ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP. HỒ CHÍ MINH

BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI

NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG CÁC KỸ THUẬT DI TRUYỀN
HIỆN ĐẠI TRONG CHẨN ĐOÁN VÀ TIÊN LƯỢNG
MỘT SỐ BỆNH UNG THƯ THƯỜNG GẶP Ở VIỆT NAM

CNĐT : NGUYỄN SÀO TRUNG 8782


nhưng bạch cầu cấp dòng tủy (BCCDT) và bạch cầu mạn dòng tủy (BCMDT)
thường gặp ở người lớn, ngược lại bạch cầu cấ
p dòng lymphô (BCCDL)
thường gặp ở trẻ em, và đó là 3 thể bệnh thường gặp nhất trong nhóm bệnh lý
máu ác tính. Những bất thường nhiễm sắc thể (NST) và các bất thường về gen
2

đặc trưng cho các dạng ung thư máu, có ý nghĩa tiên lượng độc lập, giúp lựa
chọn phác đồ điều trị thích hợp và là một dấu ấn để theo dõi điều trị.

Hiện nay việc chẩn đoán thường quy các bệnh ung thư chủ yếu dựa vào
thăm khám lâm sàng, chẩn đoán hình ảnh, xét nghiệm giải phẫu bệnh. Mặc dù
các kỹ thuật này đảm bảo độ chính xác khá cao, giúp chỉ
định điều trị phù
hợp, nhưng vẫn còn một số hạn chế như sau: (1) Không thể thực hiện ở giai
đoạn sớm, khi các khối u chưa có biểu hiện lâm sàng rõ rệt. (2) Không thể
phát hiện các đột biến gen, đột biến NST, do đó không cho phép xác định bản
chất di truyền của ung thư. (3). Chính vì thế không thể theo dõi, đánh giá hiệu
quả điều trị một cách xác thực.
Ở Việ
t Nam gần đây tại một số khoa/ bệnh viện chuyên khoa ung thư đã
bắt đầu ứng dụng một số kỹ thuật chẩn đoán mới, như chẩn đoán bằng hóa mô
miễn dịch (HMMD), dấu ấn khối u, xét nghiệm NST đồ, ứng dụng kỹ thuật
lai tại chỗ gắn huỳnh quang (FISH). Tuy vậy kết quả chưa ổn định, chưa thể
thực hi
ện thường quy.
Việc ứng dụng các kỹ thuật di truyền tế bào và di truyền phân tử (phân
tích DNA, phân tích biểu hiện gen p53…) giúp giải quyết các nhiệm vụ sau
đây:
- Chuẩn hóa và ứng dụng các kỹ thuật di truyền hiện đại trong chẩn đoán

2. Xác định tỷ lệ biểu hiện tích tụ quá mức protein TP53, Ki67 và EGFR
trong carcinôm tuyến ĐTT bằng phương pháp HMMD và mối liên quan giữa
sự biểu hiện protein TP53, Ki67, EGFR và đột biến gen p53 với các đặc điểm
giải phẫu bệnh của carcinôm tuyến ĐTT.
4

3. Xác định giá trị của các xét nghiệm đột biến gen p53, biểu hiện tích tụ
quá mức protein TP53 và Ki67 và EGFR trong theo dõi đáp ứng điều trị và
tiên lượng carcinôm tuyến ĐTT.
4. Ứng dụng phương pháp gia hệ kết hợp với các kỹ thuật xác định đột
biến gen p53, tăng biểu hiện protein TP53 trong việc tầm soát phát hiện sớm
các trường hợp carcinôm tuyến carcinôm tuyến ĐTT.
Trong carcinôm tuyến vú
1. Xác định đặc điểm về tuổi, bệnh sử gia đình, mô bệnh học theo
WHO.
2. Khảo sát sự biểu hiện gen sinh u HER2 bằng kỹ thuật HMMD và
FISH.
3. Khảo sát sự biểu hiện protein và đột biến gen đè nén u p53 bằng kỹ
thuật HMMD và giải trình tự gen.
4. Khảo sát đột biến gen BRCA1 bằng kỹ thuật giải trình tự gen.
5. Khảo sát sự biểu hiện Ki67 bằng kỹ thuật HMMD.
6. Kh
ảo sát carcinôm tuyến vú có tính gia đình, lập cây gia hệ, tham
vấn di truyền.
Trong bệnh bạch cầu
1. Xác định đặc điểm lâm sàng, huyết học, sinh học và bất thường NST
của nhóm bệnh nhân bệnh bạch cầu để nghiên cứu bao gồm bạch cầu
mạn dòng tủy (BCMDT), bạch cầu cấp dòng tủy (BCCDT) và bạch
cầu cấp lymphô (BCCDL) lúc chẩn đoán.
2. Hoàn chỉnh các kỹ thuật nuôi cấy - phân tích NST, kỹ thuật sinh học

