ĐACM: Ứng dụng enzyme protease trong sản xuất bia GVHD: Hồ Thị Tuyết Mai
LỜI MỞ ĐẦU
Sử dụng enzyme trong sản xuất và đời sống là một vấn đề được các nhà
khoa học và kỹ thuật chú ý từ lâu. Ngày nay, việc sử dụng này đã trở thành phổ
biến ở nhiều nước và đã mang lại lợi ích kinh tế khá lớn.
Enzyme là chất xúc tác sinh học không chỉ có ý nghĩa cho quá trình sinh
trưởng, sinh sản của thực vật mà nó còn đóng vai trò rất quan trọng trong chế
biến thực phẩm, trong y học, trong kỹ thuật phân tích, trong công nghệ gen và
bảo vệ môi trường.
Enzyme protease là nhóm enzyme thủy phân protein được ứng dụng rộng
rãi trong quá trình sản xuất nước mắm ngắn ngày, trong công nghiệp thuộc da,
trong công nghiệp sữa và phomat. Đặc biệt trong quá trình sản xuất bia, protease
đóng vai trò rất quan trọng trong việc tăng nhanh quá trình sản xuất, tăng hiệu
suất trích ly, thủy phân hoàn toàn các chất protein, làm giảm độ nhớt và làm triệt
tiêu nguyên nhân làm đục bia.
Ngày nay, bia là loại đồ uống không thể thiếu đối với cuộc sống của con
người. Bia là loại nước giải khát, có độ cồn thấp, giàu dinh dưỡng. Ngoài việc
cung cấp một lượng calori khá lớn, trong bia còn chứa một hệ enzyme phong
phú, kích thích tiêu hoá cho cơ thể con người.
Hiện nay, các nhà máy bia ở nước ta chưa chú ý tới việc sử dụng enzyme
trong quá trình sản xuất. Xuất phát từ những lý do trên em chọn đề tài “Ứng
dụng của enzyme protease trong sản xuất bia” với mong muốn những ứng dụng
của enzyme này sẽ được sử dụng rộng rãi trong việc sản xuất bia nói riêng.
SVTH: Lưu Thị Liên Trang 1 Lớp: 08s2
ĐACM: Ứng dụng enzyme protease trong sản xuất bia GVHD: Hồ Thị Tuyết Mai
Chương I TỔNG QUAN VỀ ENZYME PROTEASE
1. Tổng quan về enzyme Protease [2]
1.1. Giới thiệu chung
Protease là các enzyme xúc tác sự thủy phân liên kết peptit (CO-NH)
trong phân tử protein và các cơ chất tương tự.
Nhiều Protease có khả năng liên kết este và vận chuyển acid amin.
có thể khác nhau về nhiều tính chất. Căn cứ vào cơ chất phản ứng, pH hoạt động
thích hợp,… các nhà khoa học đã phân loại các Protease vi sinh vật thành bốn
nhóm như sau: P-xerin, P-thiol, P-kim loại, P-acid.
Một số tác giả khác chia
Protease ra ba nhóm, dựa vào hoạt
động ph của chúng bao gồm:
Protease-acid, Protease trung tính,
Protease kiềm.
Trong bốn Protease kể trên,
các Protease-xerin và Protease-thiol
có khả năng phân giải liên kết este
và liên kết amide của các dẫn xuất
acid của aa. Ngược lại các Protease
kim loại, Protease acid thường
không có hoạt tính esterase của các
dẫn suất của aa. Nhiều Protease
ngoại bào của vi sinh vật đã được
nghiên cứu tương đối kỹ về cấu tạo phân tử, một số tính chất hóa lý và cơ chế
tác dụng. Kết quả nghiên cứu cho thấy trọng lượng phân tử của các enzyme này
tương đối bé, nhất là các P-xerin.
Có thể tóm tắt những đặc tính của các nhóm Proteinase này ở bảng 1.1
SVTH: Lưu Thị Liên Trang 3 Lớp: 08s2
Hình 1.3. Cấu trúc tinh thể của Tripsin
(1 Protease xerin tiêu biểu)
Hình 1.2. Cấu trúc không gian enzyme Protease
ĐACM: Ứng dụng enzyme protease trong sản xuất bia GVHD: Hồ Thị Tuyết Mai
Bảng 1.1. Một số tính chất của Protease (P) vi sinh vật
Nhóm
Nguồn E
Chất kìm
Bac. Megaterium
Psuedomonasaeruginoa
Atreptomeces naraensis
Asp. Oryzae
Acremonium kiliense
Clostridiumhisttolytium
EDTA
++
1,10octa-
fenantrolin
Kim loại
hóa trị hai
Trung
tính
P-Acid Asp.niger
Asp.Awamori
Sailoi,penicillium
Janthinellum
Rhizopus chinensis
Mucor pucillus
Endothia parasilica
Dizoaxetil
Dlnorlox-
inmetil este
COOH Acid
SVTH: Lưu Thị Liên Trang 4 Lớp: 08s2
ĐACM: Ứng dụng enzyme protease trong sản xuất bia GVHD: Hồ Thị Tuyết Mai
1.3. Cấu trúc trung tâm hoạt động (TTHĐ) của Protease [5]
Trong TTHĐ của Protease vi sinh vật ngoài gốc acid amin đặc trưng cho
từng nhóm còn có một số gốc acid amin khác. Các kết quả nghiên cứu chung về
xúc tác cho mọi phản ứng sinh học. Chính vì thế, mọi sinh vật đều được xem là
nguồn thu nhận để sản xuất enzyme. Nhưng vẫn chủ yếu là ba nguồn chính:
Động vật, thực vật và vi sinh vật.
