Ứng dụng các kỹ thuật array trong lĩnh vực môi trường
Nguyễn Xuân Hưng
MỤC LỤC
Mở đầu
PHẦN I_ KỸ THUẬT DNA ARRAY

1. Lịch sử ra đời

2. Kỹ thuật DNA array

2.1 Cấu trúc và chức năng của DNA array
2.2 Quá trình thực hiện DNA array
2.2.1 Chế tạo mảng
2.2.2 Tiến hành thí nghiệm

3. Các vấn đề tồn tại trong kỹ thuật DNA array khi áp dụng trong lĩnh vực môi trường
PHẦN II_ KHẢ NĂNG PHÁT TRIỂN KỸ THUẬT DNA ARRAY TRONG QUẢN LÝ
MÔI TRƯỜNG
1. Các cải tiến loại một

1.1 Cải tiến mẫu dò
1.2 Cải tiến mảng

2. Các cải tiến loại hai
2.1 PNA array
2.2 Nanowire array
2.3 Peptide array
2.4 Glycan array
2.5 Array hoá học (Chemical array)
2.6 Protein array


mẫu dò lên giá thể giúp tăng tốc độ quá trình, giảm sai sót chắc chắn mắc phải khi thực hiện
những thủ tục có tính lặp lại cao bằng tay, và tăng tính chính xác vị trí. [1]
Tất cả các thí nghiệm tiên phong ở trên là cơ sở của kỹ thuật array hiện nay. Kỹ thuật này phát
triển đến mức chỉ vài năm nữa có thể so sánh nó với kỹ thuật PCR không thể thiếu trong sinh
học hiện nay.
2. Kỹ thuật DNA array
2. Kỹ thuật DNA array

DNA microarray đầu tiên được thiết kế khám phá các loại thuốc
mới [2], phân tích biểu hiện gen [3], tái giải trình tự DNA [4]. Kỹ
thuật này mới được ứng dụng trong lĩnh vực vi sinh môi trường
trong vài năm gần đây [5] nhưng đã cho thấy những tiềm năng
vô cùng to lớn trong phân tích quần xã vi sinh vật, xác định sinh
vật gây bệnh cũng như kiểm soát các quá trình trong cả khoa học
cơ bản và khoa học ứng dụng về môi trường [6].
2.1 Cấu trúc và chức năng của DNA array
Trong kỹ thuật DNA array, người ta cố định các axit nucleic có trình tự xác định (mẫu dò) trên
giá thể (mảng) thích hợp theo thứ tự. Axit nucleic cần nghiên cứu (đích) được đánh dấu sau đó
lai với mẫu dò trên mảng. Ở những điều kiện lý tưởng, các axit nucleic có trình tự bổ sung bắt
cặp chính xác với nhau. Hơn nữa dưới các điều kiện này, cường độ phát hiện tín hiệu tỷ lệ trực
tiếp với lượng mẫu dò nên có thể định lượng các loại axit nucleic trong mẫu ban đầu [7].
Đường kính chấm (mỗi chấm đại diện cho một loại mẫu dò) trên macroarray thường ≥ 300 µm
và có thể được hiện hình bằng kỹ thuật gel thông thường hoặc máy quét dùng trong những kỹ
thuật blot trước đây. Ngược lại, các chấm trên microarray thường có đường kính 200 µm và cần
thiết bị hiện ảnh đặc biệt như máy quét laser tiêu điểm (confocal laser scanner) [8; 9]. Các
phương pháp mới đây có thể tạo ra đường kính chấm 100 µm và nếu dùng phương pháp in
quang hoạt (photolitho-graphy) để tổng hợp mẫu dò oligonucleotide in situ thì có thể tạo ra
chấm có đường kính 20 µm [8].
Microarray mật độ thấp