- Ung thư là kết quả của một loạt các đột biến tế bào sinh dưỡng, nhưng
một số ung thư khác có thể di truyền theo kiểu di truyền trội hoặc di truyền
lặn NST thường (carcinôm tuyến ĐTT, ung thư nguyên bào võng mạc…).
- Ngày nay người ta đã xác định được nhiều kiểu đột biến gen, đột biến
NST đặc hiệu hoặc không đặc hiệu cho các loại ung thư. Các tế bào ung th
ư
thường thể hiện tính đa dạng, bất thường về kích thước, hình dạng nhân, số
lượng và cấu trúc NST: các gen được nhân bản hoặc mất đi, NST bị mất, nhân
đôi, hoặc chuyển đoạn với tần xuất cao hơn nhiều so với tế bào bình thường.
7

- Các gen điều hòa bình thường có thể phân chia thành hai nhóm theo tác
dụng của sản phẩm của chúng: (1) kích thích tăng số lượng tế bào và / hoặc
(2) ức chế. Cách thứ nhất là làm cho các gen bị kích thích trở thành siêu hoạt
tính: loại đột biến này trội (chỉ cần một trong hai phiên bản gen thay đổi),
allel bị đột biến gọi là gen sinh ung, allel bình thường gọi là tiền gen sinh
ung. Cách thứ hai làm mất hoạt tính gen ức chế, đột biến lo
ại này thường lặn
(phải mất cả hai phiên bản gen mới làm tế bào thoát khỏi ức chế), gọi là gen
đè nén u.
1.2.Các loại gen liên quan ung thư
Ba loại gen chính có vai trò trong sự hình thành và phát triển của ung thư
là gen sinh ung, gen đè nén u và gen sửa lỗi bắt cặp sai [104], [110], [188].
1.2.1 Tiền gen sinh ung và gen sinh ung
Các tiền gen sinh ung có vai trò kiểm soát sự sinh sản và biệt hóa của tế
bào. Khi một tiền gen sinh ung trở nên hoạt động bất thường, khiến các tế bào
tăng trưởng quá đà thoát khỏi sự kiểm soát của cơ thể tạo ra một clôn tế bào
tăng sinh, lúc này nó được gọi là gen sinh ung. Gen sinh ung hoạt động theo
tính trội, vì vậy chỉ cần đột biến một allel cũng đủ kích hoạt gen sinh ung thư
[104]. Gen RAS trên NST số 12 là một ví dụ