Protease phân bố ở thực vật, động vật, vi sinh vật. Tuy nhiên nguồn
enzyme ở vi sinh vật phong phú nhất, có ở hầu hết các vi sinh vật như vi khuẩn,
nấm mốc và xạ khuẩn… có thể nói vi sinh vật là nguồn nguyên liệu thích hợp
nhất để sản xuất enzyme ở quy mô lớn dùng trong công nghệ và đời sống [3].
Enzyme Protease từ nguồn động vật và thực vật được loài người khai thác
và ứng dụng hàng ngàn năm để sản xuất và phục vụ trong cuộc sống. Nhưng
hiện nay lượng enzyme thu nhận từ thực vật và động vật được thay thế dần bằng
enzyme vi sinh vật. enzyme thu nhận từ các nguồn này thường rất khó và hiệu
SVTH: Lưu Thị Liên Trang 5 Lớp: 08s2
E + S enzyme – S enzyme – S + P
1
enzyme + P
2
Hình 1.4. Cơ chế xúc tác TTHĐ Enzyme
ĐACM: Ứng dụng enzyme protease trong sản xuất bia GVHD: Hồ Thị Tuyết Mai
quả kinh tế không cao. Nguồn enzyme từ vi sinh vật dần dần thay thế enzyme từ
động vật và thực vật do hàng loạt những ưu điểm về sinh lý vi sinh vật và về kỹ
thuật sản xuất được liệt kê như sau:
Vi sinh vật có khả năng chuyển hóa một khối lượng cơ chất lớn hơn khối
lượng cơ thể chúng hàng ngàn lần sau một ngày đêm.
Enzyme thu nhận từ vi sinh vật có hoạt tính cao.
Tốc độ sinh sản của vi sinh vật mạnh, trong thời gian ngắn có thể thu
được lượng sinh khối vi sinh vật rất lớn, giúp trong một thời gian ngắn thu được
một lượng enzyme nhiều hoặc lượng các sản phẩm trao đổi chất cao.
Một đặc điểm riêng có của vi sinh vật đó là cơ thể nhỏ bé nên việc vận
hành, kiểm soát thiết bị lên men trong quá trình sản xuất đơn giản hơn rất nhiều.
Vi sinh vật là giới sinh vật thích hợp cho sản xuất theo quy mô công
ĐACM: Ứng dụng enzyme protease trong sản xuất bia GVHD: Hồ Thị Tuyết Mai
3.2. Môi trường nuôi cấy vi sinh vật tổng hợp enzyme Protease
Để tổng hợp enzyme Protease cần phải chọn môi trường vì thành phần
môi trường dinh dưỡng có ảnh hưởng trực tiếp đến sự sinh trưởng và tổng hợp
enzyme của vi sinh vật.
Trong thành phần môi trường phải có đủ các chất đảm bảo được sự sinh
trưởng bình thường của vi sinh vật và tổng hợp enzyme.
Đặc biệt lưu ý là để tăng sự tổng hợp enzyme người ta thường dựa vào
hiện tượng cảm ứng. Vì nếu như trong thành phần môi trường có các chất cảm
ứng thì chất đó hay sản phẩm phân giải của nó sẽ kìm hãm hoặc làm yếu tác
dụng kìm toả của chất kìm hãm nhằm bảo đảm khả năng sinh tổng hợp enzyme
đã cho không bị cản trở. Chất cảm ứng tổng hợp enzyme cho thêm vào môi
trường nuôi thường là cơ chất tương ứng của enzyme cần tổng hợp.
Thành phần chính của môi trường: C, N, H, O. Ngoài ra các chất vô cơ:
Mn, Ca, P, S, Fe, K và các chất vi lượng khác.
3.2.1. Nguồn cacbon [1],[9]
Thường là hợp chất hữu cơ trong đó chủ yếu là gluxit, tùy thuộc vào đặc
tính của enzyme và nòi vi sinh vật mà người ta lựa chọn cho thích hợp.
