1
Phần 1.
LỜI NÓI ĐẦU
Enzyme là một chất xúc tác sinh học không chỉ có ý nghóa cho quá trình sinh
trưởng, sinh sản của mọi sinh vật mà nó còn đóng vai trò rất quan trọng trong công
nghệ chế biến thức phẩm, trong y học, trong kỹ nghệ phân tích, trong công nghệ
gen và trong bảo vệ môi trường.
Ngày nay, những nghiên cứu về ứng dụng enzyme trong sản xuất công
nghiệp phát triển rất mạnh. Các hướng nghiên cứu nhằm mục đích tăng khả năng
sử dụng enzyme, kéo dài thời gian, số lần sử dụng enzyme giảm giá thành sử dụng
enzyme. Một trong những bước tiến quan trọng nhất hiện nay là kỹ thuật cố đònh
enzyme trên giá thể tạo ra các dạng enzyme cố đònh (enzyme không hòa tan).
Enzyme cố đònh ở các nước phát triển đã được ứng dụng rộng rãi trong nhiều qui
trình công nghệ như: chế biến thực phẩm, y sinh học và nghiên cứu khoa học. Tuy
nhiên hiện nay việc nghiên cứu và ứng dụng enzyme cố đònh ở Việt Nam chưa
được phổ biến lắm và vẫn còn là hướng phát triển mới mẻ.
Để góp phần vào những nghiên cứu về enzyme cố đònh đồng thời được sự
chấp thuận của bộ môn công nghệ sinh học trường Đại Học Nông Lâm Tp. Hồ Chí
Minh và bộ môn công nghệ sinh học trường Đại Học Bách Khoa Tp. Hồ Chí Minh,
dưới sự hướng dẫn của Th.S Huỳnh Ngọc Oanh, tôi thực hiện đề tài “Cố đònh
enzyme – amylase bằng gel alginate” tại phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học
thuộc trường Đại Học Bách Khoa Tp. Hồ Chí Minh. 2
Phần 2.
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. NHỮNG KHÁI NIỆM CHUNG VỀ ENZYME [2 ]
2.1.1 Khái niệm về enzyme

5. Enzyme luôn luôn được tổng hợp trong tế bào của sinh vật.
6. Có nhiều enzyme không bò mất đi sau phản ứng. Ngày nay, các nhà
khoa học đã tìm ra hơn 1000 loại enzyme khác nhau có trong tế bào sinh vật, số
lượng này là rất nhỏ so với số lượng thật có trong mỗi tế bào.

Dò hóa
ngoài tế bào

Vật chất
có kích thước nhỏ
Tế bào
Vật chất dò hóa ra
khỏi tế bào
Vật chất tổng hợp
ra khỏi tế bào
Môi trường Sinh khối
(sản phẩm bậc 1)
Sản phẩm bậc 2
Hình 2.1 : Hệ thống tổng hợp enzyme trong tế bào sinh vật

Enzym

Vận tốc phản ứng được tính như sau :
SK
S
VV
m
max

Phương trình trên gọi là phương trình Michealis Menten
Trong giai đoạn đầu khi nồng độ cơ chất tăng, tốc độ phản ứng sẽ tăng.
Nhưng khi tốc đố phản ứng đạt giá trò cực đại, cho dù có tăng nồng độ cơ chất, tốc
độ phản ứng cũng sẽ hoàn toàn không có khả năng tăng theo.
Nồng độ cơ chất
Tốc độ
phản ứng
Km 5
b. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính enzyme
Trong các phản ứng hóa học, nhiệt độ càng tăng, tốc độ phản ứng xúc tác
càng tăng. Trong các phản ứng sinh học, nhiệt độ tăng khả năng xúc tác của
enzyme sẽ tăng. Nhưng khả năng tăng của tốc độ phản ứng có một giới hạn nhất
đònh. Quá giới hạn nhiệt độ đó, phản ứng enzyme sẽ giảm và giảm rất nhanh.