còn có tên là HER-1 hay c-ErbB-1 là thụ thể của yếu tố tăng trưởng biểu bì
nằm trên bề mặt t
ế bào, được kích hoạt khi gắn kết với các ligand đặc hiệu
như yếu tố tăng trưởng biểu bì (EGF) hay yếu tố chuyển dạng tăng trưởng
anpha (TGF-α) [63]. Khi gắn kết với ligand đặc hiệu, EGFR kích hoạt hàng
loạt dòng thác tín hiệu nội bào, dẫn đến hình thành ung thư do kích thích tăng
sản quá mức tế bào u, kích thích quá trình xâm nhập, quá trình sinh mạch và
di căn của tế bào u, làm tế bào không chết theo lập trình (Hình 1.1).
9 Hình 1.1: EGFR và các đường truyền tín hiệu
Các con đường hoạt hóa tín hiệu nội bào đã được biết đến như:
- MAPK - protein kinase hoạt hóa mitogen.
- PI3K/Akt.
- Con đường Phospholipase C (PLC).
- Con đường qua trung gian RAS.
Con đường qua trung gian RAS phức tạp và liên quan đến cơ chế kháng
thuốc kháng EGFR (Gefitinib hoặc Erlotinib, Cetuximab và Panitumumab)
khi có đột biến gen KRAS. Ở người có ba gen RAS mã hóa ba protein cùng tên
H-RAS, K-RAS và N-RAS. Ba gen RAS nằm trên ba NST hoàn toàn khác
nhau. Đột biến gen RAS sẽ khởi động dòng thác tín hiệu nội bào bất hoạt tác
dụng của thuố
c. Bản thân đột biến gen này cũng là một yếu tố tiên lượng độc
lập đối với bệnh nhân đang điều trị Cetuximab. Trong ung thư ĐTT, tỷ lệ gen
KRAS bị đột biến lên tới 50% và thường tại vị trí codon 12 và 13.
Tăng sinh Xâm nhập Di căn Không chết theo lập trình Sinh mạch máu
Nhân
Bào tương
Ngoài tế bào

bất hoạt, dẫn đến các tế
bào u mất tính liên kết với mô nền xung quanh, dễ dàng di chuyển, xâm nhập
và di căn đến cơ quan khác.
Các dòng thác tín hiệu từ sự hoạt hóa EGFR cũng làm rối loạn cơ chế
điều hòa cadherin - catenin, yếu tố quan trọng cho sự kết dính giữa các tế bào
với nhau. Một khi mối liến kết giữa các tế bào mất đi, tế bào u dễ dàng di
chuyển ra xa vị trí nguyên phát đến các cơ
quan khác. Sự kích hoạt EGFR,
cùng với các dòng thác tín hiệu nội bào đã kích thích u phát triển, sinh mạch
11

và di căn xa. Do đó, có thể thấy biểu hiện quá mức EGFR trên những ung thư
giai đoạn tiến triển và di căn xa.
* Điều trị nhắm trúng đích EGFR
EGFR biểu hiện trong ung thư ĐTT với tỷ lệ khá cao khoảng 60-80%.
Điều đó cho phép điều trị kháng EGFR cho bệnh nhân ung thư tuyến ĐTT.
Năm 2004, FDA đã chấp nhận sử dụng Cetuximab (Erbitux) như là một thuốc
nhắ
m trúng đích cho EGFR đối với điều trị ung thư ĐTT. Cetuximab là một
kháng thể kháng EGFR, có khả năng ức chế quá trình phosphoryl hóa của
EGFR, đồng thời ức chế gắn kết với các ligand tự nhiên (Hình 1.2).
Cetuximab được chỉ định đối với các trường hợp carcinôm tuyến ĐTT có biểu
hiện quá mức EGFR (phát hiện bằng phương pháp nhuộm HMMD). Các
kháng thể kháng EGFR khác cũng được sử dụng là Panitumumab và
Matuzumab.
Tuy nhiên các nghiên cứu cho thấy tỷ lệ đáp ứng với Cetuximab không
tương ứng với biểu hiện quá mức EGFR trên carcinôm tuyến ĐTT. Những
trườ
ng hợp không đáp ứng có biểu hiện đột biến gen KRAS. Đột biến gen này
sẽ hoạt hóa các con đường tín hiệu nội bào khác, làm mất tác dụng của thuốc

