i
LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành Đồ án này
Trước hết tôi xin gửi tới Ban Giám Hiệu Trường Đại học Nha Trang,
Ban Giám đốc Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường, Phòng Đào tạo Đại
học và Sau đại học niềm kính trọng, sự tự hào được học tập tại trường trong
những năm qua.
Sự biết ơn sâu sắc nhất tôi xin được giành cho thầy: TS. Vũ Ngọc Bội -
Phó Giám đốc Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường - Trường Đại học
Nha Trang, TS. Lê Lập - Trưởng Bộ môn Nghiên cứu Vi Trùng - Phân Viện
Thú y Miền Trung đã tận tình hướng dẫn và động viên tôi trong suốt quá trình
thực hiện đồ án tốt nghiệp này.
Xin cám ơn: PGS. TS. Ngô Đăng Nghĩa - Giám đốc Viện Công nghệ
Sinh học và Môi trường, ThS. Khúc Thị An - Quyền Trưởng Bộ môn Công
nghệ Sinh học và các thầy cô phản biện đã cho tôi những lời khuyên quí báu
để công trình nghiên cứu được hoàn thành có chất lượng.
Đặc biệt xin được ghi nhớ tình cảm, sự giúp đỡ của: các thầy cô giáo
trong Bộ môn Công nghệ Sinh học - Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường
- Trường Đại học Nha Trang, Ban lãnh đạo Phân viện Thú y miền Trung, các
cán bộ - Bộ môn Nghiên cứu Vi Trùng và tập thể cán bộ công nhân viên -
Phân viện Thú y miền Trung đã giúp đỡ nhiệt tình và tạo điều kiện thuận lợi
cho tôi trong suốt thời gian tôi thực hiện đồ án này.
Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình, người thân và các bạn bè đã tạo điều
kiện, động viên khích lệ để tôi vượt qua mọi khó khăn trong quá trình học tập
vừa qua.
ii
MỤC LỤC
Lời cảm ơn
Mục lục
Danh mục các bảng
Danh mục các hình

1.5.5. Các yếu tố ảnh hưởng 23
1.5.6. Phản ứng Multiplex PCR 26
1.5.7. Những lợi ích của phản ứng PCR 26
1.5.8. Các loại PCR 27
1.5.9. Giải pháp tối ưu hóa PCR 28
CHƯƠNG II. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 30
2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU 30
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 30
2.2.1. Kiểm tra đặt tính sinh học, hóa học 30
2.2.2. Xác định gen mã hóa độc tố bằng phản ứng Multiplex PCR 32
2.2.3. Phương pháp thử độc lực 35
2.3. TRANG THIẾT BỊ VÀ DỤNG CỤ THÍ NGHIỆM 37
2.4. ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU 37
2.5. PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU 37
PHẦN III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 38
3.1. GIÁM ĐỊNH CÁC ĐẶC TÍNH SINH VẬT, HÓA HỌC CỦA CÁC
CHỦNG VI KHUẨN CLOSTRIDIUM PERFRINGENS 38
3.2. Xác định gen mã hóa các loại độc tố bằng phản ứng Multiplex PCR 42
3.2.1. Xác định type độc tố 42
3.2.2. Kiểm tra gen mã hóa độc tố đương ruột và beta2 44
3.3. XÁC ĐỊNH ĐỘC LỰC TRÊN CHUỘT NHẮT TRẮNG 46
3.3.1. Độc lực của canh khuẩn trên chuột nhắt trắng 46
3.3.2. Độc lực của độc tố trên chuột nhắt trắng 47
3.4. Xác định MLD của độc tố vi khuẩn 48
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 50
1. KẾT LUẬN 50
2. ĐỀ NGHỊ 50
PHỤ LỤC
iv
DANH MỤC CÁC BẢNG