Hình 2.4: Ảnh hưởng pH đến hoạt tính enzyme
Mỗi loại enzyme sẽ có khoảng pH tối ưu và điểm pH tối ưu.
pH có ảnh hưởng rất lớn đến trạng thái ion hóa của các nhóm chức trong
trung tâm hoạt động của enzyme, trạng thái ion hóa của cơ chất và phức chất ES.
d. Ảnh hưởng của các chất kìm hãm các hoạt tính enzyme
Hoạt tính của enzyme có thể bò ảnh hưởng bởi những chất kìm hãm. Những
chất kìm hãm là những chất hoa học có khả năng làm giảm hoạt tính hoặc làm
ngưng hoạt tính của enzyme. Các chất kìm hãm thường là những ion, các phân tử
vô cơ, hữu cơ và cả protein.
Các chất chia ra làm 2 loại :
Chất kìm hãm cạnh tranh.
Chất kìm hãm không cạnh tranh.
Chất kìm hãm cạnh tranh : Các chất kìm hãm cạnh tranh có cấu trúc
không gian tương tự cấu trúc không gian của cơ chất. Do đó, chúng có khả năng kết
hợp với enzym, kết quả là enzym không thể kết hợp được với cơ chất để tạo thành
phức chất ES.
pH
Vận tốc
phản ứng
pH op 7


2.2. NHỮNG KHÁI NIỆM CHUNG VỀ ENZYM CỐ ĐỊNH
2.2.1. Khái niệm, đặc điểm của enzym cố đònh
a. Khái niệm enzym cố đònh
Enzym cố đònh (immobilised enzym) hay enzym không hòa tan (insolube
enzym) được hiểu theo cả nghóa hẹp và nghóa rộng.
Theo nghóa hẹp : được hiểu theo Michael Trevan: thuật ngữ enzyme cố
đònh là những enzyme được đưa vào những pha riêng rẽ, pha này được tách riêng
với pha dung dòch tự do. Pha enzyme thường không tan trong nước và được gắn
với những polymer ưa nước có trọng lượng phân tử lớn.

Pha enzyme
// Pha dung dòch tự do
Hình 2.7 : Mô hình hệ thống hai pha của enzym cố đònh
Theo nghóa rộng : Theo Kkaus Mosbach : Các chất xúc tác cố đònh là
các enzyme, tế bào, cơ thể sống ở trạng thái cho phép sử dụng lại. Như vậy theo
nghóa rộng, enzyme không hòa tan bao gồm cả enzyme đã được cố đònh và một 9
chất mang, bao gồm cả enzyme có trong tế bào sống được cố đònh trong các bình
phản ứng sinh học có sự gắn kết vào một chất mang cho phép ta sử dụng nhiều lần.
Enzyme cố đònh thường là những enzyme hòa tan được gắn vào một chất
mang bằng nhiều kỹ thuật khác nhau. Nhờ quá trình gắn này enzyme chuyển từ
trạng thái hòa tan sang trạng thái không hòa tan.
b. Đặc điểm của enzyme cố đònh
Nhờ những tính chất ưu việt do đó ngày nay enzyme cố đònh đang ngày
càng sử dụng rộng rãi trong các lónh vực công nghệ : Những ưu điểm nổi bật của

đònh bằng phương pháp cộng hóa trò thì một lượng đáng kể enzyme bò mất hoạt tính
do chất hoạt hóa và có thể do liên kết không đặc hiệu xảy ra ở trung tâm hoạt động
của enzyme.
2.2.2. Chất mang dùng để cố đònh enzyme
 Theo Michael Trevan, một chất mang lý tưởng cần có những tính chất
sau đây :
+ Chất mang lý tưởng trong sử dụng cố đònh enzyme điều trước hết là
cần phải rẻ. Điều này liên quan đến hiệu quả kinh tế của qui trình công nghệ.
+ Chất mang phải có tính chất cơ lý bền vững, ổn đònh.
+ Về mặt hóa học, chất mang phải bền vững, không tan trong môi trường
phản ứng. Chất mang không được làm mất hoạt tính enzyme.
+ Chất mang phải có tính kháng khuẩn cao, bền vững với sự tấn công
của vi sinh vật.
+ Chất mang phải có độ trương tốt, có diện tích bề mặt tiếp xúc lớn. Tính
chất này của chất mang vừa tăng khả năng cố đònh enzyme vừa tăng khả năng
tiếp xúc của cơ chất với enzyme, nhờ đó làm tăng hoạt tính enzyme cố đònh và
số lần tái sử dụng. 11
+ Chất mang có thể có cấu trúc lỗ xốp, siêu lỗ, có thể sử dụng ở dạng
hạt, dạng màng, dạng phim mỏng …
 Phân loại chất mang :
Tất cả chất mang dùng trong cố đònh enzyme được chia làm 2 nhóm :
Chất mang polymer hữu cơ.
Chất mang vô cơ.
a. Chất mang là polymer hữu cơ
Trong nhóm chất mang là polymer hữu cơ được chia làm 2 nhóm là
polymer tổng hợp và polymer tự nhiên.
 Chất mang là polymer tự nhiên (natural polymer)

