Mục lục


Đề tài “Tìm hiểu về Bromelain enzyme, chiết
suất và ứng dụng”
i
Mục lục
MỤC LỤC
Mục lục
Danh mục bảng iii
Danh mục hình iv
Lời mở đầu 1
CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU TỔNG QUAN 2
1.1 Đặc điểm nguồn nguyên liệu 2
1.2 Enzyme 3
1.2.1 Phân loại 3
1.3 Enzyme Bromelain 3
1.3.1 Cấu tạo hóa học 4
1.3.2 Cấu trúc không gian 4
1.3.3 Tính chất vật lý 5
1.3.4 Hoạt tính của Bromelain 5
a. Hoạt tính phân giải 5
b. Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính Bromelain 6
CHƯƠNG 2: NHỮNG ỨNG DỤNG CỦA ENZYME BROMELAIN 8
2.1 Ứng dụng trong y dược 8
2.1.1 Bromelain giảm thiểu viêm xoang 8
2.1.2 Bromelain làm liền sẹo 9
2.1.3 Bromelain giảm đau nhức do hư khớp 9
2.1.4 Bromelain làm tăng hệ miễn dịch 9
2.1.5 Bromelain và bệnh hen suyễn 9
2.1.6 Bromelain và HIV 9

DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1 Những tính chất vật lý của Bromelain thân 5
Bảng 1.2 Hoạt tính phân giải casein của Bromelain 6
Bảng 1.3 Hoạt tính phân giải Benzoyl – L – Arginine amide của Bromelain 6

iii
Danh mục hình
DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1 Cấu trúc sợi hydrate carbon của Bromelain 4
Hình 2.1 Dược phẩm Bromelain có hoạt lực cao (1200 gdu/g hay 1800mcu/g) 12
Hình 2.2 Dược phẩm chức hàm lượng Bromelin cao 12
Hình 2.3 Thực phẩm chức năng gồm tinh chất Bromelain và Curcumin 12
Hình 2.4 Quercetin & Bromelain: Thuốc giúp bệnh Gút 12
Hình 2.5 Medizym: chống viêm, liền sẹo 12
Hình 2.6 Dứa enzyme: Complex – 800 GDU 12
Hình 3.1 Lọc cross - flow 13
Hình 3.2 Kiểu một bước 14
Hình 3.3 Kiểu lô 14
Hình 3.4 Kiểu thể tích không đổi 15
Hình 3.5 Quy trình thu nhận enzyme Bromelain 17
Hình 3.6 Cấu tạo của kaolin 18
iv
Lời mở đầu
LỜI MỞ ĐẦU
Ngày nay với sự tiến bộ và phát triển không ngừng của khoa học thì nhu cầu về sản
phẩm của Khoa học Công nghệ ngày càng cao, đặc biệt là công nghệ enzyme. Việc
sản xuất enzyme từ các nguồn động, thực vật và vi sinh vật có vai trò quan trọng vì
được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau như công nghiệp và đời sống, đặc
biệt có thể giúp cải tiến được nhiều quy trình chế biến, nâng cao chất lượng, hạ giá
thành sản phẩm, rút ngắn thời gian sản xuất và đáp ứng được những nhu cầu như an