Hình 4.8. Manitol - , Glucose + , Lactose + , Maltose + , Sucrose + 39
Hình 4.9. Phản ứng CAMP 40
Hình 4.10. Phản ứng O-F 40
Hình 4.11.Kết quả xác định gen mã hóa các loại độc tố bắng phản ứng multiplex
PCR … 43 1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Trong những năm qua, nhờ chính sách đầu tư phát triển Nông nghiệp, xóa đói
giảm nghèo của Chính phủ đã thúc đẩy nghề chăn nuôi nói chung và chăn nuôi dê,
cừu nói riêng phát triển mạnh mẽ cả về số lượng và chất lượng. Tổng đàn dê, cừu cả
nước tăng từ 572.448 con năm 2001 lên đến 1.777.600 con năm 2007, trong đó 3
tỉnh duyên hải Nam Trung bộ (Khánh Hòa, Ninh Thuận, Bình Thuận) chiếm
15,87% (khoảng 282.125 con). Tuy nhiên, việc thực hiện các quy trình kỹ thuật như
quản lý giống, chuồng trại, thú y, chăm sóc nuôi dưỡng của các địa phương còn
nhiều hạn chế, trình độ kỹ thuật và quản lý còn yếu kém. Bên cạnh đó việc nghiên
cứu về thức ăn, chăm sóc nuôi dưỡng, phòng trị bệnh tật cho động vật nuôi cũng
chưa tương xứng với nhu cầu và tốc độ tăng trưởng của nghề chăn nuôi dê, cừu.
Dịch bệnh gia súc là một trong những nguyên nhân hạn chế sự phát triển của chăn
nuôi. Vì vậy, trong thời gian tới ngành Nông nghiệp đã xác định nhiệm vụ trước hết
là khống chế các bệnh truyền nhiễm nguy hiểm, sau đó từng bước khống chế các
bệnh truyền nhiễm mãn tính, các bệnh do ký sinh trùng, các bệnh nội khoa, Một
số bệnh thường gặp ở dê, cừu như bệnh tụ huyết trùng, bệnh đậu, bệnh viêm lở
miệng,… trong đó, bệnh viêm ruột tiêu chảy do vi khuẩn Clostridium perfringens
gây ra đã làm tổn thất lớn cho người chăn nuôi.
Vi khuẩn C.perfringens phân bố rộng rãi trong thiên nhiên, thường thấy ở
trong đất, chất hữu cơ. Vi khuẩn C.perfringens thường có mặt trong dạ cỏ và ruột
của dê, cừu khỏe mạnh, bình thường chúng không gây bệnh nhưng do một số yếu tố

nhạy, độ đặc hiệu cao, tiết kiệm thời gian, có thể thực hiện với số lượng mẫu lớn và
cho kết quả trong một thời gian ngắn. Vì thế, chúng tôi đặc vấn đề nghiên cứu:
“Xác định gen mã hóa các loại độc tố của vi khuẩn Clostridium perfringens bằng
phản ứng Multiplex PCR”.
Mục đích của đề tài: góp phần cung cấp thông tin về chủng C.perfringens
đang tồn tại và gây bệnh viêm ruột tiêu chảy ở dê, cừu trong những năm gần đây,
giúp đề xuất biện pháp phòng trị bệnh có hiệu quả để giảm thiểu tối đa những thiệt
hại do vi khuẩn C.perfringens gây ra.
3

Nội dung của đề tài:
1) Giám định các đặc tính sinh vật, hóa học của các chủng vi khuẩn
Clostridium perfringens được phân lập từ dê, cừu mắc bệnh viêm ruột tiêu chảy tại
3 tỉnh Khánh Hòa, Ninh Thuận và Bình Thuận;
2) Xác định gen mã hóa các loại độc tố bằng phản ứng Multiplex PCR;
3) Đánh giá độc lực của các chủng vi khuẩn C. perfringens đã phân lập.
Do thời gian nghiên cứu có hạn nên báo cáo không thể tránh được các hạn chế.
Em rất mong nhận được các ý kiến góp ý của những ai quan tâm đến vấn đề này, để
cho báo cáo thêm hoàn thiện. Em xin chân thành cám ơn.
4

CHƯƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước
1.1.1. Tình hình nghiên cứu ở nước ngoài
Dựa trên phản ứng trung hòa trên chuột, Wilsdon (1931) đã phân
C.perfringens thành 4 type độc tố: từ type A đến D. Wilsdon nhận thấy kháng
huyết thanh của type A chỉ trung hòa được type A, type B trung hòa được tất cả các
type còn lại, type C trung hòa được tất cả ngoại trừ type D, type D trung hòa được
cả type A và B. Ông nhận thấy rằng các kháng thể có trong huyết thanh làm mất tác
dụng của tất cả các loại kháng nguyên. Các kháng nguyên sau này được mô tả:

năm 2000) vào trong phản ứng. Tác giả đã sử dụng 3270 chủng C.perfringens phân
lập được từ động vật mắc bệnh viêm ruột và động vật khỏe. Kết quả cho thấy: Phần
lớn các trường hợp động vật bị bệnh đều định được type vi khuẩn (85,5%), trong đó
chủ yếu là type A chiếm 92,4%. Tỷ lệ cpb2 xác định được 37,2% trong tổng số
mẫu phân lập. Tỷ lệ cpb2 tìm thấy có sự khác nhau giữa các loài. Ở lợn bị bệnh
viêm ruột tỷ lệ dương tính với cpb2 là 85,8% (n = 1132), có sự tương quan giữa lợn
sơ sinh mắc bệnh viêm ruột hoặc tiêu chảy với tỷ lệ cpb2 (91,8% với n = 256) và
phần lớn là type A, do đó type A là nguyên nhân chính gây bệnh ở lợn sơ sinh. Tỷ
lệ cpb2 tìm thấy ở bò là 12,8%(n = 1537), trong đó bò bị bệnh viêm ruột, nhiễm độc
máu, đột tử là 21,4% (n = 336), và ở bê bị viêm ruột và dạ múi khế là 47,3% (n = 93
). Tỷ lệ cpb2 ở dê là 11,7% (n = 34), cừu là 19,2% (n = 52) [19].
Sipos và cộng sự (2003) đã sử dụng kỹ thuật Mutiplex PCR định type độc tố
vi khuẩn C.perfringens trên các loại động vật khác nhau. Kết quả: Ở cừu: 8/10
chủng thuộc type A và 2/10 chủng thuộc type D (chủ yếu tìm được ở cừu non dưới
3 tuần tuổi). Ở lợn: 47/52 chủng thuộc type A (chủ yếu ở lợn con theo mẹ), 5/52
chủng thuộc type C. Còn ở dê: 18/26 mẫu thuộc type D, 6/26 mẫu thuộc type A và
2/26 mẫu thuộc type E [38].
Wen và cộng sự (2004) đã nghiên cứu và thấy rằng nguyên nhân gây ngộ độc
do vi khuẩn C.perfringens chủ yếu là do type A sản sinh độc tố Enterotoxin. Gene
mã hóa độc tố này nằm trên nhiễm sắc thể. Nha bào của những chủng này đều có
khả năng chịu được nhiệt độ cao [35].
6

Kalender và cộng sự (2005) đã sử dụng kỹ thuật Multiplex PCR để phát hiện
các gene mã hóa cho alpha-toxin, beta-toxin, epsilon-toxin, iota-toxin, enterotoxin
Kết quả phân lập trong 52 chủng phân lập từ cừu mắc bệnh từ 104 mẫu cừu mắc
bệnh viêm ruột hoại tủ có 33 chủng (64%) thuộc Type A, 11 chủng (21%) thuộc
Type D, 8 chủng (15%) thuộc Type C. Trong 61 chủng phân lập từ cừu khỏe mạnh
từ 194 mẩu cừu khỏe mạnh có 58 chủng (95%) thuộc Type A, 3 chủng (5%) thuộc
Type D. và không phát hiện gene mã hóa độc tố enterotoxin từ các chủng phân lập