đònh tế bào và enzyme. Chitin là một polymer rất phổ biến trong tự nhiên, chỉ
đứng thứ hai sau cellulose, chitin có cấu trúc tương tự cellulose, là polymer của 2
acetomido deoxy D glucose. Chitin tham gia vào thành phần cấu
trúc của vỏ tôm cua, côn trùng, thành tế bào vi sinh vật. Chitosan là dẫn xuất
của chitin khi xử lý bằng kiềm đặc. Chitin, chitosan có cấu trúc siêu lỗ, dễ tạo
màng, tạo hạt, khả năng hấp thụ tốt, tính chất cơ lý bền vững, ổn đònh, thường
được dùng cố đònh enzyme qua cầu nối glutaraldehyde.
Tuy nhiên cả chitin và chitosan đều có một nhược điểm là tính chất kỵ
nước, độ trương kém, diện tích bề mặt tiếp xúc nhỏ. Để khắc phục nhược điểm này,
hiện nay đang có xu hướng ghép copolymer với monomer ưa nước như acrylamide,
acrylic acid, hydroxy ethylmethacrylate.
Hiện nay, cũng có xu hướng chung là các vật liệu tự nhiên được ghép
copolymer với các polymer tổng hợp để cải thiện tính chất cơ lý.
 Chất mang là Protein :
Chất mang là protein thường dùng là getalin, keratin, albumin. Vật liệu
thuộc nhóm này thường dễ tạo màng, tạo hạt, có nhóm chức năng là nhóm NH
2

và vì vậy thường dùng sử dụng nhốt enzyme trong khuôn gel với tác nhân khâu
mạch là glutaraldehyde. Nhóm chất mang này là protein có nhược điểm là thường
kém bền, dễ nhiễm khuẩn.

13
 Chất mang là các polymer tổng hợp :
Hiện nay có rất nhiều polymer tổng hợp được sử dụng làm chất mang cố
đònh enzyme như polyacrylamide, polyester, polyvinilalcohol, polyvinylacetate,
polyacrylic, polyhydroxylethylacrylate, polystyren, polyethylen ghép với vinyl

phẩm diatomic, có tên thương mại là celite. Đây là một vật liệu không đồng nhất,
chứa nhiều ion kim loại, là loại vật liệu rẻ tiền, nhưng có rất nhiều ứng dụng trong
công nghiệp, đặc biệt là trong cố đònh enzyme và trong công nghiệp.
Vật liệu từ tính (magnetic materials) có rất nhiều dạng đã được sử dụng
trong cố đònh enzyme. Burns đã so sánh dạng hạt của vật liệu từ tính với các vật
liệu khác và với sự cải tiến của tổ hợp alginite/ vi hạt từ tính. Alginite thường sử
dụng ở dạng cộng hóa trò vì ligand với enzyme hơn là ở dạng nhốt. Vi hạt
(microphere) của vật liệu alginite/ vi hạt từ tính có tính chất cơ lý tốt, diện tích bề
mặt và độ phân tán tốt, các khả năng cố đònh bằng phương pháp cộng hóa trò cao.
Những ứng dụng của vật liệu này vô cùng phong phú.
2.2.3. Các phương pháp cố đònh enzyme
Hiện nay có 4 phương pháp chính điều chế enzyme cố đònh dựa trên cơ sở
lý hóa học như sau :
– Phương pháp hấp thụ vật lý enzyme lên các vật liệu cố đònh không
hòa tan có mang hoặc không mang điện tích.
– Phương pháp nhốt enzyme ở bên trong polymer tạo thành xung quanh
enzyme một hệ thống lưới có lỗ nhỏ để không cho phân tử enzyme đi khỏi
màng, nhưng các lỗ đủ lớn để cơ chất và sản phẩm tạo ra đi qua được dễ dàng.
– Phương pháp hóa học : liên kết cộng hóa trò và liên lết ion.
– Phương pháp khâu mạch.
a. Phương pháp hấp thụ vật lý (Physical Absortion)
Phương pháp này có ứng dụng rộng rãi, đặc biệt là trong giai đoạn đầu của
việc nghiên cứu enzyme cố đònh. Quá trình thực hiện hấp thụ khá đơn giản : chất 15
hấp thụ và enzyme được trộn lẫn với nhau, ủ một thời gian rồi lọc, rửa phần
enzyme không hấp thụ. Enzyme gắn được trên giá thể nhờ tương tác của các liên
kết yếu như liên kết : ion, kỵ nước, hydrogen và lực Vander Waals. Khả năng hấp
thụ của enzyme phụ thuộc vào các điều kiện môi trường như : nhiệt độ, nồng độ