phía Bắc, các giống Queen Long An, Kiên Giang ở các tỉnh Đồng bằng sông Cửu
Long (còn gọi là khóm hoặc thơm). Dứa thuộc nhóm này có quả tương đối nhỏ, mắt
lồi. Thịt quả vàng đậm, giòn, hương thơm, vị chua và ngọt lâu. Nhóm này có chất
lượng cao nhất, trên thế giới thường dùng để ăn tươi.
- Nhóm Spanish còn gọi là dứa Tây Ban Nha, dứa ta. Nhóm này được trồng ở
Thailand, Cuba… Quả dứa thuộc nhóm này lớn hơn dứa Queen, mắt sâu. Thịt quả
vàng nhạt, có chỗ trắng, vị chua ít thơm nhưng nhiều nước hơn dứa hoa. Dứa nhóm
này chịu bóng râm, ít dập nát khi vận chuyển và hàm lượng đường thấp nên không
được phát triển.
2
Chương 1: Giới thiệu tổng quan
1.2 Enzyme
- Trong cơ thể sống (các tế bào) luôn luôn xảy ra quá trình trao đổi chất. Sự
trao đổi chất mà ngừng lại thì sự sống sẽ không còn tồn tại. Quá trình trao đổi của
một chất là tập hợp của rất nhiều các phản ứng hóa học phức tạp. Enzyme là hợp
chất protein xúc tác cho các phản ứng hóa học đó. Chúng có khả năng xúc tác đặc
hiệu các phản ứng hóa học nhất định và đảm bảo cho các phản ứng xảy ra theo một
chiều hướng nhất định với tốc độ nhịp nhàng trong cơ thể sống.
- Enzyme có trong hầu hết các loại tế bào của cơ thể sống. Chính do những tác
nhân xúc tác có nguồn gốc sinh học nên enzyme còn được gọi là các chất xúc tác
sinh học (biocatalysators) nhằm phân biệt với các chất xúc tác hóa học.
- Chúng là chất xúc tác sinh học không chỉ có vai trò quan trọng trong quá
trình sinh trưởng, phát triển của mọi sinh vật mà nó còn giữ vai trò rất quan trọng
trong các lĩnh vực khác như: công nghệ chế biến thực phẩm, trong kỹ thuật phân
tích, trong công nghệ gen vào bảo vệ môi trường, đặc biệt là trong y học với ứng
dụng sản xuất dược phẩm.
1.2.1 Phân loại
- Ngày nay ngày càng nhiều enzyme mới được phát hiện, và để thống nhất tên
gọi enzyme người ta đã phân tất cả enzyme làm 6 loại:
Oxidoreductase: là nhóm enzyme xúc tác cho phản ứng oxy hoá khử.

1.3.1 Cấu tạo hoá học
- Bromelain thân là một protease nhưng nó khác với các protease thực vật khác
như papain, ficin ở chỗ nó là một glycoprotein, mỗi phân tử có glycan gồm 3
manose, 2 glucosamine, 1 xylose, và 1 fructose
[1]
.
- Các nghiên cứu ghi nhận, polypeptide của bromelain thân có acid amin đầu –
NH
2
là valine và đầu carboxyl là glycine; còn đối với bromelain quả, acid amin đầu
–NH
2
là alanine
[1]
.
OH
OH
OH
OH
OH
OH
OH
OH
OH
OH
OH
CH OH
2
CH OH
2

polypeptide liên kết với nhau bằng cầu nối - S – S Phân tử có dạng hình cầu do có
cách sắp xếp phức tạp.
- Trong phân tử bromelain thân có chứa nhóm sulfurhydryl có vai trò chủ yếu
trong hoạt tính xúc tác và trong mỗi phân tử có tất cả 5 cầu nối disulfite. Ngoài ra,
trong phân tử còn có các ion Zn
2+
có lẽ có vai trò trong duy trì cấu trúc không gian
của enzyme.
1.3.3 Tính chất vật lí
- Murachi và cộng sự năm 1964 đã nghiên cứu về tính chất vật lý của enzyme
bromelain trích từ thân cây dứa và thấy như sau:
Bảng 1.1 Những tính chất vật lý của bromelain thân
Tính chất Ký hiệu Số liệu
Hằng số sa lắng S (s) 2.73
Hằng số khuếch tán D (cm
2
/ s) 7.77 x 10
-7
Thể tích riêng phần V (ml/g) 0.743
Độ nhớt bên trong [ I ] (dl/g) 0.039
Tỷ số ma sát f / f
o
1.26
Điểm đẳng điện pI 9.55
Sự hấp thu A
1%
cm
ở 280nm 20.1
Trọng lượng phân tử
32.000