Nguyễn Bá Hiên và cộng sự (1999) cho thấy số lượng vi khuẩn trong một gam
phân trâu, bò bị tiêu chảy (42,73 x 10
6
) cao hơn hẳn so với phân của bê, nghé bình
thường (7,53 x 10
6
) [4].
Lê Văn Tạo và cộng sự (2002) đã phân lập được các chủng vi khuẩn yếm khí
C. perfringens từ trâu, bò chết đột ngột tại các tỉnh phía Bắc, vi khuẩn có độc lực
cao trên động vật thí nghiệm.
Nguyễn Văn Sửu và cộng sự (2003) cho thấy số lượng vi khuẩn trong một
gam phân bê, nghé bị tiêu chảy cao hơn hẳn so với phân của bê, nghé bình thường.
Tác giả khẳng định vi khuẩn C.perfringens có vai trò quan trọng trong hội chứng
tiêu chảy ở gia súc nói chung và của bê, nghé nói riêng [10].
Lê Lập và cộng sự (2007) nghiên cứu sự lưu hành các type độc tố của các vi
khuẩn C.perfringens phân lập từ bò, bê, dê và cừu mắc bệnh tiêu chảy nuôi tại một
số tỉnh duyên hải miền Trung bằng kỹ thuật Multiplex PCR. Kết quả cho thấy
những chủng vi khuẩn C.perfringens phân lập từ phân bò, bê, dê, cừu tiêu chảy đều
thuộc type A mang gen cpa mã hóa sản sinh độc tố anpha, song những chủng phân
lập từ phủ tạng của dê, cừu tiêu chảy lại thuộc type D, mang gen cpa và etx [3].
Để xác định vai trò của vi khuẩn yếm khí C.perfringens gây hội chứng tiêu
chảy, Huỳnh Thị Mỹ Lệ và cộng sự (2009) đã tiến hành phân lập và giám định các
đặc tính sinh học của vi khuẩn trong phân bò, lợn mắc hội chứng tiêu chảy nuôi tại
Hà Nội và vùng lân cận. Kết quả cho thấy các chủng vi khuẩn phân lập mang đầy
đủ các đặc tính sinh học của loài, có độc tố gây chết chuột. Kết quả định typ bằng
kỹ thuật multiplex PCR cho thấy: các chủng C.perfringens phân lập từ bò thuộc typ
A (48,1%) và typ D (51,9%); các chủng phân lập từ lợn thuộc typ A, mang độc tố
ruột (37,8%) và độc tố beta2 (18,9%) [2].
1.2. Đặc tính của vi khuẩn C.perfringens

0
C - 50
0
C, ở nhiệt độ tối thích 45
0
C sau 8 giờ vi khuẩn sẽ mọc [9].
9

Vi khuẩn có khả năng hình thành nha bào, nha bào hình ovan và hơi lệch tâm
nhưng không tìm thấy nha bào trong những môi trường thông thường. Việc hình
thành nha bào đòi hỏi sự có mặt của đường và protein và trong những điều kiện đặc
biệt [9].
- Trên môi trường Fluid thioglycolate: Sau 24 – 28 giờ nuôi cấy ở 37°C, vi
khuẩn phát triển tốt làm đục môi trường.
- Trên môi trường thạch máu: Sau 24 – 28 giờ nuôi cấy ở 37°C, khuẩn lạc của
C.perfringens tròn, nhẵn và bóng; được bao bởi một vòng bên trong dung huyết
hoàn toàn (do độc tố theta) và một vòng bên ngoài dung huyết không hoàn toàn (do
độc tố alpha). Hiện tượng này là dung huyết beta (hình 1.2) trên môi trường nuôi
cấy thạch máu [22].
- Trên môi trường SPS (Perfringens Slection Agar) hoặc TSC agar (Tryptose -
Sulfit-Cycloserin Agar): Vi khuẩn phát triển cho khuẩn lạc tròn màu đen, do vi
khuẩn sinh H
2
S kết hợp với Fe (Fe có sẵn trong môi trường) tạo thành FeS có màu
đen [22].
- Trên môi trường nước thịt gan yếm khí: Vi khuẩn phát triển rất nhanh làm
đục môi trường.