Có nhiều hợp chất hydratcacbon và các hợp chất khác là nguồn cacbon
thích hợp đối với nấm mốc sinh ra enzyme Protease có hoạt lực cao. Các nguồn
cacbon có tác dụng đến sinh tổng hợp Protease của Asp. oryzae có thể theo thứ
tự:
fructoza→ sacaroza→ maltoza→ glucoza→ manit→ arabinoza→ galactoza.
Tinh bột là nguồn cacbon của nhiều chủng vi khuẩn sinh tổng hợp
enzyme Protease.
3.2.2. Nguồn nitơ [1].
Nguồn nitơ sử dụng rất phong phú, bao gồm 2 nhóm: vô cơ và hữu cơ.
Đối với một số loài nấm mốc thuộc họ (A. oryzae, A. awamori, A. niger,
A. flavus) trên môi trường có các nguồn nitơ hữu cơ sinh tổng hợp Protease axit
cao. Nhiều kết quả nghiên cứu cho thấy sinh tổng hợp enzyme được nâng cao
mặt [3]
Là phương pháp tạo môi trường cho vi sinh vật phát triển trên bề mặt môi
trường. Có thể là môi trường lỏng hoặc đặc. Phương pháp này rất thích hợp để
nuôi cấy các loại nấm mốc do khả năng phát triển nhanh, mạnh, nên ít bị tạp
nhiễm. Khi nuôi nấm mốc phát triển bao phủ bề mặt hạt chất dinh dưỡng rắn,
các khuẩn ty cũng phát triển đâm sâu vào lòng môi trường đã được tiệt trùng,
làm ẩm. Đối với một số mục đích đặc biệt, người ta nuôi vi sinh vật trực tiếp
trên bề mặt hạt gạo (sản xuất tương), hạt đậu tương đã được nấu chín trộn hạt
cốc còn sống (làm men thuốc bắc, men dân tộc, làm tương).
Người ta thường dùng cám mì, cám gạo, ngô mảnh… có chất phụ gia là
trấu. Cám, trấu, có bề mặt tiếp xúc lớn, tạo được độ xốp nhiều, không có những
chất gây ảnh hưởng xấu đến sự phát triển của nấm mốc. Tỉ lệ các chất phụ gia
phải bảo đảm sao cho hàm lượng tinh bột trong khối nguyên liệu không được
thấp hơn 20%, có thể bổ sung thêm nguồn nitơ vô cơ ((NH
4
)
2
SO
4
, (NH
4
)
2
CO),
photpho, nitơ hữu cơ và các chất kích thích sinh trưởng như malt, nước chiết
ngô, nước lọc bã rượu.
- Ưu, nhược điểm
+ Nồng độ enzyme tạo thành cao hơn nhiều lần so với dịch nuôi cấy chìm
sau khi đã tách tế bào vi sinh vật. Chế phẩm dễ dàng sấy khô mà không làm
giảm đáng kể hoạt tính enzyme. Chế phẩm khô, dễ bảo quản, vận chuyển,
cất, bằng các dung dịch đệm thích hợp hoặc các dung dịch muối trung tính.
+ Có một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết rút cần lưu ý. Trước hết
đó là nhiệt độ. Để tránh mất hoạt tính hoặc thậm chí vô hoạt, cần chiết rút và
tiến hành kết tủa enzyme ở nhiệt độ thấp (từ 3 đến 5
0
C). Các thao tác phải
nhanh. Một số chất điện ly làm tăng quá trình chiết rút enzyme như NaCl, ZnCl
2
,
CaCl
2
. Tác dụng của chúng còn phụ thuộc vào phương pháp dùng khi chiết rút.
- Để loại bỏ muối khoáng và các loại đường... là các tạp chất có phân tử
lượng thấp, người ta thường dùng phương pháp thẩm tích (dialysis) đối nước
hay đối các dung dịch đệm loãng hoặc bằng cách lọc qua gel sephadex.
- Để loại bỏ các protein tạp (protein cấu trúc, protein trơ) và các chất có
phân tử lượng cao khác người ta hay dùng kết hợp các phương pháp khác nhau:
phương pháp biến tích chọn lọc nhờ tác dụng của nhiệt độ hoặc pH của môi
trường, phương pháp kết tủa phân đoạn bằng muối trung tính hoặc các dung môi
hữu cơ, các phương pháp sắc ký (sắc ký hấp phụ, sắc ký trao đổi ion), điện di,
phương pháp lọc gel.