silicon [1], trong đó thuỷ tinh thường được dùng nhất [11]. Giá thể thường được biến đổi hoá
học để dễ dàng gắn với mẫu dò. Trong trường hợp cơ chất thuỷ tinh, người ta phủ lên đó
polymerase-lysine, amino silance hoặc silance có gốc amin hoạt hoá [3] để tăng tính kỵ nước và
khả năng bám dính của mẫu dò [12].
Thành phần thứ hai của mảng là mẫu dò. Mẫu dò để gắn trên mảng cần được lựa chọn kỹ theo
đích sử dụng. Hiện đã có nhiều phần mềm cũng như cơ sở dữ liệu giúp đơn giản hoá công đoạn
này. Tuỳ mục đích sử dụng, mẫu dò có thể là oligonucleotide ngắn (15-25 nucleotide),
oligonucleotide dài (50-120 nucleotide) hoặc cDNA (dài 100-3000 bp) [11].
Sau khi chọn được mẫu dò, gắn (hay còn gọi là in) chúng trên bề mặt mảng bằng hai cách: (i)
cố định (cDNA) (ii) tổng hợp in situ (oligonucleotide). Cách thứ nhất thường sử dụng robot với
các kỹ thuật in kim (contact-tip deposition printing), in vi tiếp xúc (micro-contact printing
(µCP)), in vi kênh (micro-fluidics networks (µFN)) và in mạ (electro capture) để đặt mẫu dò đã
tổng hợp từ trước lên mảng. Kỹ thuật in quang hoạt (photolithographic) được dùng cho các ứng
dụng cách hai. Ngoài ra, in áp điện (piezoelectric printing) và in vi lỏng (micro wet printing
(µWP)) có thể sử dụng cho cả cố định và tổng hợp in situ [7].
In kim (Contact-tip deposition printing)
Kỹ thuật này có giá trị thương mại vào năm 1997 bởi công ty Synteni, được nhiều nhóm nghiên
cứu sử dụng để chế tự tạo mảng DNA. Đầu tiên người ta hoà tan axit nucleic sau đó nhúng kim
nhọn vào để lấy ra một lượng dung dịch xác định tại đầu của nó. Sau đó gắn dung dịch này lên
bề mặt của cơ chất (Hình 2). Trong thực nghiệm, dùng nhiều đầu kim cùng lúc [13].
▲Hình 2: Sản xuất DNA microarray sử dụng contact tip deposition printing [Theo 7].
Trong hầu hết các trường hợp, kim nhọn có rãnh giống như bút mực để giữ dung dịch. Phương
pháp này có thể tạo ra các mảng mật độ cao chứa khoảng 10.000 cDNA khác nhau có kích
thước từ 500 đến 5.000 base trên bề mặt thuỷ tinh 3,6 cm
2
[7].
In vi tiếp xúc (µCP- Micro-contact printing)
Phương pháp µCP có nguyên lý tương tự in kim. Trong đó, dùng “con dấu” polydimethysilane
(PDMS) để chuyển axit nucleic lên bề mặt giá thể (Hình 3). Trên thực tế, kỹ thuật này không
sản xuất thành công các mảng mật độ cao [7].