Hình 1.2. Hiện tượng dung huyết beta
1.2.3. Đặt tính sinh vật, hóa học

khuẩn C.perfringens sản sinh ra. Gene mã hóa các loại độc tố ở vi khuẩn này không
chỉ nằm trên nhiễm sắc thể mà còn có trên plasmid.
11

Bảng 1.1. Vị trí gen mã hóa các loại độc tố của vi khuẩn C.perfringens
Độc tố Gen Vị trí của gen
Alpha Cpa Nhiễm sắc thể
Beta Cpb Plasmid
Epsilon Etx Plasmid
Iota Ia a/ Ia b Plasmid
Beta 2 Cpb 2 Plasmid
Enterotoxin Cpe Nhiễm sắc thể/ Plasmid
1.3. Các loại độc tố của vi khuẩn C.perfringens
1.3.1. Alpha toxin (CPA)
Tất cả các type của vi khuẩn C.perfringens đều có khả năng sản sinh độc tố
này. Gene mã hóa cho độc tố alpha là cpa. Cpa nằm trên nhiễm sắc thể của vi
khuẩn. Trọng lượng phân tử của gen khoảng 43kDa, gồm 1.197 nucleotid mã hóa
cho 399 axit amin. Hàm lượng G + C thấp, chỉ khoảng 34% tổng Nu trong bộ gen
cpa. Điểm đẳng điện pI 5,4 [28].
CPA là một phospholipase C, có khả năng thủy phân phosphotidylcholine và
sphingomyeline. Phản ứng chỉ xảy ra khi có mặt enzyme phosphotidase, enzym này
chỉ hoạt động được khi có ion Ca
2+
trong tế bào [22]. Phản ứng đặc trưng để nhận
biết sự có mặt của độc tố CPA là phản ứng phân giải lecithin trên môi trường Egg
yolk, tạo thành vòng trắng sữa xung quanh khuẩn lạc. Khả năng tạo vòng dung
huyết trên môi trường thạch máu. Để chứng minh cho khả năng tạo ra 2 phản ứng
trên của CPA, Titball và cộng sự (1989) đã tiến hành chèn đoạn gene mã hóa độc tố
CPA vào plasmid của vi khuẩn E.coli và nhận thấy rằng vi khuẩn E.coli mang
plasmid tái tổ hợp này có khả năng tạo ra phản ứng phân giải lecithin trên môi

hoạt hóa bởi enzyme protease như trypsin [35]. Trypsin sẽ cắt đứt liên kết peptid
giữa axit amin thứ 14 và 15 (Lys – 14 – Ala – 15) tính từ đầu N của chuỗi peptid,
giải phóng một đoạn peptid gồm 14 axit amin, hoạt hóa cho EXT hoạt động [22].
ETX được hấp thụ thông qua dịch nhầy của ruột vào máu đi khắp cơ thể và
đến các cơ quan bên trong. Tại đây độc tố làm tăng áp lực trong thành mạch, gây
phá hủy màng trong của mạch máu, làm tăng tính thấm thành mạch và tích dịch
trong các xoang của cơ thể, gây phù một số cơ quan, đặc biệt là não, tim, phổi, gan
13