tình trạng HER2 trong tất cả trường hợp carcinôm tuyến vú xâm lấn, bất kể là
bệnh mới hoặc tái phát. [217]. Hình 1.3 Hoạt động của các thụ thể HER: sự bắt cặp của thụ thể HER2 và
kích hoạt tiếp theo. Sau khi ligand gắn kết, thụ thể bắt cặp đồng loại hoặc dị
loại, các tyrosine kinase nội bào của các thụ thể được phosphoryl hóa, thụ thể
được kích hoạt và bắt đầu dòng thác tín hiệu
Các thụ thể HER tồn tại ở dạng đơn phân tử trên màng tế bào. Sự hoạt
hóa các HER tùy thuộc vào sự hiện diện của các phân tử truyền tin đặc hiệu
hay còn gọi là ligand và các thụ thể khác trong họ HER. Sau khi gắn kết với
chất truyền tin, 4 thụ thể khác nhau có thể liên kết với nhau thành từng cặp
hoặc đồng loại (HER1-HER1, HER2-HER2, HER3-HER3 ) hoặc dị loại (ví
B
ắ
t c
ặ
p
d
ị
lo
ạ
i
B
ắ
t cặ
p
đ
ồ
n

Phosphatidylinositol-3 kinase (PI3KS) thuộc gia đình kinase, gồm 3
nhóm I, II và III. Gen PI3KCA mã hoá cho tiểu đơn vị p110 alpha thuộc nhóm
I của
PI3KS. PI3KS và đặc biệt là PI3KCA có vai trò phosphoryl hoá
phosphatidylinositol 4,5-biphosphat thành phosphatidylinositol 3,4,5
15

biphosphat, có vai trò là yếu tố thông tin thứ hai giúp hoạt hoá các thành phần
khác như AKT và PDK1 kinase. Sự hoạt hoá này giúp tế bào liên tục phát
triển và ức chế sự chết tế bào theo chương trình. nhiều bằng chứng cho thấy
PI3KS và đặc biệt là PI3KCA đóng vai trò quan trọng trong carcinôm tuyến
vú, phổi, dạ dày, não và đại tràng.
1.2.2 Gen đè nén u
Bình thường gen đè nén u có thể gây dừng chu kỳ tế bào ngay cả khi gen
sinh ung thư đã được kích hoạt. Nếu tế bào không sửa chữa được DNA bị tổn
thương thì gen đè nén u sẽ khiến cho tế bào tự chết theo chương trình [59].
Gen đè nén u được mô tả đầu tiên trong nghiên cứu của Knudson về dịch tễ
của u nguyên bào võng mạc ở trẻ em. Đó là những gen hoạt động theo tính
lặn, chức năng của nó chỉ
mất đi khi cả hai allel bị bất hoạt. Khi một gen đè
nén u di truyền đột biến mầm sang cho thế hệ tiếp, thì chỉ cần thêm một đột
biến nữa trên allel còn lại sẽ gây mất chức năng của gen. Giả thuyết “hai cú
hích” của Knudson giải thích tại sao các bệnh di truyền thường thấy ở tuổi
sớm hơn các bệnh không do di truyền và giải thích khái niệm gen đè nén u
hoạt động theo kiể
u gen lặn.
1.2.2.1 Gen p53
Là gen đè nén u hay bị đột biến nhất trong ung thư ở người. Gen p53
bình thường hoạt động bằng cách làm tạm dừng chu kỳ tế bào để tiến hành
việc sửa chữa các sai lệch trong quá trình nhân đôi DNA, hoặc làm cho tế bào