- Mục đích yêu cầu: Các chế phẩm enzyme được sử dụng ở các dạng khác
nhau theo mức độ tinh khiết (hoạt độ riêng). Trong một số trường hợp, canh
trường nuôi cấy vi sinh vật có chứa enzyme được sử dụng trực tiếp dưới dạng
thô không cần tách tạp chất nếu chúng không gây ảnh hưởng đáng kể đến sản
phẩm và quy trình công nghệ sau này (Ví dụ: sản xuất rượu, nước chấm thực
vật, da). Cũng có khi người ta cần sử dụng chế phẩm enzyme tinh khiết trong
công nghiệp dệt, công nghiệp mạch nha, y học, nghiên cứu khoa học.
Enzyme nói chung rất dễ bị giảm hoạt tính dưới tác dụng của các tác nhân
bên ngoài do đó khi tách và tinh chế enzyme để tránh sự biến hình protein ảnh
qua một màng có lỗ nhỏ bằng áp suất hoặc bằng ly tâm).
SVTH: Lưu Thị Liên Trang 10 Lớp: 08s2
ĐACM: Ứng dụng enzyme protease trong sản xuất bia GVHD: Hồ Thị Tuyết Mai
4. Quy trình thu nhận enzyme protease từ chủng nấm mốc Asp.oryzae [8],
[18]
4.1. Quy trình thu nhận
Hình 1.5. Quy trình thu nhận enzyme protease
SVTH: Lưu Thị Liên Trang 11 Lớp: 08s2
Thu nhận sinh khối
(enzyme thô)
Chế phẩm enzyme
thô đem tinh chế
Nghiền mịn
Trích ly
Chế phẩm ezyme
thô đem sử dụng
Khoáng hỗn hợp
Nguyên liệu dinh dưỡng (bột
bắp, cao nấm men, pepton)
Hấp thanh trùng
Làm nguội đến 30
0
C
Nước
Đỗ lên khay
Giống Asp.oryzae
Nuôi cấy ở nhiệt độ
phòng
0,5-2%
2 - 3cm, rồi được đưa vào phòng nuôi cấy, đặt trên những giá đỡ. Các giá đỡ này
được thiết kế sao cho lượng không khí được lưu thông thường xuyên. Phòng
nuôi cấy phải có hệ thống điều chỉnh nhiệt độ và độ ẩm không khí. Nhiệt độ
thích hợp cho nấm sợi phát triển là 28 - 32
0
C. Nhiệt độ thấp quá hoặc cao quá
đều ảnh hưởng không tốt cho nấm sợi phát triển.
Trong quá trình nuôi cấy, ta hoàn toàn không cần điều chỉnh pH. Môi
trường bán rắn là môi trường tĩnh nên sự thay đổi pH ở một vùng nào đó ít khi
ảnh hưởng đến toàn bộ khối môi trường.
Thời gian nuôi nấm sợi thu nhận enzyme vào khoảng 36 - 60 giờ. Điều
này còn phụ thuộc vào chủng nấm mốc Asp.oryzae và điều kiện môi trường
cũng như phụ thuộc vào điệu kiện nuôi cấy.
Quá trình phát triển của nấm mốc trong môi trường bán rắn khi nuôi bằng
phương pháp bề mặt này trải qua các giai đoạn sau:
Giai đoạn 1: Giai đoạn này kéo dài 10 - 14 giờ kể từ thời gian bắt đầu
nuôi cấy. Enzyme mới bắt đầu đươc hình thành. Trong giai đoạn này phải đặc
biệt quan tâm đến chế độ nhiệt độ. Tuyệt đối không được đưa nhiệt độ cao quá
30
0
C vì thời kỳ đầu này giống rất mẫn cảm với nhiệt độ.
Giai đoạn 2: Giai đoạn này kéo dài 14 - 18 giờ. Enzyme protease được
tổng hợp mạnh. Lượng O
2
trong không khí giảm và CO
2
sẽ tăng dần, do đó trong
giai đoạn này cần phải được thông khí mạnh và nhiệt độ cố gắng duy trì trong
khoảng 29 - 30
0
phản ứng và khả năng tăng mức độ ma sát trước khi sử dụng cát thạch anh và
bột thủy tinh phải được rửa sạch, sấy khô ở nhiệt độ lớn hơn 100
0
C để loại bỏ
nước và tiêu diệt vi sinh vật.
Trích ly
Sau khi nghiền mịn, người ta cho nước vào để trích ly enzyme protease.
Các loại enzyme thủy phân có khả năng tan trong nước nên người ta thường
dùng nước như một dung môi hòa tan. Cứ một phần chế phẩm enzyme thô,
người ta cho 4 - 5 phần nước, khuấy nhẹ và sau đó lọc lấy dịch, phần bã thu
riêng dùng làm thực phẩm gia súc (chú ý cần loại bỏ cát thạch anh và bột thủy
tinh ra khỏi hỗn hợp bã rồi mới cho gia súc ăn).
