Tp chớ Khoa hc v Phỏt trin 2011: Tp 9, s 1: 62 - 67 TRNG I HC NễNG NGHIP H NI
62
ứng dụng một số kỹ thuật trong chẩn đoán v phân lập virus
gây hội chứng rối loạn sinh sản v hô hấp trên lợn nái
Application of Some Techniques to Diagnose and Isolate Porcine Reproductive and
Respiratory Syndrome Virus from Sows
Nguyn Th Lan, Nguyn Th Hoa, Tiờu Quang An
Trng i hc Nụng nghip H Ni
a ch email tỏc gi liờn lc:
TểM TT
RK thut bnh lý v húa min dch t chc ó c s dng phỏt hin virus cú trong 5 ln nỏi
b nghi mc hi chng ri lon sinh sn v hụ hp (Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome-
PRRS). Sau ú, cỏc mu bnh phm gm: phi, hch phi, t cung t cỏc ln nỏi ú ó c s
dng phõn lp virus trờn dũng t bo Marc 145. Cỏc chng virus PRRS gõy bnh cho ln nỏi Vit
Nam phỏt trin tt trờn mụi tr
ng t bo Marc 145 v gõy nờn bnh tớch t bo, bnh tớch t bo xut
hin sau 48 gi gõy nhim.
RT khúa: Hi chng ri lon sinh sn v hụ hp (PRRS), ln nỏi, phõn lp, virus.
SUMMARY
RPathological and immunohistochemical techniques were applied to detect target virus from 5 sows
infected with PRRS (Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome). After that, samples of lung,
pulmonary lymphnode and uterus of the above sows were used for isolation of PRRS virus in Marc 145
cell line. It was found that the virus causing PRRS in sows in Viet Nam could be isolated and grew well in
Marc 145 cell line with cito pathogenic effect (CPE) observed 48h after inoculation in all samples.
RKey words: Isolation, Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome (PRRS), sows, virus.
R1. ĐặT VấN Đề
RHiện nay, ngnh chăn nuôi nớc ta đang
ngy cng đợc chú trọng phát triển v giữ
một vị trí quan trọng trong nền kinh tế quốc
dân, trong đó, chăn nuôi lợn đã trở thnh
nguồn thu nhập chủ yếu đối với nhiều hộ

Vì vậy, môi trờng tế bo Marc 145 đã
đợc sử dụng để tiến hnh phân lập virus
PRRS trên từ các lợn nái mắc bệnh đợc
chẩn đoán bằng các kỹ thuật bệnh lý v hoá
miễn dịch nhằm cung cấp thông tin cho các
nghiên cứu sâu hơn về PRRSV góp phần vo
việc sản xuất kít chẩn đoán v chế vacxin
phòng bệnh.
2. NGUYÊN LIệU - PHƯƠNG PHáP
NGHIÊN CứU
2.1. Nguyên liệu
- Các lợn nái nghi mắc PRRS (đợc mổ
khám v lấy mẫu ở các phủ tạng nh phổi,
hạch phổi, tim, gan, lách ).
- Tế bo Marc 145 đợc nuôi cấy trên các
đĩa lồng.
- Hoá chất, dụng cụ sử dụng trong kỹ
thuật lm tiêu bản bệnh lý, kỹ thuật hoá mô
miễn dịch v kỹ thuật nuôi cấy tế bo.
2.2. Phơng pháp nghiên cứu
- Sử dụng các phơng pháp thí nghiệm
thờng quy trong phòng thí nghiệm bệnh lý
nh phơng pháp mổ khám, phơng pháp
lm tiêu bản bệnh lý v các kỹ thuật mới
nh phơng pháp hóa mô miễn dịch, phơng
pháp phân lập virus.
+ Phơng pháp hóa mô miễn dịch
(Immunohistochemistry - IHC): cho phép
chẩn đoán chính xác lợn mắc PRRS. Mẫu
bệnh phẩm sau khi đợc cắt thnh tiêu bản