Cơ chất
Hoạt tính phân giải BAA ( UI/mg)
Bromelain thân Bromelain quả xanh Bromelian quả chín
BAA 3.7 9.1 7.2
- Qua bảng trên ta thấy bromelain quả xanh có hoạt tính phân giải BAA cao
hơn bromelain thân và quả chín.
b. Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính bromelain
- Giống như các loại chất sinh học khác, bromelain cũng bị ảnh hưởng bởi các
yếu tố như: cơ chất, nồng độ cơ chất, nồng độ enzyme, nhiệt độ, pH, ion kim loại,
một số nhóm chức, phương pháp ly trích, phương pháp tinh sạch, phương pháp tinh
khiết
- Các yếu tố như nhiệt độ, pH thích hợp cho hoạt động của các phản ứng xúc
tác của bromelain không ổn định mà phụ thuộc lẫn nhau và phụ thuộc vào các yếu tố
khác như: bản chất cơ chất, nồng độ cơ chất, nồng độ enzyme, sự có mặt của các
chất hoạt hóa…
 Ảnh hưởng của pH: pH là yếu tố quan trọng nhất ảnh hưởng đến hoạt tính xúc
tác của enzyme, pH tối thích của bromelain không ổn định mà tuỳ thuộc vào nhiệt
độ, thời gian phản ứng, bản chất và nồng độ cơ chất, độ tinh sạch enzyme…Ví dụ:
Khi thu thập bromelain thân, nếu dùng tác nhân kết tủa là (NH
4
)
2
SO
4
thì enzyme có
hoạt tính cao nhất ở pH = 4.8, ổn định ở pH = 4.6 - 5.4. Bromelain đã được tinh sạch
một phần có hoạt tính cao nhất ở pH = 6.0 và pH = 8.0, ổn định ở pH = 3.5 – 5.6
với nhiệt độ 63
º
C. Bromelain có biên độ pH rộng (3 -10), tốt nhất là pH = 5 – 8 tuỳ

- Hiện nay, việc sản xuất chế phẩm enzyme các loại đã và đang phát triển
mạnh mẽ trên qui mô công nghiệp. Thực tế đã có hàng ngàn chế phẩm enzyme bán
trên thị trường thế giới, các chế phẩm này đã được khai thác và tinh chế có mức độ
tinh khiết theo tiêu chuẩn công nghiệp và ứng dụng. Các chế phẩm enzyme phổ biến
như amylase, protease, catalase, cellulase, lipase, glucoseoxydase…
- Chế phẩm enzyme không chỉ được ứng dụng trong y học mà còn được ứng
dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau, như trong công nghiệp thực phẩm, dệt may,
thuộc da…
2.1 Ứng dụng trong y dược
- Enzyme có một vị trí quan trọng trong y học. Đặc biệt là các phương pháp
định lượng và định tính enzyme trong hóa học lâm sàng và phòng thí nghiệm chẩn
đoán. Do đó, hiện nay trong y học đã xuất hiện lĩnh vực mới gọi là chẩn đoán
enzyme, có nhiệm vụ:
 Phân tích xác định nồng độ cơ chất như glucose, ure, cholesterol… với sự hỗ
trợ của enzyme.
 Xác định hoạt tính xúc tác của enzyme trong mẫu sinh vật.
 Xác định nồng độ cơ chất với sự hỗ trợ của thuốc thử enzyme đánh dấu.
- Ngoài ra còn dùng enzyme làm thuốc, ví dụ protease làm thuốc tắc nghẽn tim
mạch, tiêu mủ vết thương, làm thông đường hô hấp, chống viêm, làm thuốc tăng
tiêu hóa protein, thành phần của các loại thuốc dùng trong da liễu và mỹ phẩm…
- Trong y học các protease cũng được dùng để sản xuất môi trường dinh dưỡng
để nuôi cấy vi sinh vật sản xuất ra kháng sinh, chất kháng độc… Ngoài ra người ta
còn dùng enzyme protease để cô đặc và tinh chế các huyết thanh kháng độc để chữa
bệnh.
2.1.1 Bromelain giảm thiểu viêm xoang
- Ở Đức, trẻ em bị viêm xoang thường được chữa trị bằng bromelain chiết xuất
từ dứa, và thấy cho kết quả tốt, nó làm giảm thời gian trị bệnh (từ 8 ngày xuống còn
6 ngày)
- Bromelain còn được dùng làm thuốc tấy giun, một loại giun nhỏ thường gặp ở
trẻ em. Qua nghiên cứu của Hordegen.P thì bromelain cũng cho kết quả tốt như