Dịch thu nhận được vẫn ở dạng chế phẩm enzyme thô vì trong đó có chứa
nước, các chất hòa tan khác từ khối môi trường nuôi cấy. Việc tiếp theo là làm
sao tách enzyme ra khỏi vật chất này.
Kết tủa enzyme protease
Để làm việc trên người ta tiến hành kết tủa enzyme nhờ những tác nhân
gây tủa. Trong công nghệ tinh chế enzyme, người ta thường dùng cồn và sunfat
amon. Hai tác nhân kết tủa này dễ tìm kiếm và giá rẻ so với những tác nhân gây
tủa khác.
Trong khi tiến hành kết tủa, người ta phải làm lạnh cả dung dịch enzyme
thô và cả những tác nhân kết tủa để tránh làm mất hoạt tính enzyme. Khi đổ chất
làm kết tủa enzyme vào dung dịch enzyme thô phải hết sức từ từ để tránh hiện
tượng biến tính.
Các enzyme sẽ được tạo kết tủa và lắng xuống đáy, tiến hành gạn và lọc
thu nhận kết tủa ở dạng paste (độ ẩm lớn hơn 70% W).
SVTH: Lưu Thị Liên Trang 13 Lớp: 08s2
Hình 1.6. Nồi hấp khử trùng.
môi trường
ĐACM: Ứng dụng enzyme protease trong sản xuất bia GVHD: Hồ Thị Tuyết Mai
Hình 1.8. Máy trích ly kiểu
vít tải
ĐACM: Ứng dụng enzyme protease trong sản xuất bia GVHD: Hồ Thị Tuyết Mai
Máy trích ly
Để trích ly
enzyme, acid amin và
các chất khác từ vật liệu
rắn trong điều kiện sản
xuất lớn, người ta ứng
dụng trích ly tác động
liên tục.
Bộ nạp liệu kiểu vít tải
chuyển pha rắn của canh
trường nấm mốc vào
phần trên của cột
nạpliệu. Canh trường
nấm mốc từ cột nạp liệu
qua cột chuyển nằm
ngang vào cột nâng và
sau khi vắt thì thải ra
ngoài.
Nước dâng lên trong cột nạp liệu được bảo hòa liên tục và sau khi qua bộ
lọc thì đưa ra ngoài. Thời gian trích ly 40 - 60 phút ở 25
0
C.
Máy sấy phun sương
Hình 1.9. Máy sấy phun sương LPG Hình 1.10. Thiết bị sấy phun hình đáy bằng
Không khí đi qua bộ lọc và bộ gia nhiệt được đưa vào bộ phân phối không
khí ở trên đỉnh thiết bị; khí nóng được đưa vào buồng sấy đều theo hình xoáy
trôn ốc. Nguyên liệu dạng lỏng từ máng nguyên liệu đi qua bộ lọc được bơm lên
là 15,79UI/gCKNT (chất khô nội tạng) trong điều kiện chiết: tỷ lệ mẫu/dung
môi 1/1; pH 9,5; nhiệt độ 35
0
C; thời gian chiết 10 phút. [12].
+ Tối ưu một số điều kiện nuôi cấy chủng vi sinh vật biển Acinetobacter sp.
QN6 sinh tổng hợp Protease được thực hiện của Quyền Đình Thi, Trần Thị
Quỳnh Anh, Nguyễn Thị Thảo (2007), viện CNSH đã chứng minh các điều kiện
thuận lợi nhằm nuôi cấy với hiệu suất cao nhất đối với chủng vi sinh vật biển
Acinetobacter sp. QN6 sinh tổng hợp Prơtease [13].
SVTH: Lưu Thị Liên Trang 16 Lớp: 08s2
ĐACM: Ứng dụng enzyme protease trong sản xuất bia GVHD: Hồ Thị Tuyết Mai
+ Phan Thị Bích Trâm, Dương Thị Hương Giang, Hà Thanh Toàn, Phạm
Thị Ánh Hồng, Đại học Cần Thơ, Trường ĐHKH Tự nhiên, ĐH Quốc Gia TP
Hồ Chí Minh đã tiến hành “Tinh sạch và khảo sát đặc điểm của các Serine
Protease từ Trùn Quế” ( 2007). Bước đầu khảo sát hệ enzyme Protease từ trùn
quế (Perionyx excavatus) cho thấy phần lớn các protease trong dịch chiết
enzyme thô có thể tinh sạch sơ bộ bằng tủa phân đoạn với ammonium sulfat
nồng độ trong khoảng 30-80%. Nhiệt độ và pH tối ưu cho enzyme thô hoạt động
trên cơ chất casein là 55
0
C và pH trong khoảng kiềm 10 -12. [14],[4].