chất di truyền, thừa hưởng gen p53 đột biến tạo ra hội chứng carcinôm tuyến
vú gia đình.
Protein TP53 là một protein ức chế sinh ung thư, có vai trò quan trọng
trong bảo vệ tế bào, phòng ngừa biến tế bào trở nên ác tính như khi DNA hay
phần telomere của tế bào bị tổn thương hoặc tế bào thiếu oxy thì p53 sẽ được
hoạt hoá và gắn vào các đoạn DNA đặc hiệu để chuyển mã các gen liên quan
nhằm làm ngưng chu k
ỳ tế bào để sửa chữa hay chuyển tế bào vào chết theo
chương trình. Còn trong tế bào bình thường, protein TP53 giữ ở tình trạng bất
hoạt hay biểu hiện ở mức độ thấp. Các nghiên cứu cho thấy khoảng 50% các
dạng ung thư ở người có gen p53 bị đột biến, còn trong ung thư ĐTT, 30-60%
gen này có đột biến, đột biến điểm ở 6 codon 175, 245, 248, 249, 273 và 282
chiếm đến 30%, còn đa số các đột biến khác thì x
ảy ra trong khoảng từ exon 4
đến exon 8. Đã có nhiều nghiên cứu về vai trò của các đột biến trên gen p53
trong ung thư ĐTT và người ta nhận thấy, tỷ lệ đột biến trên gen p53 ở những
khối u giai đoạn sớm tương đối thấp, nên đã hạn chế việc sử dụng p53 để sàng
lọc và phát hiện ung thư dựa trên kỹ thuật phân tử.
* Các biến đổi gen p53
Các nghiên cứu trước đây [106], [166] cho r
ằng đa số đột biến p53 xuất
hiện trong vùng gen bảo tồn cao, qua quá trình tiến hóa và có chức năng quan
trọng, chủ yếu trong exon 5-8 từ acid amin thứ 126-306. Vì vậy, đa số các
nghiên cứu về đột biến p53 thường giới hạn trong phạm vi vùng exon 5-8. Điều
này làm cho tỷ lệ các đột biến xuất hiện trong vùng exon 5-8 được báo cáo lên
đến 95%. Nhóm nghiên cứu của Greenblatt [106] đã thống kê trong 50 bài báo
phân tích các đột biến bằng cách giải trình tự toàn bộ chi
ều dài của gen p53, tỷ lệ
đột biến xuất hiện ở exon 5-8 chiếm tỷ lệ 87% trong tổng số 560 đột biến được
ghi nhận, sau đó là đột biến ở exon 4 (8%) và exon 10 (4%). Như vậy, tỷ lệ đột

thể phát hiện được bằng kỹ thuật HMMD. Chính vì vậy p53 có thể coi như
một dấu ấn khối u, có thể có những chức năng quan trọng như:
- Dự đoán hóa ác.
- Dự đ
oán di căn.
- Đánh giá mức đáp ứng với phương pháp điều trị và tiên lượng bệnh.
Để phát hiện đột biến gen p53 có thể sử dụng các kỹ thuật:
- Phát hiện đột biến gen trực tiếp (giải trình tự)
- Phát hiện đột biến gen gián tiếp
- Tầm soát DNA
Để khảo sát protein TP53 bất thường có thể dùng các kỹ thuật phân tích
protein như Western blot, ELISA,… nhưng hiện nay thông dụng nh
ất là
phương pháp HMMD.
20

Protein p53
* Cấu trúc protein TP53
Protein p53 gồm có 393 acid amin, có khối lượng phân tử là 53kD, là
protein có hàng loạt các biến đổi sau dịch mã như phosphoryl hóa, acetyl hóa,
ubiquitin hóa, sumoyl hóa, neddyl hóa. Protein p53 có thể được chia thành 3
phần chính (1) Đầu amino có các vùng kích hoạt phiên mã TAD1, vùng
TAD2 và vùng giàu Proline [66], (2) Vùng trung tâm là vùng gắn kết DNA
đặc hiệu (DBD), (3) Đầu cacboxyl có các vùng tín hiệu định vị nhân (NLS),
vùng tetramer hóa, vùng tín hiệu rời nhân (NES), và vùng điều hòa âm tính
(REG) (Hình 1.7).


hòa âm
tính
(REG)
95 – 289 319 - 359
21

năng của nó. Theo đó, khi protein TP53 có trạng thái bền vững hay các
protein TP53 bị bất hoạt được xem là giảm chức năng [56]. Các protein TP53
bị bất hoạt trong các trường hợp sau (1) protein TP53 bị đột biến nên không
thể hiện trọn vẹn chức năng, (2) gen p53 bị đột biến nên không tạo ra protein
TP53, (3) protein TP53 bình thường được tạo ra, nhưng có 1 loại protein thứ 2
bất hoạt nó, (4) protein TP53 bình thường được tạo ra, nhưng lại không ở vị

