Luận văn tốt nghiệp khóa 31 – 2009 Trường Đại Học Cần Thơ
Chuyên ngành Công Nghệ Thực Phẩm – Khoa NN & SHUD Trang
i
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG
HUỲNH THỊ MỸ DUYÊN
NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG ENZYME α - AMYLASE
TRONG SẢN XUẤT RƯỢU NẾP TRẮNG
Luận văn tốt nghiệp
Ngành: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM
Cần Thơ, 2009
Luận văn tốt nghiệp khóa 31 – 2009 Trường Đại Học Cần Thơ
Chuyên ngành Công Nghệ Thực Phẩm – Khoa NN & SHUD Trang
ii
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG
Luận văn tốt nghiệp
Ngành: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM
Tên đề tài:
NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG ENZYME α - AMYLASE
TRONG SẢN XUẤT RƯỢU NẾP TRẮNG
Giáo viên hướng dẫn: Sinh viên thực hiện:
TS. Nguyễn Công Hà Huỳnh Thị Mỹ Duyên
MSSV: 2051625
Lớp: CNTP K31
Cần Thơ, 2009
Luận văn tốt nghiệp khóa 31 – 2009 Trường Đại Học Cần Thơ
Chuyên ngành Công Nghệ Thực Phẩm – Khoa NN & SHUD Trang
iii
Luận văn tốt nghiệp kèm theo sau đây, với tựa đề là “NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG
ENZYME α-AMYLASE TRONG SẢN XUẤT RƯỢU NẾP TRẮNG”, do Huỳnh
Sinh viên thực hiện
Huỳnh Thị Mỹ Duyên
Luận văn tốt nghiệp khóa 31 – 2009 Trường Đại Học Cần Thơ
Chuyên ngành Công Nghệ Thực Phẩm – Khoa NN & SHUD Trang
vi
MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN .................................................................................................... iv
LỜI CẢM TẠ ............................................................................................................v
MỤC LỤC................................................................................................................ vi
DANH SÁCH BẢNG ............................................................................................ viii
DANH SÁCH HÌNH............................................................................................... ix
TÓM TẮT ..................................................................................................................x
CHƯƠNG I: GIỚI THIỆU ......................................................................................1
1.1 ĐẶT VẦN ĐỀ...................................................................................................1
1.2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU..............................................................................1
CHƯƠNG II: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU................................................................2
2.1 GẠO NẾP..........................................................................................................2
2.1.1 Thành phần amylose và amylopectin.........................................................2
2.1.2 Khả năng hấp thụ và sự trương nở của tinh bột..........................................4
2.1.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến nhiệt độ hồ hóa tinh bột ...................................5
2.2 ENZYME AMYLASE.....................................................................................5
2.2.1 - amylase ( - 1,4 glucan - 4 - glucanhydrolase) (EC 3.2.1.1).............6
2.2.2 β-amylase (α-1,4-glucan maltohydrolase, EC 3.2.1.2)...............................8
2.2.3 - amylase (
-
1,4 glucan- glucohydrolase, EC 3.2.1.3)......................9
2.2.4 Oligo-1,6- glucosidase..............................................................................10