+ “Nghiên cứu ứng dụng Protease bacillus subtilis trong sản xuất bột đạm
thủy phân từ cá Mối”, Vũ Ngọc Bội, trường Đại học thủy sản Nha Trang. Qua
nghiên cứu cho thấy protease B. subtilis có thể thủy phân mạnh mẽ cơ thịt cá
mối và hoàn toàn có thể sử dụng enzyme này trong sản xuất bột đạm thủy phân.
Khi bổ sung protease B. subtilis với nồng độ enzyme 0,3% vào hỗn hợp cơ thịt
cá mối và thủy phân ở 50
0
C.
+ Nghiên cứu ứng dụng Protease trong sản xuất Bia, thực hiện trong các
công nghiệp trên toàn thế giới đạt khoảng 1 tỷ USD, trong đó chủ yếu là các
enzyme thủy phân (75%), và Protease là một trong ba nhóm enzyme lớn nhất sử
dụng trong công nghiệp (60%) (Rao et al., 1998) [11].
Từ năm 1950 trở lại đây trên thế giới có hàng loạt Protease động vật, thực
vật và vi sinh vật được tách chiết nghiên cứu. Thời gian gần đây các nhà khoa
học trên thế giới tập trung nghiên cứu về Protease vi sinh vật và đã đạt nhiều
thành tựu to lớn về lĩnh vực này (Protease từ vi sinh vật chiếm tới 40% tổng
doanh thu của enzyme toàn thế giới (Godfrey west, 1996) [13]). Hiện nay, số
lượng các enzyme được sản xuất hàng năm trên thế giới, ở các nước phát triển
nhất là châu Âu, Mỹ và Nhật Bản vào khoảng 300.000 tấn với doanh thu từ sản
xuất enzyme ước tính vào khoảng 500 triệu USD. Trong đó khoảng 600 tấn
Protease tinh khiết được sản xuất từ vi sinh vật bao gồm khoảng 500 tấn từ vi
khuẩn và 100 tấn từ nấm mốc. Những nước có công nghệ sản xuất và ứng dụng
Protease tiên tiến trên thế giới là: Đan Mạch, Nhật Bản, Mỹ, Anh, Pháp, Hà Lan,
Trung Quốc, Đức, Áo. Các nước này đã đầu tư thích đáng cho công tác nghiên
cứu, sản xuất và ứng dụng Protease từ VSV. Chính vì thế nhịp độ sản xuất
Protease ở quy mô công nghiệp tại các nước phát triển hàng năm tăng vào
khoảng 5% - 10%. Ngày nay người ta có thể sản xuất các enzyme cố định trên
các chất mang không tan cho phép có thể tái sử dụng enzyme nhiều lần. Vì vậy
mà việc ứng dụng Protease ngày càng gia tăng[4], [1].
Enzyme tinh khiết trong công nghiệp dệt, công nghiệp mạch nha, y học,
nghiên cứu khoa học.
SVTH: Lưu Thị Liên Trang 18 Lớp: 08s2
ĐACM: Ứng dụng enzyme protease trong sản xuất bia GVHD: Hồ Thị Tuyết Mai
Chương 2. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU VÀ THIẾT BỊ
I. Đối tượng nghiên cứu
1.Giới thiệu nguyên liệu [6]
Nguyên liệu chính dùng để sản xuất bia là malt đại mạch, hoa houblon,
nước và sử dụng nguyên liệu thay thế là ngô, gạo.
1.1. Malt đại mạch
của hạt dài, sau khi trổ hoa và làm đòng thì bông bắt đầu cúi xuống. Đại mạch
bông đứng có đặc điểm là cây to cứng, bông dày hạt. Loại này được trồng nhiều
ở một số nước Tây Âu. Đại mạch bông xòe thì có gié rất ngắn, có hạt dường như
được tính vuông góc với trục bông chủ yếu trồng nhiều ở Anh, Ailen và Bắc Mỹ
chế biến thức ăn cho gia súc, gia cầm,…thường dùng đại mạch đa hàng
(hordeum polystychum).
SVTH: Lưu Thị Liên Trang 19 Lớp: 08s2
ĐACM: Ứng dụng enzyme protease trong sản xuất bia GVHD: Hồ Thị Tuyết Mai
Giống đại mạch đa hàng này được chia làm hai nhóm: đại mạch bốn hàng
(H.hexatichum) và đại mạch sáu hàng (H. tetratichum) thông thường giống đại
mạch bốn hàng cũng được dùng để sản xuất bia nhưng không được phổ biến.
Hình 1.12. Đại mạch hai hàng
Hình 1.13. Đại mạch nhiều hàng
1.1.2. Thành phần cấu tạo của malt
Hạt của malt đại mạch có ba bộ phận chính: vỏ, nội nhũ và phôi.