0
P
C trong 1 giờ v rửa lại tiêu
bản. Gắn cơ chất, ngâm tiêu bản trong dung
dịch DAB (3,3'-diaminobenzidine) khoảng 3-
8 phút. Tiến hnh nhuộm nhân tế bo bằng
Hematoxylin, lm sạch v gắn baume
Canada, quan sát kết quả trên kính hiển vi
quang học.
+ Phơng pháp phân lập virus gồm 3 bớc:
Bớc 1 chuẩn bị tế bo phân lập: Tế bo
Marc 145 đợc đa vo nuôi cấy trong môi
trờng v điều kiện thích hợp, môi trờng
DMEM (Dulbeccos Modified Eagle Medium)
có bổ sung 10% FBS (Fetal bovine serum)
lm ấm trong tủ 37
P
o
P
C trong 30 phút trớc
khi lấy tế bo mọc vừa kín đáy đĩa lồng thì
tiến hnh gây nhiễm virus.
Bớc 2 chuẩn bị mẫu phân lập: Mẫu
bệnh phẩm đợc nghiền nát bằng chy v cối
vô trùng sau đó đợc đồng nhất trong dung
dịch DMEM. Ly tâm tốc độ cao thu lại hỗn
dịch. Hỗn dịch đồng nhất qua lọc đợc lấy để
gây nhiễm vo tế bo Marc 145.
Bớc 3 gây nhiễm virus v quan sát kết
quả: Từ các đĩa lồng tế bo đã chuẩn bị ở

từ những lợn nái ở các địa phơng khác nhau
có các dấu hiệu đặc trng của PRRS nh: phát
ban, khó thở, có nhử mắt, tím tai, sảy thai,
viêm vú mất sữa, nghiên cứu ny đã chọn 5
lợn nái có bệnh tích điển hình để nghiên cứu
tiếp. Các biến đổi bệnh lý của lợn nái mắc
PRRS tập trung chủ yếu ở phổi, hạch lâm ba
(HLB) v tử cung (Bảng 1 v 2; các hình 1, 2,
3, 4). Bên cạnh đó, các bệnh tích ở lách, thận
v một số cơ quan khác l không đặc trng v
phụ thuộc vo tình trạng, diễn biến của bệnh
cũng nh sự kế phát của các bệnh khác.
Nguyn Th Lan, Nguyn Th Hoa, Tiờu Quang An
64
RBảng 1. Bệnh tích đại thể chủ yếu của 05 lợn nái mắc PRRS
C quan
STT Tờn
Phi viờm HLB sng
Thn xut
huyt
Lỏch nhi
huyt
C tim
nhóo
T cung
viờm
1 Nỏi mang thai 1-N1 +++ ++ - - - +++
2 Nỏi mang thai 2-N2 ++++ +++ +++ - ++ ++++
3 Nỏi nuụi con 1-N3 ++++ +++ +++ ++ +++ ++
4 Nỏi nuụi con 2-N4 +++ ++ ++ ++ - ++