2.2.5 Pullulanase ................................................................................................11
2.2.6 Transglucosidase.......................................................................................11
4.2 KẾT QUẢ KHẢO SÁT ĐỘNG HỌC CỦA ENZYME α-AMYLASE THỦY
PHÂN NGUYÊN LIỆU NẾP TRẮNG.................................................................26
CHƯƠNG V: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ............................................................30
5.1 KẾT LUẬN .....................................................................................................30
5.2 ĐỀ NGHỊ.........................................................................................................30
TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................31
PHỤ LỤC
Luận văn tốt nghiệp khóa 31 – 2009 Trường Đại Học Cần Thơ
Chuyên ngành Công Nghệ Thực Phẩm – Khoa NN & SHUD Trang
viii
DANH SÁCH BẢNG
Bảng Tên bảng Trang
2.1
2.2
2.3
4.1
4.2
A.1
B.1
B.2
B.3
Thành phần hóa học của nếp
Đặc điểm của α-amylase được trích ly từ các nguồn
khác nhau
Các đặc tính kỹ thuật của enzyme glucoamylase được
trích ly từ các loại nấm mốc khác nhau
Kết quả khảo sát ảnh hưởng của pH và nhiệt độ lên hoạt
tính enzyme α-amylase đối với nguyên liệu nếp trắng
Kết quả khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ nếp trắng lên hoạt
tính enzyme α-amylase
2.8
2.9
2.10
2.11
2.12
4.1
4.2
4.3
4.4
Quá trình hydrat hóa tinh bột trong nước
Cơ chế tác động của enzyme α-amylase trên tinh bột
Cơ chế tác dụng của γ-amylase lên phân tử tinh bột
Tổng quát quá trình thủy phân tinh bột của amylase
Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến hoạt độ enzyme
Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến thời gian phản ứng
Ảnh hưởng của nồng độ enzyme đến tốc độ phản ứng
Ảnh hưởng của nồng độ enzyme đến thời gian phản ứng
Ảnh hưởng của nhiệt độ đến tốc độ phản ứng enzyme
Ảnh hưởng của nhiệt độ đến thời gian phản ứng enzyme
Ảnh hưởng của pH môi trường đến tốc độ phản ứng
Ảnh hưởng của pH đến thời gian thủy phân của enzyme
Đồ thị biễu diễn ảnh hưởng của pH và nhiệt độ lên hoạt tính
enzyme α-amylase đối với nguyên liệu nếp trắng
Đồ thị Michaelis – Menten biễu diễn ảnh hưởng tỷ lệ nếp
trắng sử dụng đến hoạt tính của enzyme α-amylase
Đồ thị biễu diễn sự phụ thuộc 1/V = 1/f([S]) của quá trình
thủy phân tinh bột nếp trắng và nếp than xúc tác bởi
enzyme α-amylase
Đồ thị biễu diễn sự phụ thuộc 1/V = 1/f([S]) của quá trình
thủy phân tinh bột tinh khiết xúc tác bởi enzyme α-amylase
và pH tối thích của enzyme α-amylase có giá trị là 6,5. Trên các nguyên liệu khác nhau
như nếp trắng, gạo, nếp than và tinh bột tinh khiết, giá trị pH tối ưu và nhiệt độ tối ưu của
enzyme α-amylase không khác nhau do trong những nguyên liệu này không có thành phần
nào làm thay đổi điện tích bề mặt của enzyme hoặc làm biến tính protein trong enzyme.
Hằng số K
m
của enzyme α-amylase là 17,0755% và V
max
là 7,3926% trong 30 phút. Hợp
chất màu anthocyanine trong nếp than làm cho ái lực của enzyme α-amylase với nếp trắng
lớn hơn với nếp than. Tỷ lệ amylopectin trong nếp trắng nhiều hơn trong gạo làm cho độ
nhạy của enzyme α-amylase với nếp trắng nhỏ hơn với gạo. Tinh bột tinh khiết rất nhạy
đối với enzyme α-amylase nên K
m
của enzyme α-amylase trên nếp trắng (17,0755%) lớn
hơn rất nhiều so với tinh bột tinh khiết (0,7824%).