giảm miễn dịch (HIV) cần một enzyme hoạt hóa protease (protein-digesting
enzymes) để sao chép ngược để cô đọng nhân protein để nhân bội virus. Thuốc điều
trị HIV/AIDS theo cơ chế ức chế protein-digesting enzymes này gọi là protease
inhibitor hay anti-protease khá hữu hiệu nhưng rất đắc tiền và cũng gây nhiều phản
ứng phụ. Các nhà khoa học đã tập trung nghiên cứu các hợp chất thiên nhiên có khả
năng ức chế protease HIV và đã tìm thấy 19 hợp chất thiên nhiên có tác dụng tương
tự thuốc anti protease, trong đó bromelain trong dứa được coi là có giá trị nhất và có
thể ăn, uống để điều trị HIV/AIDS.
9
Chương 2: Những ứng dụng của enzyme Bromelain
2.2 Ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm
2.2.1 Bromelain làm mềm thịt
Enzyme Bromelain: có tác dụng thủy phân chất đạm, nghĩa là nó phân cắt
protein thành các acid amin dễ tiêu hóa. Để cho thịt bò, thịt trâu… trở nên mềm
thường phải nấu sôi hàng giờ. Nhưng nếu trước khi nấu ta ướp (trộn) thịt với thơm
bằm (hay đu đủ bằm) độ 20-30 phút thì chỉ cần nấu lửa riu riu cho đến sôi lên là thịt
mềm ngay rất dễ tiêu hóa hấp thu
2.2.2 Bromelain sử dụng trong quá trình đông tụ sữa
Để chế biến các sản phẩm từ sữa người ta thường dùng renin. Renin là enzyme
làm đông tụ sữa truyền thống. Tuy nhiên, lượng renin sản xuất chưa đáp ứng đủ nhu
cầu trong sản xuất sữa. Gần đây người ta sử dụng enzyme thực vật vào trong chế
biến sữa và đang được nghiên cứu. Trong đó, enzyme Bromelain đang được quan
tâm với mục đích này.
2.2.3 Bromelain trong chế biến thủy sản
Trong sản xuất nước mắm thì thời gian chế biến thường dài và hiệu suất thủy
phân độ đạm không cao nên hiện nay người ta chú ý đến qui trình sản xuất nước
mắm ngắn ngày có enzyme Bromelain sẽ giúp thời gian sản xuất nước mắm được
giảm bớt và cải thiện được hương vị của nước mắm.
2.3 Ứng dụng trong công nghiệp dệt may
Trong sản xuất tơ tằm, người ta dùng protease để làm sạch sợi tơ. Với công

lượng Bromelin cao
Hình 2.4 Quercetin & Bromelain:
Thuốc trị bệnh Gút
Hình 2.3 Thực phẩm chức năng gồm
tinh chất Bromelain và Curcumin
Hình 2.5 Medizym:
chống viêm, liền sẹo
Hình 2.6 Dứa Enzyme
Complex - 800 GDU
12
Chương 3: Các phương pháp thu nhận và tinh sạch enzyme Bromelain
CHƯƠNG 3
CÁC PHƯƠNG PHÁP THU NHẬN VÀ TINH SẠCH
ENZYME BROMELAIN
3.1 Các phương pháp thu nhận enzyme Bromelain
3.1.1 Phương pháp siêu lọc
- Siêu lọc là quá trình dung dịch lỏng chảy qua một màng lọc dưới một áp suất
để tách phân đoạn các thành phẩm trong chất lỏng đó. Sự phân chia các phân đoạn
phụ thuộc vào kích thước lỗ trên màng và tùy theo trọng lượng phân tử của chất
thấm qua. Tùy theo kích thước của lỗ trên màng mà sau khi thực hiện quá trình siêu
lọc sẽ thu được nước và những chất có phân tử nhỏ còn những chất có phân tử lớn
sẽ bị giữ lại trên màng.
- Dung dịch enzyme thu được từ nguyên liệu thực vật sẽ có chứa những tạp
chất có trọng lượng phân tử khác nhau. Đầu tiên sẽ sử dụng phương pháp lọc để loại
trừ các chất bẩn. Sau đó chuyển sang phương pháp siêu lọc thì sẽ loại được các chất
có trọng lượng phân tử thấp hơn các protein, enzyme và đồng thời cô đặc được
enzyme.
- Màng siêu lọc được cấu tạo bởi các sợi rỗng. Trong mỗi sợi rỗng lại có nhiều
lỗ rỗng xếp song song và gắn chặt với lớp ngoài tạo thành những lỗ để các chất
thấm qua. Các sợi này được chế tạo từ các lọai polime bền như fluoropolime (FS:

