế,
năng suất sản xuất đậu xanh còn chưa cao. Từ năm 1991 - 1995 năng suất sản
xuất đậu xanh bình quân đạt khoảng 5,5 - 12 tạ/ha. Từ 1996 - 2000 năng suất
dao động trong khoảng 15 - 20 tạ/ha. Đến năm 2000, Việt Nam có diện tích và
sản lượng đậu xanh đứng thứ 6 trên thế giới [9].
Đậu xanh của nước ta sản xuất ra chủ yếu để đáp ứng nhu cầu tiêu dùng
trong nước như làm rau, làm bánh.... Các sản phẩm làm từ đậu xanh rất phong
phú, nhưng hiện nay chỉ có một số ít sản phẩm có chất lượng ổn định và có
thương hiệu lâu năm trên thị trường [20].
Đậu xanh phân bố chủ yếu ở các vùng:
- Vùng núi phía Bắc: Tập trung ở các tỉnh Sơn La, Lai Châu, Hòa Bình.
Năng suất trung bình đạt 600 kg/ha.
- Vùng đồng bằng và trung du Bắc Bộ: Năng suất trung bình dao động
800 - 1000 kg/ha.
- Vùng duyên hải Trung Bộ và Tây Nguyên: Là vùng sản suất đậu xanh
lớn về diện tích và sản lượng. Nhưng do ảnh hưởng của thời tiết nên cũng thất
thu nhiều về năng suất và sản lượng.
14
- Vùng Đông Nam Bộ: Là vùng sản xuất đậu xanh quy mô lớn chiếm
26% diện tích gieo trồng cả nước, năng suất bình quân còn thấp đạt khoảng
500 kg/ha do sử dụng giống đậu xanh cũ, khả năng chống chịu kém [5].

hạn không khí. Nếu hạn đất kết hợp với hạn không khí thì mức độ tác hại đối
với cây còn tăng lên nhiều.
1.2.1.2. Tác hại của hạn đối với cơ thể thực vật
• Hệ thống keo nguyên sinh chất bị thay đổi mạnh:
- Thay đổi các tính chất lý hoá của chất nguyên sinh: tăng độ nhớt chất
nguyên sinh làm chậm các hoạt động sống, giảm mức độ phân tán, khả năng
thuỷ hoá và tính đàn hồi của keo nguyên sinh chất…
- Thay đổi đặc tính hoá keo từ trạng thái sol rất linh động thuận lợi cho
các hoạt động sống sang trạng thái coaxecva hoặc gel kém linh động, cản trở
các hoạt động sống.
• Quá trình trao đổi chất lúc thiếu nước sẽ bị đảo lộn từ hoạt động tổng
hợp là chủ yếu khi đủ nước chuyển sang hướng phân giải khi thiếu nước. Quá
trình phân giải quan trọng nhất là phân giải protein và axit nucleic, kết quả là
giải phóng và tích lũy NH
3
gây độc cho cây và có thể làm cây chết.
• Hoạt động sinh lý bị kìm hãm
- Thiếu nước sẽ ức chế hoạt động quang hợp. Do khí khổng đóng nên
thiếu CO
2
, lục lạp có thể bị phân huỷ, ức chế tổng hợp diệp lục, lá bị héo và
khô chết, diện tích quang hợp giảm, sự vận chuyển các sản phẩm quang hợp
ra khỏi lá và về cơ quan dự trữ bị tắc nghẽn.
- Thiếu nước ban đầu sẽ làm tăng hô hấp, về sau giảm hô hấp nhanh, hiệu
quả sử dụng năng lượng của hô hấp rất thấp vì hô hấp sản sinh nhiệt là chính.
- Hạn làm mất cân bằng nước trong cây: lượng nước thoát ra lớn hơn
lượng nước hấp thu vào cây làm cho cây bị héo.
- Dòng vận chuyển vật chất trong cây bị ức chế rất mạnh: sự hút chất
khoáng giảm do tốc độ dòng thoát hơi nước giảm. Thiếu nước kìm hãm tốc độ
vận chuyển chất đồng hoá về các cơ quan dự trữ và có thể có hiện tượng