nguồn điện. Khi có dòng điện sẽ xuất hiện các đường sáng chạy giữa điện cực ngoại biên và
điện cực nhỏ hơn ở trung tâm. (B) Mặt cắt vùng điện cực trong trung tâm. Vùng này chứa điện
cực đường kính 160 µm tại bốn góc và 25 điện cực khác xếp thành hình vuông. (C) Vùng điện
cực [Theo 7].
In quang hoạt (Photolithography)
Công ty Affymetrix đã phát triển phương pháp in quang hoạt để tổng hợp oligonu-cleotide in
situ trên giá thể rắn [14]. Quá trình này dựa trên các kỹ thuật công nghiệp bán dẫn [15].
Đầu tiên, gắn các phân tử có nhóm bảo vệ dễ phân huỷ bởi tia cực tím trên bề mặt giá thể rắn.
Dùng mặt nạ để hoạt hoá chọn lọc các vị trí trên bề mặt bằng tia cực tím nhằm loại trừ nhóm
bảo vệ nhạy sáng tại đó. Sau đó ủ với các nucleotide để chúng phản ứng với nhóm OH tự do tại
bề mặt những vùng đã hoạt hoá, kết thúc một chu kỳ (Hình 7). Lặp lại chu kỳ trên với mặt nạ
và nucleotide khác sẽ tạo ra một “bãi chông dày đặc các oligonucleotide có trình tự bất kỳ” tại
những vị trí xác định trên cơ chất [14]. Hiện tại, có thể gắn hơn 500.000 oligonucleotide khác
nhau trên diện tích 1,28x1,28 cm ().
In áp điện (Piezoelectric printing)
In áp điện sử dụng công nghệ được phát triển cho các máy in đen trắng để phân phối lượng nhỏ
dung dịch DNA thay vì mực in như bình thường [16]. Đầu áp điện tạo ra các giọt nhỏ trên đầu
phân phối (hình 8). Hiện tại có thể dùng phương pháp này để tạo ra các mảng có trên 10.000
chấm/cm
2
.
Cũng có thể dùng kỹ thuật này để chế tạo các mảng oligonucleotide bằng cách dùng 5 đầu phân
phối áp điện khác nhau (mỗi đầu chứa một loại phân tử phosphoramidite nucleotide cần để tổng
hợp oligonucleotide, đầu thứ năm chứa chất khử trityn hoá, hình 9) [16].
▲Hình 7: Sơ đồ phương pháp in quang hoạt [Theo 16].
▲Hình 8: Sơ đồ ống phun áp điện. Đơn vị sử dụng trong hình.|U|: giá trị tuyệt đối của điện áp
[Theo 7].
▲Hình 9: Tổng hợp oligonucleotide in situ sử dụng ống phân phối áp điện. Thủ tục nhiều ống
phun. DMTr: nhóm phát hiện dimethoxytrityl, DTR: chất khử trityl hoá [Theo 7].
In vi lỏng (µWP - Micro wet printing)

Tiến hành lai
Sau khi đánh dấu, tiến hành lai trên mảng. Do sử dụng chất mang rắn nên phương pháp
microarray dễ tiến hành hơn các phương pháp blot. Trong quá trình lai, cho dung dịch đích đã
đánh dấu đi qua mảng. Ở đó mẫu dò bắt cặp bổ sung (nếu có) với đích. Nếu dùng chất mang
thuỷ tinh, có thể đặt úp một phiến kính thuỷ tinh lên trên sau đó cho dung dịch đích đi qua khe
trống giữa chúng bởi lực mao dẫn [1]. Một cách đơn giản khác là đặt trực tiếp mảng trong bể
nhỏ chứa dung dịch lai. Các điều kiện lai (như nồng độ mẫu, lực ion, nhiệt độ) phụ thuộc lớn
vào kích thước mẫu dò trên mảng và phải được xác định cho từng thí nghiệm [17]. Hiệu quả lai
có thể tăng lên nếu dung dịch lai luôn ở trong trạng thái động so với bề mặt mảng [1].
▲Hình 11: Sơ đồ đánh dấu mẫu dò dùng Cy3/Cy5 [Theo Yu et al., 2002].
Xác định và phân tích tín hiệu lai
Sau khi lai, tiến hành rửa để loại bỏ đích không bắt cặp hoặc bắt cặp không đặc hiệu với mẫu
dò [9]. Tiếp đó dùng thiết bị hiện ảnh xác định tín hiệu lai do chất đánh dấu trên đích phát ra.
Cường độ tín hiệu cho phép đánh giá tương đối hiệu quả bắt cặp giữa đích và mẫu dò (hình 12).
Điều đáng nói ở đây là lượng dữ liệu cần phân tích trong thí nghiệm microarray rất lớn do trên
một mảng có thể đặt hàng chục ngàn mẫu dò, tương ứng với nó là hàng chục ngàn tín hiệu,
trong đó lại có những tín hiệu nhiễu vì nhiều nguyên nhân. Do đó cần có các phần mềm máy
tính để chuẩn hoá dữ liệu, đơn giản hoá quá trình phân tích nhằm đưa ra các kết luận nhanh và
chính xác.
Các bước chung khi tiến hành kỹ thuật microarray là như vậy, nhưng vì có hai loại mảng ứng
với mẫu dò là cDNA và oligonucleotide nên có đôi chút khác nhau khi sử dụng chúng.
▲Hình 12: Hiệu quả lai khác nhau tạo ra các tín hiệu màu khác nhau trên mảng.
Mảng chứa mẫu dò cDNA
Trong hầu hết các thí nghiệm microarray thông thường, mảng được tạo ra từ mẫu dò cDNA có
kích thước tương đối lớn sẽ lai với mRNA từ hai mẫu khác nhau. Mỗi mẫu được đánh dấu một
loại thuốc nhuộm phát huỳnh quang có màu khác nhau (hình 13). Sau khi lai, tỷ lệ tín hiệu phát
huỳnh quang của mỗi chấm sẽ phản ánh mức độ chiếm ưu thế của sản phẩm phiên mã, trực tiếp
nói lên các đáp ứng liên quan tới điều kiện nghiên cứu [18].
Nhược điểm: (i) Tính tái sử dụng kém - mỗi phiến kính là duy nhất, luôn phải có mẫu đối
chứng cho mỗi phiến kính. (ii) Cấu trúc bậc hai của cDNA làm giảm hiệu quả lai hoặc gây ra