Vỏ
Vỏ hạt chiếm tỉ lệ khá lớn nhưng không có giá trị dinh dưỡng. Đối với
công nghệ sản xuất bia vỏ hạt gây ảnh hưởng hai mặt: mặt bất lợi là trong vỏ có
chứa các chất màu,các chất đắng và các chất chát nếu các chất này hòa tan vào
dịch đường sẽ làm giảm chất lượng của sản phẩm. Mặt lợi của lớp vỏ là đóng
vai trò xây dựng màng lọc trong quá trình tách bả khỏi khối cháo.
SVTH: Lưu Thị Liên Trang 20 Lớp: 08s2
ĐACM: Ứng dụng enzyme protease trong sản xuất bia GVHD: Hồ Thị Tuyết Mai
Vỏ hạt đại mạch từ ngoài vào trong chia làm ba lớp: vỏ trấu, vỏ quả, vỏ
hạt. Phần này chiếm từ 8 - 15% trọng lượng hạt.
Vỏ trấu là cấu tử chiếm nhiều nhất trọng lượng của vỏ, nó được hình
thành từ đài hoa. Đài hoa dưới hình thành nên vỏ trấu phía ngoài (phía lưng) và
kết thúc bằng sợi râu, còn đài hoa hình thành nên vỏ trấu phía trong (phía bụng)
của hạt…Đài hoa là công cụ để bảo vệ các cơ quan bên trong của hạt trong quá
- Amylo: chiếm từ 17 -24% trọng lượng tinh bột là một polyme ở dạng
xoắn – thẳng gồm 60 – 600 gốc glucoza được nối với nhau qua cầu oxy & - 1,4
glucozit.
- Amylopectin: chiếm từ 76 – 83% trọng lượng tinh bột, là một polyme ở
dạng xoắn –nhánh gồm khoảng 2000 gốc glucoza được nối với nhau qua cầu
oxy - 1,4 glucozit ở mạch chính và - 1,6 glucozit ở mạch nhánh.
Tinh bột sẽ chịu tác động xúc tác của hệ enzyme amylaza, hiệu quả xúc
tác này sẽ tùy thuộc vào nhiệt độ và pH.
SVTH: Lưu Thị Liên Trang 21 Lớp: 08s2
ĐACM: Ứng dụng enzyme protease trong sản xuất bia GVHD: Hồ Thị Tuyết Mai
Phôi
Phôi là cơ quan sống, hô hấp của hạt. Phôi thường chiếm 2,5 – 5% trọng
lượng hạt. Trong phôi có từ 37 - 50% chất khô là thành phần nito, khoảng 7%
chất béo, 5 – 6% đường saccaroza, 7 – 7,5% pentoza, 6 – 6,5% chất tro và một ít
thành phần khác.
Vai trò của phôi có tầm quan trọng đặc biệt không những đối với sự sống
lưu truyền của cây mà ngay cả trong công nghiệp sản xuất bia. Quá trình chế
biến hạt đại mạch để trở thành hạt malt được đặt nền tảng trên sự nảy mầm của
hạt, tức là sự phát triển của phôi.
Trong giai đoạn này quá trình sinh học chủ yếu xảy ra là sự hoạt hóa và
tích lũy hoạt lực của enzyme trong hạt. Nhờ quá trình này mà một chất dinh
dưỡng cao phân tử bị phân cắt thành sản phẩm thấp phân tử. Một phần các chất
thấp phân tử này được chuyển về phôi để nuôi cây non, phần còn lại tồn tại
trong hạt để sau này biến thành chất hòa tan của dịch đường.
Phôi nằm ở phía dưới gần đế của hạt bao gồm phôi lá , phôi rễ và nằm
giữa chúng là phôi thân. Tiếp giáp giữa phôi và nội nhũ là lớp ngù. Ngù là một
lớp màng bán thấm: nó chỉ cho phép các chất hòa tan từ nội nhũ thấm qua để
chuyển về phôi và nước từ phía phôi đi vào nội nhũ.
1.1.3. Thành phần hoá học của malt
có thể lên đến 70%. Trong công nghệ sản xuất malt và bia thì tinh bột có hai
chức năng:
- Thứ nhất nó là nguồn thức ăn dự trữ cho phôi.
- Thứ hai nó là nguồn cung cấp hoà tan cho dịch đường trước lúc lên men.
Tinh bột được phân bố ở nội nhũ và một phần rất ít ở phôi. Chúng tồn tại
dưới dạng những khối lập thể, có kích thước khá bé ta gọi là hạt tinh bột.
Hạt tinh bột của đại mạch có hai kích cỡ: hạt to và hạt bé.
- Hạt to là hạt có kích thước đường kính khoảng 20 - 30 um, dạng hình
cầu hoặc hình ovan.