trí thực hiện chức năng trong tế bào. Đa số đột biến ở protein TP53 gây ra
những sai hỏng trong vùng liên kết chéo giữa protein và DNA, làm cho sự
biểu hiện của p21/WAF1 không được điều hòa, dẫn đến các tế bào có sai
hỏng DNA sau stress không tự chết theo chương trình được. Vì thế, p53 đột
biến thường làm giảm chức năng của protein TP53 [227].
Ngoài ra, có một số nghiên cứu khác cho rằng protein TP53 đột biến
không chỉ theo chiều hướng giả
m chức năng như trên mà còn có thể làm tăng
chức năng điều hòa ngược của p53 lên các gen khác nhau một cách trực tiếp
hay gián tiếp, làm cho các protein đột biến có những chức năng mới, khác
protein bình thường. Khi đột biến xảy ra ở các vị trí 175His, 248Trp, 273His
và 281Gly, protein TP53 tăng thêm khả năng kích hoạt lên gen tạo kháng thể
tăng sinh tế bào trong nhân. Nếu đột biến xảy ra ở các vị trí 143Ala, 175His,
248Trp, 273His và 281Gly làm tăng khả năng gắn kết lên vùng trình tự
đặc
hiệu trên promotor của gen EGFR và kích hoạt gen này biểu hiện quá mức
[154]. Còn p53 đột biến tại 143Ala lại kích hoạt gen bFGF biểu hiện, trong

gen sửa lỗi bắt cặp sai của DNA được tìm thấy ở người là hMSH2 (ở nhánh
ngắn NST số 2 – 2p16), hMLH1 (ở nhánh ngắn NST số 3 – 3p21), hPMS1 (ở
nhánh dài NST số 2 – 2q31-33), hPMS2 (ở nhánh dài NST số 7 – 7q11),
hMSH6 (ở nhánh ngắn NST số 2 – 2p16) và hMSH3 (ở nhánh dài NST số 5 –
2q11.2-q13.2). Khi cả hai allel của gen này bị bất hoạt thì các sai lệch trong
DNA không được sửa chữa, các lỗi trong bắt cặp DNA gia tăng, từ đó tăng
23

tốc tiến trình sinh ung thư. Bốn gen đầu tiên ở trên được xem như góp phần
hình thành HNPCC với tỷ lệ tương ứng là 31%, 33%, 2% và 4% [104], [110].
1.2.4 Gen liên quan đến phát triển u - Ki67
Protein Ki67 (MKI67) là dấu ấn chỉ sự phát triển tế bào. Kháng thể Ki67
được Gerdes và cộng sự tìm ra năm 1983, giúp phát hiện kháng nguyên trong
nhân tế bào ở giai đoạn hoạt động của tế bào trừ pha nghỉ (Hình 1.8). Nhờ đặc
điểm này Ki67 đã được áp dụng trong hàng loạt các nghiên cứu về tăng sinh
tế bào trên các loại ung thư [203]. Sự phát triển khối u do mất cân bằng giữa
quá trình tăng sinh tế bào và chết tế bào. Một số nghiên cứu cho thấy sự tăng
sinh tế bào ở pha S (pha tổng hợp) có ý nghĩa trong tiên lượng sống củ
a bệnh
nhân ung thư ĐTT. Để xác định tình trạng tăng sinh tế bào u, có thể nhuộm
HMMD với các dấu ấn miễn dịch Ki67, PNCA, BrdU, cyclin B1, phospho-
histone H3, …, [159], [196]. Hiện nay việc sử dụng protein Ki67 để đánh giá
tình trạng tăng sinh tế bào u rất phổ biến. Kháng thể đơn dòng Ki67 có khả
năng phát hiện kháng nguyên Ki67 hay MKI67, một protein ở người mã hóa
bởi gen MKI67. Protein Ki67, nặng 345-395 kDa, là một dấu ấn của sự tăng
sinh tế bào. Trong pha giữa c
ủa chu kỳ tế bào, có thể phát hiện kháng nguyên
Ki67 trong nhân tế bào, trong khi pha nguyên phân, hầu hết các protein nằm
trên bề mặt của NST [159], [196]. Protein Ki67 có mặt trong các pha hoạt
động của chu kỳ tế bào như (pha G