▲Hình 15: Sơ đồ nguyên lý hệ thống MM/PM [Theo 14].
3. Các vấn đề tồn tại trong kỹ thuật DNA array khi áp dụng trong lĩnh vực môi trường
3. Các vấn đề tồn tại trong kỹ thuật DNA array khi áp dụng trong lĩnh vực môi trường
Mặc dù microarray ra đời mở ra một kỷ nguyên mới trong rất nhiều lĩnh vực, song khi ứng
dụng trong môi trường nó gặp phải một số vấn đề.
Vấn đề kỹ thuật
Tồn tại cố hữu của phương pháp microarray là các điều kiện lai (nhiệt độ, nồng độ muối…)
không bao giờ tối ưu cho mọi phân tử, dẫn đến hiệu quả lai không đặc hiệu hoặc không hoàn
toàn và kết quả sẽ thiếu chính xác.
Vấn đề quan trọng khi áp dụng kỹ thuật microarray với mẫu môi trường liên quan đến các biến
đổi khác nhau của dấu hiệu lai do mật độ và trình tự khác nhau [24]. Tính đa dạng di truyền rất
lớn trong môi trường tác động đến cả việc chế tạo mảng và giải thích dữ liệu. Tính đa dạng
trình tự gene cấu trúc trong các quần thể liên quan về mặt chức năng (như vi khuẩn cố định
nitơ, khử sulfate hay nitrat hoá) lớn làm khả năng tính toán của máy tính hiện khó đáp ứng nổi,
đặc biệt khi sử dụng các mẫu dò oligonucleotide ngắn [25]. Hơn nữa, hiệu quả của microarray
với các mẫu môi trường khác nhau có tương tự với mẫu chủng đơn hay không là một vấn đề
khó đánh giá [6; 26].
Một điều đặc biệt quan trọng là khi lai cùng lúc hàng trăm hoặc hàng ngàn mẫu dò trên mảng sẽ
làm tăng khả năng lai chéo giữa các trình tự không liên quan [27]. Tín hiệu lai khác nhau phản
ánh khá xác thực độ khác nhau giữa các mẫu tuy nhiên, khi kết quả lai giống nhau không có
nghĩa là những mẫu này giống nhau. Vì có thể tồn tại các trình tự khác biệt nhưng chúng không
được đặt thành mẫu dò trên mảng [24].
Tính nhạy và đặc hiệu cũng là một tham số rất quan trọng khi sử dụng microarray để nghiên
cứu với các mẫu môi trường. Ở đó, sinh khối hay nồng độ đích thấp và nhiều chất ô nhiễm làm
giảm giới hạn phát hiện [6; 26; 25]. Do đó, một số nhà nghiên cứu đã làm giàu mẫu hoặc sử
dụng PCR để thu được đủ đích đã đánh dấu [27]. Điều này chắc chắn làm thay đổi các điều
kiện môi trường in situ và có thể tác động sâu xa tới biểu hiện gene, thành phần quần xã và cản

Trích đoạn Glycan array

---