i
LỜI CẢM ƠN

Đề tài đƣợc thực hiện tại Phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học,Trƣờng Đại
học Nha Trang. Để hoàn thành đề tài tốt nghiệp này tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân
thành và sâu sắc tới TS. Phạm Thu Thủy đã tận tình hƣớng dẫn, chỉ dạy, truyền đạt
kinh nghiệm và giúp đỡ tôi từng bƣớc tiếp cận và hoàn thành đề tài này.
Tôi xin chân thành cảm ơn đến:
 Quý thầy cô giáo Viện Công nghệ sinh học và Môi trƣờng đã truyền
đạt cho tôi những kiến thức quý báu trong những năm qua.
 Quý thầy cô giáo và cán bộ Phòng thí nghiệm đã quan tâm, nhiệt tình
giúp đỡ tôi trong quá trình làm việc tại Phòng thí nghiệm.
 Bố mẹ, bạn bè đã luôn bên cạnh động viên, ủng hộ và dành cho tôi
những tình cảm yêu thƣơng nhất.
Một lần nữa, tôi xin đƣợc cảm ơn tất cả mọi ngƣời đã chia sẻ và giúp đỡ tôi
trong suốt quá trình thực hiện đề tài. Nha Trang, tháng 07 năm 2012
Sinh viên thực hiện
NGUYỄN ANH THI

CHƢƠNG II. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21
2.1. Vật liệu 21
2.1.1. Mẫu 21
2.1.2. Thiết bị chuyên dụng 21
2.1.3. Hóa chất 22

iii
2.1.3.1. Hóa chất 22
2.1.3.2. Môi trƣờng và thuốc thử 22
2.2. Nội dung nghiên cứu 26
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu 27
2.3.1. Phân lập vi khuẩn 27
2.3.2. Xác định đặc điểm hình thái của vi khuẩn Vibrio 30
2.3.3. Xác định một số đặc tính sinh hóa của các chủng Vibrio 31
2.3.4. Bảo quản chủng vi khuẩn. 33
2.3.5. Tách chiết DNA tổng số 33
2.3.6. Xác định gen độc tố bằng kỹ thuật PCR 35
2.3.7. Điện di gel agarose 40
2.3.8. Xây dựng quy trình Multiplex PCR phát hiện đồng thời 3 gen độc tố 41
CHƢƠNG III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 44
3.1. Phân lập và nuôi cấy vi khuẩn Vibrio từ hải sản 44
3.2. Đặc điểm hình thái tế bào của các chủng Vibrio 48
3.3. Một số đặc tính sinh hóa của Vibrio 49
3.4. Tách chiết DNA tổng số 53
3.5. Phản ứng PCR khuếch đại đoạn gen toxR 54
3.6. Phản ứng PCR khuếch đại đoạn gen tlh 55
3.7. Phản ứng PCR khuếch đại đoạn gen tdh 56
3.8. Xây dựng quy trình Multiplex PCR phát hiện đồng thời 3 gen độc tố 56
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 59
TÀI LIỆU THAM KHẢO

Bảng 1.3. Đặc điểm của các loài Vibrio gây bệnh trên ngƣời liên quan đến việc tiêu
thụ hải sản 9
Bảng 1.4. Các kháng nguyên của Vibrio parahaemolyticus 11
Bảng 1.5. Các triệu chứng lâm sàng viêm dạ dày ruột gây ra bởi Vibrio
parahaemolyticus 18
Bảng 2.1. Các mẫu hải sản thu mua tại các chợ ở thành phố Nha Trang dùng để
phân lập vi khuẩn Vibrio 21
Bảng 2.2. Đặc điểm các mồi sử dụng cho phản ứng PCR 37
Bảng 2.3. Các thành phần sử dụng trong phản ứng PCR toxR 38
Bảng 2.4. Các thành phần sử dụng trong phản ứng PCR tlh, tdh 39
Bảng 2.5. Khảo sát tỉ lệ mồi 43
Bảng 3.1. Đặc điểm hình thái của các chủng vi khuẩn phân lập đƣợc 45
Bảng 3.2. Khả năng chịu muối của các chủng Vibrio 49
Bảng 3.3. Khả năng lên men đƣờng của các chủng vi khuẩn Vibrio 51
Bảng 3.4. Khả năng sử dụng lysin của các chủng vi khuẩn 52