vỏch t nỏt
- Cu thn viờm,
lũng ng rng cú
tr trong
- Niờm mc t
cung t nỏt
4 N4 - Ph qun ph viờm - Xut huyt
- Thoỏi hoỏ v
ho
i t
- Xoang bao man
gión rng
- Thõm nhim t
bo viờm
5 N5
- K phi tng sinh t bo
x
- Xut huyt - Xut huyt
- T bo thn b
thoỏi hoỏ, hoi t
- Khụng cú bin
i vi th Hình 1. Phổi viêm Hình 2. Thận xuất huyết
trúc hạt virus, vì thế virus hấp thụ v thực
hiện quá trình nhân lên chỉ trong tế bo ny
v phá huỷ nó (Hình 5 v 6).
3.3. Kết quả phân lập PRRSV trên môi
trờng tế bo Marc145
5 lợn có các biểu hiện lâm sng đặc trng
của PRRS sau khi đợc tiến hnh mổ khám,
lấy mẫu, bảo quản, lm tiêu bản vi thể v lm
hoá miễn dịch xác định sự có mặt của virus,
nghiên cứu đã tiến hnh phân lập virus trên
môi trờng tế bo Marc 145 (Bảng 4).
Bệnh tích tế bo của virus PRRS đợc
biểu hiện l các tế bo co cụm lại với nhau,
chồi lên khỏi đáy bình nuôi cấy v khi tế bo
bị virus phá hủy hon ton thì bong khỏi đáy
bình, có thể quan sát rất rõ hình thái bệnh
tích ny bằng mắt thờng. Tuy nhiên, thể
CPE ny cũng rất dễ nhầm lẫn với những tế
bo bị chết theo cơ chế Apoptosis nếu không
quan sát kỹ. Để quan sát chính xác hơn cũng
có thể dùng kính hiển vi điện tử quét để
quan sát sự thay đổi hình thái tế bo.
Trong tổng số 13 mẫu tiến hnh phân
lập virus của 5 lợn nái mắc PRRS, 10 mẫu có
bệnh tích tế bo ở mức độ khác nhau, 3 mẫu
không có bệnh tích tế bo. Nh vậy, sự có
mặt của virus ở các cơ quan, bộ phận của lợn

tế bo dơng tính với virus PRRS (Hình 7 v 8).
RBảng 3. Kết quả nhuộm hoá mô miễn dịch
Phi Hch phi T cung
STT Kớ hiu
Block 1 Block 2 Block 1 Block 2 Block 1 Block 2
1 N1 + + + + + +
2 N2 + + - + + +
3 N3 + + + + - -
4 N4 - + + + - -
5 N5 - + - + - -
+ Cú virus - Khụng cú virus
Nguyễn Thị Lan, Nguyễn Thị Hoa, Tiêu Quang An
66

H×nh 5. Virus tËp trung ë phæi H×nh 6. Virus tËp trung ë h¹ch phæi
RB¶ng 4. KÕt qu¶ ph©n lËp virus PRRS trªn m«i tr−êng tÕ bμo Marc 145
CPE (Cytopathology effect)
STT Kí hiệu Bệnh phẩm
36h* 48h 60h 72h 84h
Phổi - 10%** 70% 100%
Hạch phổi - 5% 60% 80% 100%
1 N1
Tử cung - - - - -
Phổi - 10% 75% 100%
Hạch phổi - - - - -
2 N2
Tử cung - 5% 60% 80% 100%
Phổi - 15% 90% 100%
3 N3
Hạch phổi - - - - -

thảo Hội chứng rối loạn hô hấp - sinh sản
v bệnh liên cầu khuẩn ở lợn, Trờng Đại
học Nông nghiệp H Nội.
Nguyễn Hữu Nam, Nguyễn Thị Lan (2007).
Hội chứng rối loạn hô hấp v sinh sản,
Hội thảo Hội chứng rối loạn hô hấp - sinh
sản v bệnh liên cầu khuẩn ở lợn, Trờng
Đại học Nông nghiệp H Nội.
Benfield D.A., Nelson E., Collins J.E., Harris L.,
Goyal S.M., Bobinson D., Christianson T.T.,
Morrison R.B., Gorcyca D., Chladek D.,
(1992). Characterization of swine infertility and respiratory syndrome (SIRS) virus
(isolate ATCC VR2332). Journal of
Veterinary Diagnostic Investigation 4, pp.
127133.
Lunney J.K., Benfield D.A., Rowland R.R.,
(
T2010)T. HTPorcine reproductive and
respiratory syndrome virus: An update on
an emerging and re-emerging viral
disease of swine.
TH TJournal of Virus
Research 7, pp. 286
TT. Oct 14.T
Murakami Y, Kato A. (1994). Isolation and
serological characterization of Porcine
Reproductive and Respiratory Syndrome