CK
CKK
m
.1
..
2
21
16
Thời gian tiếp xúc : cho enzyme tiếp xúc với bề mặt của vật liệu cố
đònh, tốc độ hấp thụ phụ thuộc vào đặc tính lý hóa của chất hấp thụ và enzyme.
Kích thước của vật liệu cố đònh : tốc độ hấp thụ càng tăng khi kích
thước càng giảm.
Nhiệt độ : khi nhiệt độ tăng, tốc độ hấp thụ tăng, quá trình hấp thụ xảy
ra rất nhanh chỉ sau vài phút thì enzyme sẽ hấp thụ lên trên bề mặt.
pH : quá cao hoặc quá thấp đều làm giảm khả năng hấp thụ, thông
thường sự hấp thụ tối đa ở pH điểm đẳng điện.
Thành phần môi trường : các chất làm giảm tính hòa tan của enzyme
trong pha nước, sẽ làm tăng khả năng hấp thụ. Như vậy muốn hấp thụ càng
nhiều, càng làm giảm tính hòa tan của enzyme.
b. Phương pháp “nhốt” enzyme (Entrapment Method)
Đây là phương pháp đơn giản, enzyme ít bò biến đổi bởi quá trình cố đònh.
Phương pháp này có thể cố đònh nhiều enzyme cùng một lúc. Giới hạn của phương
pháp này là hạn chế khả năng tiếp xúc giữa enzyme và cơ chất, do đó hoạt tính
enzyme thường thấp, nhất là trong trường hợp cơ chất có trọng lượng phân tử lớn.
Enzyme được bao bọc trong một màng không thẩm thấu đối với enzyme và
các chất có trọng lượng phân tử cao, nhưng lại cho cơ chất và sản phẩm thẩm thấu
qua một cách dễ dàng. Phương pháp này cho phép giữ enzyme trong dung dòch gần

dòch khâu mạch là polyphosphate, K
4
Fe(CN)
6
thường được sử dụng nhốt tế bào và
enzyme.
Protein thường dùng là gelatin, enzym được trộn với gel gelatin sau đó được
khâu mạch trong dung dòch glutaraldehyde hoặc aldehyte collagen là vật liệu
protein có thể dùng để nhốt enzyme trong gel của nó, nhờ khả năng khâu mạch của
gel trong dung dòch khâu mạch glutaraldehyde khi được khâu mạch hạt gel không
tan và ổn đònh cao.
E
E
E
E
E
E 18
 Giới thiệu về gel alginate thương phẩm
Là loại vật liệu thích hợp nhốt enzyme. Phương pháp tạo hạt rất đơn giản. Hỗn
hợp enzyme và alginate được nhỏ xuống dung dòch CaCl
2
để tạo hạt gel bao bọc
lấy enzyme.
Sản phẩm khi hòa tan hoàn toàn trong nước sẽ tạo thành dạng gel liên kết
thành một chuỗi các polyanion với sự sắp xếp của 2 thành phần: mannuronate và
glucuronate có thể là một chuỗi (M M M) (G G G) hoặc có thể đó là (M
G M G). Tỉ lệ cao của glucuronate làm gia tăng sự bền vững của gel.