- Hạt loại bé có dạng hình cầu hay hình que, kích thước khoảng 2 - 10um.
Tinh bột của hạt đại mạch có tỷ trọng 1.5 - 1.6, nhiệt lượng riêng là 0.27
kcal/kg, dễ kết lắng trong nước, quay mặt phẳng của ánh sáng phân cực sang
bên phải có giới hạn góc quay là 201.5 - 204.3
0
Tinh bột không tan trong nước lạnh và các dung môi hữu cơ trung tính,khi
tiếp xúc với nước thì tinh bột sẽ hút nước và trương nở.
Tính chất hồ hóa của tinh bột có ý nghĩa rất lớn trong công nghệ sản xuất
bia vì tinh bột đã qua hồ hóa sẽ được đường hóa nhanh hơn và triệt để hơn.
Tinh bột gồm hai polysaccharide hợp thành: amyloza và amylopectin:
- Amyloza: chiếm từ 17 - 24% bao gồm từ 60 - 600 gốc glucoza liên kết
với nhau qua cầu oxi và đến 1.4 - glucozit và tạo mạch thẳng: phía đầu là cực
kín còn đầu kia là cực aldehit.
Mạch amylose được xoắn theo vòng và có cấu trúc không gian giống một
chiếc lò xo. Khi tiếp xúc với dung dịch ion thì chúng bị hấp thu vào khoảng
không của chiếc lò xo này và tạo phức chức phản quang màu xanh. Khi cấu trúc
lò xo này bị phá vỡ thì tính chất này cũng không còn.
Amyloza có dạng tinh thể có phân tử lượng khoảng 10.000 - 100.000 đơn
vị, dễ hòa tan trong nước nóng để tạo thành dung dịch không bền vững với độ
nhớt khá thấp. Dưới tác dụng của enzyme amyloza mạch amyloza này sẽ bị phân
cách thành các đường đơn giản maltoza và glucoza.
dưỡng quan trọng cho nấm men sử dụng.
Quá trình phá vỡ thành tế bào bởi enzyme sitaza đóng vai trò quan trọng ở
giai đoạn ươm mầm vì đây là bước đột phá để các enzyme khác xâm nhập vào
bên trong tế bào.
• Các hợp chất pectin và các hợp chất dạng keo
Các hợp chất dạng pectin được phân bố thành tế bào tạo ra màng trung
gian chủ yếu là protopectin.
Các chất dạng keo khi chúng hòa tan vào nước nóng thì tạo thành dung
dịch có độ nhớt cao vì bản chất của nó là một hydratcacbon nên khi thủy phân
cho sản phẩm là đường đơn galactoza và xitoza.
Sự tồn tại của hợp chất pectin và các chất dạng keo trong dung dịch
đường mang tính chất hai mặt: Mặt bất lợi gây cho dung dịch có độ nhớt cao nên
khó lọc, mặt có lợi tạo cho bia có vị đậm đà, tăng khả năng tạo bọt và giữ bọt
của sản phẩm.
• Saccharide thấp phân tử
Saccharide chủ yếu là một số đường đơn và đường kép, cấu tử chiếm
nhiều nhất là saccharoza tới 1,8% chất khô của hạt. Loại đường này phân bố ở
phôi chiếm đến 5,5% trọng lượng của bộ phận này.
Lượng glucoza và fructoza trong hạt đại mạch là không đáng kể, tổng
lượng đường ngược khoảng 0,3 - 0,4% trong đó trọng lượng glucoza cao hơn
một ít so với fructoza.
SVTH: Lưu Thị Liên Trang 24 Lớp: 08s2
ĐACM: Ứng dụng enzyme protease trong sản xuất bia GVHD: Hồ Thị Tuyết Mai
Các loại đường đơn trong hạt đại mạch không nhiều nhưng có vai trò
quan trọng đối với sự phát triển của phôi đặc biệt ở giai đoạn đầu của quá trình
ươm mầm.
1.3.3. Các hợp chất chứa nitơ
Hàm lượng các hợp chất chứa nitơ tuy chiếm tỷ lệ thấp trong đại mạch
khoảng 9 - 10% so với lượng chất khô của hạt nhưng nó có vai trò rất quan trọng
trong công nghệ sản xuất bia vì nó ở chừng mực nào đó chúng quyết định chất
polypentid và acid amin.
- Albumoza và penton có vai trò rất lớn trong việc tạo và giử bọt, đồng
thời làm tăng thêm vị đậm đà của bia, nhưng ở hàm lượng cao sẽ làm giảm độ
bền của keo của bia gây đục bia.
SVTH: Lưu Thị Liên Trang 25 Lớp: 08s2
Copyright: Tài liệu đại học ©