- Kiểu một bước (single pas operation)
Hình 3.2: Kiểu một bước
- Kiểu lô (batch operation): Chất lỏng được tuần hoàn qua màng đến nồng độ của
dịch cô đặc ở trong chậu chứa đạt được như yêu cầu .
Hình 3.3: Kiểu lô
- Kiểu thể tích không đổi (constant volume operation): Dòng chất lỏng được cung
cấp liên tục để thể tích ở trong chậu chứa không thay đổi và chất lỏng được tuần
hoàn qua màng đến nồng độ dung dịch cô đặc ở trong chậu chứa đạt được như yêu
cầu.
14
Chương 3: Các phương pháp thu nhận và tinh sạch enzyme Bromelain
Hình 3.4: Kiểu thể tích không đổi
c. Những thuận lợi của phương pháp siêu lọc
- Có thể lựa chọn màng thích hợp với từng mục đích cụ thể.
- Đối với enzyme: enzyme có thể cô đặc 25 lần mà không bị mất hoạt tính.
- Quá trình siêu lọc vừa làm cô đặc, vừa tinh sạch được enzyme. Trong quá
trình thực hiện nếu thêm nước vào thì độ tinh sạch của enzyme càng cao.
- Trong quá trình siêu lọc, nhiệt độ cao có thể làm mất hoạt tính của enzyme,
do đó nhiệt độ 10 - 20
º
C được xem là khoảng nhiệt độ thích hợp nhất cho năng suất
cao mà không làm mất hoạt tính enzyme. Quá trình siêu lọc có thể thực hiện tốt ở
nhiệt độ thấp (5
º
C).
3.1.2 Phương pháp kết tủa
- Nguyên tắc: Dựa trên tính hoà tan. Điểm đẳng điện của đa số protein thấp
hơn pH = 7 do đó trong điều kiện sinh lý, các phân tử protein có thừa điện tích âm
đã kết hợp với các đầu mang điện tích dương của phân tử nước lưỡng cực, cũng như
các ion dương khác có trong dung dịch. Sự kết hợp với nước tạo ra một lớp nước

- Hiện nay người ta kết tủa enzyme bromelain bằng CMC (carboxyl methyl
cellulose) do enzyme thu được có độ tinh khiết cao, thời gian đợi kết tủa ngắn và
tiến hành thuận lợi hơn.
- Quá trình tạo ra CMC
[4]
:
Vải màn Alkalicellulose
ClCH
2
COOH
NaOH
Carboxylmethylcellulose
(CMC)
16
Xay nhuyễn Rửa sạch

Bã

Dịch ép

Ly tâm
Ly tâm lạnh
Kết tủa
Bromelain

Sấy đông khô

Lọc
Dịch ly tâm
Tác nhân kết tủa

3.2.1 Phương pháp thẩm tích
Tiến hành:
- Cân 1g enzyme thô.
- Dung dịch đệm sử dụng là 10ml dung dịch Na
3
PO
4
0,03M có pH = 7.2.
- Cho protein vào túi cellophane rồi tiến hành thẩm tích trong 6h và cứ sau 2h
thay thế dung dịch đệm bên ngoài 1 lần. Dung dịch đệm phía ngoài túi được khuấy
liên tục bằng 1 máy khuấy từ, cuối cùng thu được enzyme trong túi.
3.2.2 Phương pháp lọc Sephadex G-50
Ta đem cân 100mg enzyme thô hòa tan vào 1ml dung dịch đệm Na
3
PO
4
0,03M, pH = 7.2. Khi enzyme đã hoà tan hoàn toàn thì cho hỗn hợp enzyme từ từ
vào cột. Cho dung môi phân ly enzyme qua cột và điều chỉnh tốc độ chảy khoảng
2ml trong 7 phút. Loại bỏ 5ml đầu tiên rồi mới bắt đầu thu dịch enzyme. Dịch
enzyme được thu đến khi dùng Ba(NO
3
)
2
để thử (NH
4
)
2
SO
4
và thấy có xuất hiện kết