19
Phương trình phản ứng :
NainateACaCainateANa 2)lg()lg(2
2

 Đặc điểm của gel alginate
Gel alginate có khả năng nhốt một lượng lớn tế bào và enzyme, hiệu suất
nhốt enzyme cao, thao tác và kỹ thuật tiến hành đơn giản.
Hạt gel có kích thước có thay đổi từ 0.5 4mm. Hạt có cấu trúc bền
vững. Để ổn đònh hạt gel có thể cho hạt gel khâu mạch trong dung dòch
glutaraldehyde hoặc các chất khâu mạch khác. Tuy nhiên gel này lại không bền
trong môi trường có phosphate.
 Phương pháp nhốt gel trong hệ sợi
Năm 1972, Dinelli đã tiến hành một thí nghiệm khá độc đáo là nhốt
enzyme trong hệ sợi và những nghiên cứu này được kết thúc năm 1978. Theo kết
quả nghiên cứu của Dinelli, enzyme khi được nhốt vào hệ sợi phát huy khả năng
xúc tác rất tốt.
Phương pháp nhốt enzyme trong hệ sợi có khả năng xúc tác phản ứng tốt
hơn phương pháp nhốt enzyme trong gel. Các sợi sử dụng để nhốt enzyme thường
là sợi nhân tạo. Các loại sợi này có độ bền với acid, kiềm, các loại ion và các loại
dung môi hòa tan. Tính chất trên phụ thuộc rất nhiều vào bản chất hóa học của các
polymer tạo ra loại sợi này.
 Phương pháp tạo vi nang (microcapsule)
Khác với phương pháp nhốt trong gel, ở phương pháp này enzyme được
nhốt trong một màng bán thấm, nhưng cơ chất và sản phẩm dễ dàng đi qua. Vì hoạt
động trong môi trường dung dòch, nên khả năng tiếp xúc giữa cơ chất và enzyme
lớn hơn trong trường hợp nhốt trong khuôn gel. 20

hóa
polymer
polymer 21
 Nhược điểm
Enzyme có thể bò mất hoạt tính vì cấu trúc của enzyme bò thay đổi do quá
trình liên kết.
Giảm khả năng tiếp xúc giữa enzyme và cơ chất do đó làm giảm hoạt
tính enzyme cố đònh.
Vật liệu cố đònh không tái sử dụng được, phương pháp này áp dụng cho
các enzyme ổn đònh hoạt tính khi cố đònh.
 Enzyme cố đònh có thể tạo ra bằng hai cách
– Nối đồng hóa trò liên kết các phân tử enzyme riêng biệt lại thành một
liên hợp cao phân tử không hòa tan. Đây là phương pháp không sử dụng chất mang.
Các phân tử enzyme sẽ liên kết với nhau qua các cầu nối trung gian để trở thành
dạng không hòa tan. Các cầu nối trung gian thường dùng là glutaraldehyte.
– Kết hợp phân tử enzyme với vật liệu cố đònh không hòa tan bằng liên
kết cộng hóa trò.
Điều chế các enzyme cố đònh loại 1, khi dùng các tác nhân lưỡng chức như
bisdiazobenzidin, bisdiazobenzidin, 2,2’ disulfur acid và một số hợp chất khác. Đặc
biệt người ta thường dùng glutaraldehyte làm tác nhân để đính các phân tử enzyme
lại với nhau.
Các enzyme cố đònh loại 2 thường được điều chế phổ biến hơn. Chất mang để
cố đònh enzyme phải thỏa mãn những đòi hỏi nhất đònh sau :
Có độ hòa tan thấp và bền vững đối với các tác động cơ học và hóa học
nhất đònh …
Không gây tác dụng kìm hãm đến enzyme.
Không tạo ra hiện tượng hấp thụ không đặc hiệu đối với các protein.

] 23

NH C
O
O OH
N CNOH

OH
OH

CNBr + ENZYME + ENZYME

OH
ENZYMENHCO
NH

OH
ENZYMENHCO
O

 Hoạt hóa bằng ethyl chloroformate :


R'
N
C CO
NH OHOC
O
ENZYMR'NCNR
R

 Hoạt hóa bằng glutaraldehyde
Các chất mang có chứa nhóm NH
2
như polyacrylamide,chitin, chitosan,
cellulose, tinh bột ghép acrylamide đều có thể sử dụng phương pháp này.
Glutaraldehyde là chất có chứa hai nhóm aldehyde hoạt hóa. Một nhóm sẽ gắn
với NH
2
của chất mang, nhóm còn lại sẽ gắn vào NH
2
của enzyme.
OCH
CH
CH
CH
OCH
2


CH

 Hoạt hóa bằng 3 aminopropyltriethoxysilane
Hoạt hóa bằng trialkoxysilane cho phép hoạt hóa những vật liệu trơ như
thủy tinh có thể gắn với enzyme. Thực hiện như sau :
ENZYM
+ ENZYM 25
232
232
NH)Si(CHO)H(C
NH)(CHSiOSiO
O O
NH)(CHSiOSiO
O
OHSiO
O
OHSiO
O
2323522
CClSNCS)(CHSiOSiO
O O