Luận văn tốt nghiệp khóa 31 – 2009 Trường Đại Học Cần Thơ
Chuyên ngành Công Nghệ Thực Phẩm – Khoa NN & SHUD Trang
1
CHƯƠNG I: GIỚI THIỆU
1.1 ĐẶT VẦN ĐỀ
Ngày nay, khoa học càng hiện đại, xã hội càng phát triển thì nhu cầu cuộc sống của
con người càng được nâng cao. Con người đòi hỏi xã hội phục vụ cho nhu cầu của
mình phải tiến bộ hơn về mọi mặt cả về vật chất lẫn tinh thần, từ ăn uống, trang
phục, nhà ở đến vui chơi, giải trí… nhưng quan trọng nhất vẫn là vần đề ăn uống
hằng ngày. Trước kia, khi cuộc sống vật chất còn khó khăn con người chỉ cần ăn no,
mặc ấm nhưng ngày nay khi cuộc sống vật chất được cải thiện, con người đòi hỏi ăn
ngon, mặc đẹp, bữa ăn phải đầy đủ những chất dinh dưỡng cần thiết.
Không những thế, truyền thống dân tộc Việt Nam có nhiều những hội hè, đình
đám… Trong những dịp như thế, rượu là một thức uống không thể thiếu. Rượu là
công nghiệp sản xuất rượu. Trong đó, nếp trắng là một loại gạo với hàm lượng
tinh bột trên 70 % được sử dụng rộng rãi trong sản xuất rượu.
Trong phân tử tinh bột bao gồm hai thành phần: amylose và amylopectin. Hai
thành phần này khác hẳn về tính chất hóa học cũng như về tính chất vật lý. Ví dụ:
amylose tạo màu xanh với iod còn amylopectin cho màu tím đỏ, amylose dễ hòa
tan trong nước ấm và tạo nên dung dịch có độ nhớt không cao, còn amylopectin
chỉ hòa tan khi đun nóng và tạo nên dung dịch có độ nhớt cao.
Tinh bột là hỗn hợp của hai loại glucan là amylose và amylopectin. Hầu hết các
loại tinh bột đều chứa từ 20 ÷ 30 % amylose, tinh bột gạo nếp có thành phần gần
như 100 % amylopectin (Hoàng Kim Anh, 2007).
Bảng 2.1: Thành phần hóa học của nếp trắng
Thành phần Hàm lượng (%)
Nước 13
Protein 6.2
Lipid 1.6
Glucid 74
Tro 0.28
(Nguồn: BONS.LUH,1991)
2.1.1 Thành phần amylose và amylopectin
2.1.1.1 Amylose
Amylose là một polymer mạch thẳng cấu tạo từ D-glucose nhờ các liên kết α-1,4.
Quá trình thủy phân amylose có thể thực hiện bằng các enzyme α-amylse, β-
amylase, glucoamylase. Tuy nhiên do trong amylose cũng chứa khoảng 0,1% các
liên kết phân nhánh α-1,6 nên β-amylase không thể thủy phân amylose một cách
hoàn toàn. Trọng lượng phân tử của amylose trong khoảng 10
5
÷ 10
6
.
Độ hòa tan và tính lưu biến
lực của amylose với iodine phụ thuộc tuyến tính với chiều dài của mạch polymer.
Khi chiều dài mạch của amylose giảm, khả năng gắn của polymer với iodine và
bước sóng hấp thụ mạnh nhất cũng giảm (Hoàng Kim Anh, 2007).
2.1.1.2 Amylopectin
Amylopectin là một glucan phân nhánh; trong phân tử amylopectin, ngoài liên kết
α-1,4, tỷ lệ liên kết phân nhánh α-1,6 chiếm khoảng 4%. Trung bình mỗi nhánh của
amylopectin chứa khoảng 15 ÷ 30 gốc glucose. Cấu trúc tinh thể của tinh bột có liên
quan chặt chẽ đến thành phần amylopectin và khả năng tạo các chuỗi xoắn kép.
Amylopectin có phân tử lượng trong khoảng 10
7
đến 10
8
.
Amylopectin cũng có khả năng gắn kết nhất định với iodine. Ở nhiệt độ 20
0
C, khả
năng gắn của amylopectin với iodine chỉ khoảng 0,2% khối lượng và phức hợp với
iodine thể hiện hấp thụ mạnh nhất ở bước sóng 550 nm.