và thận [28]. ETX tác dụng lên nhóm lipid: cholesterol và sphingolipid có mặt trên
màng tế bào động vật có xương sống, vì vậy độc tố này tập trung ở não và thận.
1.3.4. Iota toxin (CPI)
Độc tố Iota được tiết ra bởi vi khuẩn C.perfringens type E. Gen mã hóa độc tố
này nằm trên plasmid. CPI là độc tố gồm 2 phần là 2 polypeptid độc lập với nhau.
Vị trí hoạt hóa enzyme gọi là Iota a (gene mã hóa Ia) và vị trí gắn độc tố với tế bào
biểu mô đích Iota b (gene mã hóa Ib). Chuỗi nặng Ib có trọng lượng phân tử
khoảng 71,5 kDa, pI = 4,2, sẽ gắn độc tố với tế bào biểu mô đích và giúp cho chuỗi
nhẹ Ia có trọng lượng phân tử 47,5 kDa, pI = 5,2 thấm qua màng tế bào, xâm nhập
vào tế bào chất và gây chết tế bào. CPI gây nên các triệu chứng về bệnh nhiễm độc
tố, bệnh đường ruột ở cả bò, bê, chuột lang và thỏ. Ngoài ra, khi vào cơ thể CPI sẽ
là tăng tính thấm thành mạch của tế bào vật chủ [22].
1.3.5. Enterotoxin (CPE)
Là một độc tố đường ruột được sản xuất bởi chủng vi khuẩn type A. Nhiều
nghiên cứu cho thấy rằng CPE còn là nguyên nhân gây nên bệnh tiêu chảy, viêm
ruột và hoại thư sinh hơi ở động vật. Gene mã hóa cho CPE là cpe nằm trên cả
nhiễm sắc thể và plasmid của vi khuẩn C.perfringens. CPE là một đoạn polypeptide
mạch đơn nặng 35 kDa, điểm đẳng điện pI = 4,3, tồn tại ở pH = 5-12 [22]. Khi bị
nhiễm độc enterotoxin các triệu chứng xuất hiện bao gồm: tiêu chảy, nôn mửa, sốt
kéo dài trong vòng 1 ngày, thời gian ủ bệnh từ 6 – 24giờ, thường từ 10 – 12giờ.
1.3.6. Delta toxin

A + - - -
B + + + -
C + + - -
D + - + -
E + - - +
Các type độc tố khác nhau thường gây các thể bệnh khác nhau ở gia súc, gia
cầm và ở người được thể hiện ở bảng 2.3.
Bảng 2.3. Các bệnh gây ra bởi các type độc tố của vi khuẩn C.perfringens
Type độc
tố
Độc tố Bệnh ở người và động vật
A α Ngộ độc thức ăn, tiêu chảy ở người, viêm ruột hoại tử ở gia
cầm, viêm ruột kết ở ngựa, hoại thư sinh hơi…
B α, β, ε Bệnh lỵ ở cừu non, tiêu chảy mãn tính ở cừu trưởng thành,
viêm ruột hoại tử ở bê và ngựa sơ sinh…
C α, β Viêm ruột hoại tử ở gia cầm, các bệnh đường ruột cấp tính
ở cừu trưởng thành, xuất huyết đường ruột ở ngựa, heo,
bê…
D α, ε Bệnh đường ruột ở cừu, bê, bò, viêm ruột kết ở dê non và
dê trưởng thành…
E α, ι Bệnh lỵ ở cừu, viêm ruột kết ở bò, bê, chuột lang, thỏ…
15