vi
DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Cấu tạo Vibrio dƣới kính hiển vi điện tử 6
Hình 2.1. Sơ đồ cách tiếp cận các nội dung nghiên cứu 27
Hình 2.2. Quy trình phân lập Vibrio parahaemolyticus 29
Hình 3.1. Các chủng vi khuẩn sau 24 giờ nuôi cấy trên môi trƣờng LB 3%
NaCl ở điều kiện pH 7,2 và nhiệt độ 37
o
C 45
Hình 3.2. Các khuẩn lạc chủng T5, T11, T16, T20 sau 24 giờ nuôi cấy trên
môi trƣờng TCBS ở điều kiện pH 7,2 và nhiệt độ 37
o
C 48
Hình 3.3. Tế bào của chủng vi khuẩn Vibrio T11 sau khi nhuộm Gram 49

mục tiêu sau:
Phân lập chủng vi khuẩn có đặc điểm hình thái và hóa sinh đặc trƣng cho
Vibrio parahaemolyticus.
Tách chiết DNA tổng số và khuếch đại các đoạn gen toxR, tlh, tdh bằng kỹ
thuật PCR.
Xây dựng quy trình phát hiện đồng thời 3 gen độc tố (toxR, tdh, tlh) của vi
khuẩn Vibrio parahaemolyticus bằng kỹ thuật Multiplex PCR.

2

CHƢƠNG I. TỔNG QUAN
1.1. Tình hình dịch bệnh do Vibrio parahaemolyticus gây ra
1.1.1. Trên thế giới
Vibrio xâm nhiễm trực tiếp vào hải sản và coi chúng nhƣ một phần môi
trƣờng sống của mình. Nhiễm độc thực phẩm do tiêu thụ hải sản gây ra bởi Vibrio
xảy ra phổ biến mà nguyên nhân chính là do V. parahaemolyticus, chiếm khoảng
25% tổng số các vụ ngộ độc thực phẩm do Vibrio gây ra (Feldhusen, 2000).
V. parahaemolyticus sống trên các sinh vật nổi, lơ lửng, động vật phù du, cá
và động vật hai mảnh vỏ (Kaneko và Colwell, 1973). Vi khuẩn này đƣợc xác định là
tác nhân gây ra bệnh viêm dạ dày ruột trên toàn thế giới, đặc biệt là các vùng có
mức tiêu thụ hải sản cao nhƣ Đông Nam Á (Joseph và cộng sự, 1982). Năm 1997,
một ổ dịch lớn do V. parahaemolyticus gây ra do tiêu thụ hàu xảy ra dọc theo bờ
biển Thái Bình Dƣơng (CDC, 1998).
Một số nƣớc ở Châu Á cũng xảy ra nhiều ổ dịch nhƣ: ở Thái Lan các vụ ngộ
độc do V. parahaemolyticus chiếm hơn một nửa các vụ ngộ độc thực phẩm xảy ra
hàng năm (Leon và cộng sự, 2003), Trung Quốc (31,1% vụ ngộ độc thực phẩm đƣợc
báo cáo giữa năm 1991 và 2001), Nhật Bản (chiếm 20 - 30% các trƣờng hợp từ 1981

tăng đáng kể các vụ ngộ độc do V. parahaemolyticus gây ra ở Hoa Kỳ có liên quan
đến chủng huyết thanh O3:K6 mà trƣớc đây chỉ liên quan đến bệnh ở Châu Á
(Sakazaki và cộng sự, 2005).
Ở Mexico, trong tổng số 266 mẫu nƣớc biển, nhuyễn thể và cá thu thập từ
12 điểm khác nhau trong đầm phá Pueblo Viejo, Mexico vào các tháng khác nhau
trong năm cho thấy: V. parahaemolyticus đƣợc tìm thấy ở 11 trong 12 điểm trên.
Nghiên cứu này cũng chỉ ra rằng nhân tố tác động đến sự phân bố của V.
parahaemolyticus trong môi trƣờng bao gồm nhiệt độ nƣớc, nồng độ muối và oxy,
sự tƣơng tác với thực vật nổi, sự có mặt của các trầm tích, chất hữu cơ trong huyền
phù, cá và hải sản cũng nhƣ sự lên xuống của thủy triều ở cửa sông (Maria và cộng
sự, 2004).