sâu; giảm diện tích lá; rút ngắn chu kỳ sống…[18].
17
Theo các nhà khoa học, tính chống chịu của đậu xanh nói riêng và tính
chống chịu của thực vật nói chung rất phức tạp liên quan đến đặc điểm sinh lý
hoá sinh và do nhiều gen quy định. Đã có nhiều cơ chế phân tử liên quan đến
tính chịu hạn ở thực vật đã được biết đến như: vai trò của bộ rễ, khả năng điều
chỉnh áp suất thẩm thấu, abscisic acid (ABA), aquaporin, các nhân tố ức chế
protease, các gen điều khiển phiên mã và các gen chức năng (HSP, LEA,
LTP, PLC...) [10].
Vai trò của bộ rễ: khả năng nhận nước của cây phụ thuộc vào bộ rễ.
Nhiều nghiên cứu cho thấy cây nào có bộ rễ dài, khoẻ, mập thì có khả năng
hút nước ở những tầng đất sâu, vì vậy cây nào có bộ rễ dài sẽ có khả năng lấy
được nhiều nước. Ở cây đậu xanh, hình thái rễ rất đa dạng. Các giống đậu
xanh địa phương thường có bộ rễ dài hơn các giống khác.
Khả năng điều chỉnh áp suất thẩm thấu là một đặc tính của tế bào khi bị
mất nước do hạn, nóng, lạnh... Trong điều kiện hạn, áp suất thẩm thấu tăng
lên giúp rễ cây nhận được một lượng nước rất nhỏ còn lại trong đất. Các chất
và các gen tương ứng có khả năng tạo áp suất thẩm thấu cao trong tế bào để
cạnh tranh nước với môi trường xung quanh bao gồm: ion K
+
; các amino acid
như prolin, estonine; các chất đường như sucarose, fructant, manitol, pinitol
và các chất khác như glycine betain, β- alanin betain. Các chất này có khả
năng điều chỉnh áp suất thẩm thấu nhờ khả năng hút nước và giữ nước vào tế
bào hoặc ngăn chặn sự xâm nhập của ion Na
+
[19].
Abscisic acid (ABA) là hormone thực vật liên quan đến sự điều chỉnh
sinh lý, sinh trưởng và phát triển đáp ứng với môi trường của thực vật bậc
cao. ABA chủ yếu được tổng hợp ở rễ cây do phản ứng với stress nhờ gen cis-

ngăn cản hoặc sửa chữa sự phá hủy của stress. Dựa vào khối lượng phân tử
người ta chia HSP ở thực vật thành 6 nhóm khác nhau: HSP 8.5, 20, 60, 70,
90, 110kDa. Trong nhóm HSP có rất nhiều đại diện của chất môi giới phân tử
(MGPT) (HSP70, HSP60) nhưng cũng có những HSP không phải là môi giới
phân tử, ví dụ HSP 8,5 kDa (Ubiquitin).
Các MGPT là yếu tố chìa khóa tham gia nội cân bằng tế bào trong các
điều kiện sinh trưởng cực thuận và đối lập. Chức năng chính của MGPT là
19
tham gia tạo cấu trúc không gian đúng cho protein mới được tổng hợp,
chuyển protein qua màng, duy trì cấu trúc đặc hiệu của protein, ngăn chặn sự
hủy hoại protein chưa tạo cấu trúc không gian, khởi đầu cho sự phân hủy
protein biến tính [10]. MGPT có 5 họ chính là: HSP 70 (Dnak), HSP 60
(Chaperonin), HSP 90, HSP 100 và sHSP (small HSP) trong đó có hai họ môi
giới phân tử được nghiên cứu nhiều nhất là chaperonin và HSP70. HSP70 đã
được phân lập ở đậu xanh [28].
Protein LEA cũng được chú ý trong điều kiện thực vật bị stress do thiếu
nước [32], [50], [58], [59]. Protein LEA được phân chia thành 5 nhóm chính
trên cơ sở chuỗi trình tự amino acid của nó: nhóm 1-D19, nhóm 2-D11
(dehydrin), nhóm 3-D7, nhóm 4-D113, nhóm 5-D29 [30]. Protein LEA thực
hiện các chức năng như: cô lập ion, bảo vệ protein màng tế bào, phân hủy
protein biến tính, điều chỉnh áp suất thẩm thấu. Nó không những chỉ được
phát hiện trong hạt mà còn trong các mô tăng trưởng khi cây bị stress do thiếu
nước, do mặn, và do lạnh. Sự biểu hiện của protein LEA và đặc điểm cấu trúc
đại phân tử của nó cho thấy nó có vai trò trong bảo vệ cây trồng chống chịu
sự mất nước [57]. Protein LEA được tạo ra hàng loạt trong giai đoạn muộn
của quá trình hình thành phôi.
Gen PLC liên quan đến sự huy động canxi. Canxi hoà tan được xem
như chất truyền tín hiệu thứ cấp truyền đến ngoại bào kích thích các tế bào có
phản ứng bảo vệ. Sự truyền tín hiệu canxi trong suốt stress hạn và muối đã
được nghiên cứu nhiều ở thực vật bậc cao [40].