1.4.1 Type A
Các chủng C.perfringens thuộc type này được tìm thấy nhiều nhất ở ruột, môi
trường sống của những động vật máu nóng và đất [17]. Độc tố type A gây nên sự
viêm nhiễm ở các vết thương, gây hoại thư sinh hơi và còn là yếu tố chính gây nên
các bệnh về đường ruột ở động vật. Các chủng type A cũng thường được phân lập
từ vùng tai giữa, dạ múi khế ở bê mắc bệnh. Triệu chứng thường thấy ở những con
vật này là xuất huyết niêm mạc dạ múi khế. Cũng có thể xuất hiện một vài hiện

trưởng thành cũng kèm theo chứng đau bụng mãn tính nhưng sẽ không bị tiêu chảy.
Ngoài ra, type B cũng là nguyên nhân gây nên chứng xuất huyết đường ruột ở dê,
bê, lừa và ngựa [11].
Vẫn còn rất ít nghiên cứu về khả năng gây độc của vi khuẩn type B này đối
với động vật. Khả năng gây độc của chúng là đơn lẻ hay cộng gộp với các loại độc
tố khác thì vẫn còn là vấn đề đang được tranh cãi [17].
1.4.3. Type C
Vi khuẩn C.perfringens type C gây nhiễm độc tố ở heo, cừu, ngựa, gà, chó và
cả người. Gia súc, gia cầm mới sinh là những đối tượng dễ bị lây nhiễm nhất. Vi
khuẩn gây tổn thương tế bào biểu mô ruột và tế bào màng trong ruột của vật chủ. Sự
thay đổi thành phần thức ăn đột ngột của những động vật còn nhỏ là một yếu tố
thuận lợi cho sự xâm nhiễm của vi khuẩn C.perfringens type C vào cơ thể vật chủ.
Tỷ lệ lây nhiễm thường khác nhau ở những bầy đàn, chuồng trại khác nhau, thông
thường khoảng 30 – 50%, nếu không được chữa trị hay ngăn chặn kịp thời trong
vòng 24 tiếng thì tỷ lệ đó có thể lên đến từ 50 – 100%. Lợn con là loài dễ bị lây
nhiễm hơn cả, bệnh xuất hiện khi lợn con mới chỉ từ 1 đến 2 ngày tuổi. Triệu chứng
đi kèm là suy nhược cơ thể, tiêu chảy, bệnh lỵ, xuất hiện máu và những tế bào ruột
bị hoại tử ở trong phân. Đối với lợn được 1 đến 2 tuần tuổi, khi mắc bệnh thời gian
điều trị sẽ phải kéo dài, vì lúc này các triệu chứng bệnh đã nặng và phức tạp hơn
nhiều, như mất nước, tiêu chảy cấp, niêm mạc ruột có màu đỏ sậm sau đó là bị hoại
tử. Hoại tử không chỉ xuất hiện ở niêm mạc ruột mà nó còn lan rộng đến cả màng cơ
nhẵn trong một số lớp màng nhầy khác [11]. Triệu chứng bệnh cũng được thấy
tương tự ở dê, bò và cừu như đau bụng, tiêu chảy, kêu rống, điên cuồng, mất
phương hướng…
17

1.4.4. Type D
Độc tố type này được biết đến là một trong những nguyên nhân chính gây nên
các bệnh đường ruột, hay đột tử ở cừu và một số động vật khác. Ngoài độc tố alpha,
vi khuẩn type D còn có khả năng sản sinh một loại độc tố khác, độc tố epsilon, một