Luận văn tốt nghiệp khóa 31 – 2009 Trường Đại Học Cần Thơ
Chuyên ngành Công Nghệ Thực Phẩm – Khoa NN & SHUD Trang
4
Quá trình thủy phân amylopectin cũng giống như quá trình thủy phân amylose. β-
amylase không thủy phân được các liên kết nhánh α-1,6, phần mạch nhánh còn sót
lại này được gọi là các dextrin giới hạn (limit dextrin).
Khi đun nóng trong nước, amylopectin tạo thành dung dịch trong, đặc, dính và có
độ nhớt cao. Khác với amylose, amylopectin không bị thoái hóa, khả năng tạo gel
cũng kém (trừ khi nồng độ rất cao). Tuy nhiên, dung dịch amylopectin bị giảm độ
nhớt rất nhanh trong môi trường acid, trong quá trình hấp tiệt trùng và khi chịu một
lực cắt lớn (Hoàng Kim Anh, 2007).
2.1.2 Khả năng hấp thụ và sự trương nở của tinh bột
5
Nhiệt độ tăng làm đứt các liên kết kiểu 1, và làm khả năng hấp thụ nước tăng. Nhiệt
độ tăng cao quá sẽ làm đứt tiếp các liên kết hydro kiểu 2. Nói chung quá trình
hydrat hóa tinh bột trong nước gồm các giai đoạn sau:
Hình 2.1: Quá trình hydrat hóa tinh bột trong nước
Nhiệt độ để phá vỡ hạt, chuyển tinh bột từ trạng thái ban đầu có mức độ hydrat hóa
khác nhau thành dung dịch keo gọi là nhiệt độ hồ hóa. Các hạt tinh bột có kích
thước và nguồn gốc khác nhau cũng có nhiệt độ hồ hóa khác nhau. Các hạt nhỏ có
cấu tạo chặt, liên kết hydro kiểu 1 rất bền nên nhiệt độ hồ hóa các hạt nhỏ lớn hơn
các hạt lớn, vì thế nhiệt độ hồ hóa tinh bột (là hỗn hợp các hạt có kích thước khác
nhau) thường không phải là một điểm mà là một khoảng nhiệt độ. Trong quá trình
hồ hóa, độ nhớt tinh bột tăng dần đến điểm cực đại rồi giảm xuống (Hoàng Kim
Anh, 2007).
2.1.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến nhiệt độ hồ hóa tinh bột
Nhiệt độ hồ hóa phụ thuộc vào thành phần amylose và amylopectin. Các ion kim
loại liên kết với tinh bột cũng ảnh hưởng đến độ bền của liên kết hydro bên trong
phân tử tinh bột. Các chuỗi trong mạch tinh bột chứa các ion tích điện trái dấu sẽ
đẩy nhau làm lỏng lẻo cấu trúc tinh bột dẫn đến thay đổi nhiệt độ hồ hóa. Các muối
vô cơ ở nồng độ thấp phá hủy các liên kết hydro nên làm tăng khả năng hòa tan của
tinh bột, tuy nhiên ở nồng độ cao nó gây hiện tượng kết tủa tinh bột và giảm sự
hydrat hóa. Các chất không điện ly như đường, rượu cũng ảnh hưởng đến nhiệt độ
hồ hóa và làm cho nhiệt độ hồ hóa tăng lên (Hoàng Kim Anh, 2007).
2.2 ENZYME AMYLASE
Amylase là một trong những hệ enzyme quan trọng nhất trong ngành công nghệ
sinh học hiện nay do có những ứng dụng hết sức rộng rãi trong công nghiệp thực
phẩm, dược phẩm, công nghệ lên men, công nghiệp dệt và công nghiệp giấy.
Amylase đầu tiên được sản xuất ở quy mô công nghiệp năm 1894, nó có nguồn gốc
từ nấm mốc và được sử dụng như một loại dược phẩm để chữa bệnh về tiêu hóa.