1.2.3.2. Gen LTP
LTP thuộc họ gen pathogenesis relate, có khả năng tổng hợp ra protein
thúc đẩy quá trình vận chuyển phospholipid giữa các màng. Vai trò của LTP
là tham gia vào cấu tạo cutin, phản ứng bảo vệ chống bệnh của cây và đáp
ứng sự thích nghi biến đổi của môi trường [25], [29], [35].
Khi gặp các điều kiện cực đoan của môi trường, các nhân tố như
hormone, các quá trình trao đổi ion, các con đường truyền tín hiệu… sẽ điều
khiển gen LTP hoạt động và tổng hợp nên các sản phẩm protein tương ứng
21
nhằm giúp cho cây tăng khả năng chống chịu stress, chịu bệnh… Những phân
tử protein này thường bao gồm nhiều đặc điểm chung như: điểm đẳng điện
cao, khối lượng phân tử khoảng 9,12 kDa và sự có mặt của 8 phân tử cystein
làm nhiệm vụ tạo ra 4 cầu nối disulfide [36].
LTP đã được chứng minh trong việc ngăn chặn nguồn gây bệnh như:
Pseudomonas solanacearum, Clavibacter michiganasis, Fuarium solani,
Rhizoctonia solani, Trichodelmar viride và Cercospora beticola [36], [45].
Trong những năm gần đây, gen LTP đã được nghiên cứu ở một số thực vật
như: Arabidopsis thaniana L. [22], Paphanus sativus L. [53], Zea mays L. [49],
[51], Capsicum annuum [55], Vigna radiata L. [41], Triticum L. [44], Daucus
carota L. [52], Nicotiana tabacum L. [43], [48], Oryza sativa L. [56], Valencia
orange [60], Lycopesium esculentum [54].
LTP có khả năng xúc tác tới sự vận chuyển phospholipid giữa các lớp
màng của tế bào. LTP có thể hỗ trợ việc tạo ra các lớp sáp hoặc lớp biểu bì
giúp thực vật bảo vệ, phản ứng và đáp ứng lại những thay đổi của môi trường
[23], [25].
Hiện nay, LTP ở thực vật được biết có 4 nhóm lớn:
- Nhóm I: Bao gồm các CsLTP chứa các bộ mã hoá protein
đã được cô lập và biểu hiện ở trong quả.
- Nhóm II: Bao gồm những gen LTP tổng hợp ra protein được
biểu hiện trong hạt.

3 VN 99-3 Do Viện NC Ngô lai tạo giữa giống VN 93-1 với Vigna mungo
4 044/ĐX06 Do Viện NC Ngô lai tạo giữa giống ĐX 044 với ĐX 06
5 TN Đồng Hỷ - Thái Nguyên
6 LS Bắc Sơn - Lạng Sơn
7 HN 1 Ba Vì - Hà Nội
8 HN 2 Mỹ Đức - Hà Nội
9 BG 1 Việt Yên - Bắc Giang
10 BG 2 Yên Dũng - Bắc Giang
11 BG 3 Sơn Động - Bắc Giang
12 HG 1 Bắc Quang - Hà Giang
13 HG 2 Hoàng Su Thùy - Hà Giang
24
Hình 2.1. Hạt của các giống đậu xanh nghiên cứu
2.2. HOÁ CHẤT, THIẾT BỊ, ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU
Các loại hóa chất: các hoá chất phục vụ nghiên cứu phân lập gen do các
hãng Invitrogen, Fermentas, Bioneer cung cấp.
Các loại thiết bị máy móc: các thiết bị máy móc phục vụ sinh học phân
tử như máy PCR, máy li tâm, máy soi gel, bộ điện di, box cấy, máy lắc, lò vi
sóng, cân điện tử, tủ sấy, tủ lạnh, bể ổn nhiệt, máy xác định trình tự nucleotide
tự động, pipetman, máy làm khô DNA (Speed Vac) và một số thiết bị, máy
móc cần thiết khác.
Địa điểm nghiên cứu: Các thí nghiệm được tiến hành tại Bộ môn Sinh
học phân tử và Công nghệ gen - Viện Khoa học Sự sống - Đại học Thái
Nguyên; Phòng thí nghiệm Di truyền và Sinh học hiện đại - Khoa Sinh - Kỹ
thuật Nông nghiệp - Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên và
Phòng Miễn Dịch học - Viện Công nghệ Sinh học - Viện Khoa học và Công
nghệ Việt Nam.
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
25
VN 99-3 LS 044/ĐX06