đoạn DNA mà không qua tạo dòng. Kỹ thuật này được gọi là polymerase chain
reaction, viết tắt là PCR, được hiểu là phản ứng polymerase dây chuyền.
Bằng phương pháp PCR đã phát hiện được các tác nhân gây bệnh nguy hiểm
là những vi sinh vật, phát hiện được các bệnh lý do rối loạn hay đột biến phân tử,
truy tìm các dấu ấn di truyền để tìm hiểu các mối quan hệ huyết thống. Đặc biệt mở
ra một triển vọng ứng dụng trong theo dõi điều trị bệnh AIDS bằng thuốc kháng
AIDS cũng như trong nghiên cứu quy trình công nghệ sinh học chế tạo các dược
phẩm protein.
1.5.1. Nguyên tắc thực hiện
PCR là kỹ thuật khuếch đại một đoạn trình tự DNA đặc hiệu in vitro do sự xúc
tác của enzym DNA polymerase. Sự khuếch đại này được thực hiện nhờ các chu
trình nhiệt lặp lại (có thể lên đến 40 lần) gồm: đun nóng (95
0
C), làm nguội (37-
65
0
C) và ủ dài ở 72
0
C. Trong dung dịch có các primer (đoạn mồi) P1 và P2, mỗi
loại sẽ bắt cặp bổ sung với đầu mạch đơn tương ứng.
Nhờ vậy 1 mạch kép DNA, sau phản ứng do DNA polymerase thực hiện sẽ
thành 2 mạch DNA kép và có thể thực hiện chu trình khuếch đại mới: 2 thành 4 và
4 thành 8 theo cấp số nhân. Phản ứng PCR thực hiện trong ống nghiệm plastic nhỏ,
có mẫu DNA, primer và DNA polymerase, được gắn vào hệ thống có điều chỉnh
thành chu kì nâng nhiệt và làm nguội theo chương trình định sẵn gọi là themocycler,
đây chính là máy luân nhiệt PCR [12].
Kết quả cuối cùng của phản ứng PCR là sau n chu kỳ của phản ứng, tính theo
lý thuyết ta sẽ có 2
n
bản sao các phân tử DNA mạch kép nằm giữa hai đoạn mồi.

sẽ bám nhiều vị trí trên DNA mẫu dài và sẽ cho kết quả không rõ ràng. Mặt khác
chiều dài DNA bị giới hạn bởi nhiệt độ cần biến tính. Nhiệt độ biến tính quá cao, ví
dụ như trên 80°C sẽ gây ra nhiều vấn đề vì DNA-polymerase hoạt động kém ở nhiệt
độ đó. Chiều dài tốt nhất của đoạn mồi là từ 20-40 nucleotide với nhiệt độ biến tính
khoảng từ 60 – 75°C.
* DNA khuôn mẫu
Vật liệu khởi đầu cho phản ứng PCR là DNA làm khuôn, có chứa đoạn gene
mà ta cần nhân lên trong quá trình thực hiện phản ứng PCR.
Hàm lượng DNA làm khuôn cần cho phản ứng rất nhỏ. Trong các thí nghiệm
bình thường ở phòng thí nghiệm chỉ cần 100 nanogram (ng) DNA làm khuôn là đủ.
Tuy nhiên, trong nhiều trường hợp, phản ứng PCR có thể thực hiện thành công chỉ
từ một phân tử DNA riêng rẽ, tức là chỉ cần DNA làm khuôn từ duy nhất một tế
bào.
Một ưu thế khác đối với mẫu là không cần sự tinh sạch cao. Nhờ vậy, có thể
dùng PCR cho các vết máu, mẫu khảo cổ, DNA cổ xưa hoặc vi khuẩn đã bị hấp khử
trùng. Tuy vậy, trong nhiều trường hợp cần chuẩn bị mẫu tốt để kết quả chắc chắn
hơn [12].
* dNTPs (Deoxynucleotide triphosphat)
Là dung dịch gồm 4 thành phần deoxynucleotide (dATP, dTTP, dCTP,
dGTP). Nồng độ sử dụng dung dịch dNTP sẽ tuỳ thuộc vào các điều kiện phản ứng
chung.
* Enzyme DNA – polymerase
Có vai trò kéo dài mạch mới bổ sung với mạch khuôn từ các mồi khởi đầu.
Các enzyme DNA – polymerase hiện nay đều có tính chịu nhiệt, không bị huỷ ở
nhiệt độ biến tính.
* Dung dịch đệm cho phản ứng PCR
Bao gồm các thành phần sau: Tris HCl (pH 8,3), KCl, MgCl
2
và gelatin.
Thành phần và nồng độ dung dịch đệm sử dụng tuỳ thuộc vào loại DNA polymerase