Ngày nay các amylase vi sinh vật đã thay thế thành công acid trong công nghiệp
thủy phân tinh bột. Amylase cũng được sử dụng rộng rãi để đường hóa trong công
glycogen và những polymer khác như pullulanase, exopullulanase, isoamylase
thường được sử dụng kết hợp với β-amylase trong sản xuất siro hay đường glucose
với mục đích tăng hiệu suất thủy phân.
Trong sản xuất rượu người ta thường sử dụng enzyme α-amylase và glucoamylase.
2.2.1 - amylase ( - 1,4 glucan - 4 - glucanhydrolase) (EC 3.2.1.1)
Đặc tính
α-amylase từ động vật và vi sinh vật được hoạt hóa bởi các ion hóa trị I như Cl
-
>
Br
-
> I
-
, α-amylase từ thực vật được hoạt hóa bởi các ion hóa trị II như Ca
2+
. α-
amylase bị kìm hãm bởi các ion kim loại nặng như Cu
2+
, Hg
2+
.
Ion Ca
2+
là một trong những thành phần quan trọng tham gia vào việc hình thành
và ổn định cấu trúc bậc 3 của enzyme α-amylase. Đồng thời, nó còn có vai trò
quan trọng trong việc duy trì sự tồn tại của enzyme α-amylase khi bị tác động của
các tác nhân gây biến tính và tác động của các enzyme thủy phân protein. Nếu
enzyme α-amylase bị mất ion Ca
2+
thì nó bị mất hoàn toàn khả năng thủy phân cơ
3 α-amylase nấm sợi
Aspergillus niger 5,0 - 6,0 80
Dịch malt 3,5 - 6,5 70
4 α-amylase malt
Bột malt 4,5 - 7,0 85
(Nguyễn Đức Lượng, 2004)
α-amylase có nguồn gốc khác nhau có thành aicd amin khác nhau, mỗi loại α-
amylase có một tổ hợp acid amin đặc hiệu riêng, khá giàu tyrosine, tryptophan,
acid glutamic và acid aspartic. Tâm hoạt động chứa các nhóm -COOH, -NH
2
. α-
amylase là một metaloenzyme, trong phân tử đều chứa từ 1 ÷ 30 nguyên tử gam
Ca/mol, song không ít hơn 1 ÷ 6 nguyên tử gam Ca/mol. Khi tách hoàn toàn Ca ra
khỏi enzyme thì α-amylase mất hết khả năng thủy phân cơ chất vì Ca tham gia vào
sự hình thành và ổn định cấu trúc bậc 2,3 của enzyme. Ngoài duy trì cấu hình hoạt
động của enzyme, Ca còn có tác dụng đảm bảo cho α-amylase có độ bền cực lớn
đối với tác động gây biến tính và sự phân hủy bởi các enzyme phân giải protein
(Nguyễn Đức Lượng, 2004).
Cơ chế tác dụng
α-amylase có khả năng phân cắt liên kết -1,4 glycoside ở bất kỳ vị trí nào trên
mạch tinh bột đã được hồ hóa. Do đó α-amylase được gọi là enzyme nội phân
(endoenzyme)
Quá trình th
ủ
y phân này trải qua nhiều giai
đ
oạn:
Giai đoạn đầu (giai đoạn dextrin hóa): chỉ một số cơ chất bị thủy phân nhanh
tạo thành một lượng lớn dextrin phân tử thấp, độ nhớt của hồ tinh bột giảm nhanh.
Giai đoạn 2 (giai đoạn đường hóa): các dextrin phân tử thấp vừa được tạo
2+
, acetanic, iod, ozon. β-amylase chịu nhiệt kém hơn α-amylase nhưng
bền với acid hơn. Enzyme β-amylase bị vô hoạt ở 70
0
C. Nhiệt độ tối thích là 55
0
C
Hình 2.2
Copyright: Tài liệu đại học ©