4
Ở Chile, tóm tắt dịch bệnh tiêu chảy liên quan đến tiêu thụ hải sản và V.
parahaemolyticus xảy ra trong mùa hè năm 2004 và 2005 ở các vùng quanh của
Puerto Montt, Chile. V. parahaemolyticus thu đƣợc từ động vật có vỏ và mẫu lâm
sàng trong thời gian dịch bệnh chủ yếu thuộc nhóm O3: K6 (Loreto và cộng sự,
2005).
Gần đây, bệnh tiêu chảy do V. parahaemolyticus đã đƣợc báo cáo từ Việt
Nam, Úc, Trung Mỹ và Anh. Tại châu Phi, V. parahaemolyticus lần đầu tiên đƣợc
xác định trong các dịch bệnh tại Togo. Do triệu chứng phát bệnh tƣơng tự với tả nên
ngƣời ta đẩy mạnh về công tác y tế công cộng (Bockemuhl và Triemer, 1974).
Bảng 1.1. Các nhóm thực phẩm Vibrio parahaemolyticus gây ngộ độc thực
phẩm
Nhóm thực phẩm
Số ca xác nhận
Số ngƣời mắc phải
Hải sản
313 (56,7%)
1465 (53,8%)

Bảng 1.2. Ngộ độc thực phẩm gây ra bởi Vibrio parahaemolyticus do tiêu thụ
thực phẩm hải sản 1993 - 2000 ở Hồng Kông
Nhóm thực phẩm
Loại thực phẩm
Số ca mắc bệnh
Số ngƣời mắc phải

Giáp xác

Cua
46 (14,7%)
180 (12,3%)
Tôm
43 (13,7%)
299 (20,4%)
Tôm Hùm
1 (0,3%)
2 (0,1%)
Tổng
90 (28,7%)
481 (32,8%)
Chân bụng
Mực
82 (26,2%)
371 (25,3%)
Thân mềm

Trai
15 (4,8%)
49 (3,3%)

Tại Việt Nam, từ năm 1999 đến 2008 đã có khoảng 1.000 vụ ngộ độc thực
phẩm đƣợc báo cáo với trên 25.000 ngƣời mắc, trong đó có 300 ngƣời tử vong.
Riêng tại tỉnh Khánh Hòa, tính từ năm 2001 đến 2008 có 215 ca ngộ độc thực phẩm
xảy ra, trong đó có 7 ca tử vong. Nguyên nhân của các vụ ngộ độc thực phẩm là do
cá nóc (25 ca), vi sinh vật (48 ca), nấm độc (46 ca). Thời điểm hay xảy ra ngộ độc
thực phẩm trong năm là từ tháng 7 đến tháng 12. Loại thực phẩm gây ngộ độc thực
phẩm thƣờng gặp là rau, thịt, nhƣng hải sản cũng chiếm 11,11% các ca ngộ độc.

6
Theo báo cáo của Tuyet và cộng sự (2002) từ giữa 1/1995 đến 9/2001 ở
Khánh Hòa đã có 548 ca nhiễm bệnh do Vibrio gây ra đƣợc xác định. Trong thời
gian này, các nhà nghiên cứu ghi nhận trong số này có 471 ngƣời lớn và có 57 trẻ
em. Đặc biệt, phân tích vi sinh cho thấy trong số 548 trƣờng hợp tiêu chảy, có 53%
dƣơng tính với vi khuẩn V. parahaemolyticus.
Nhiều địa phƣơng trên cả nƣớc hiện cũng đang phải đối mặt với tình trạng
ngộ độc thực phẩm ngày càng tăng do nhu cầu ăn hải sản ngày càng nhiều, có nơi
ngộ độc thực phẩm đã xảy ra hàng loạt. Ở Vĩnh Long, 10/2005 đã xảy ra dịch tiêu
chảy trên diện rộng. Khi xét nghiệm mẫu phân và mẫu nôn ói của bệnh nhân thì phát
hiện thấy sự hiện diện của vi khuẩn V. parahaemolyticus.
Tuy các phƣơng tiện truyền thông đƣa tin về ngộ độc thực phẩm do V,
parahaemolyticus gây ra rất nhiều do ăn các các loài hải sản nhƣ tôm, cá (Võ Văn
Nha và cộng sự, 2006) nhƣng ở nƣớc ta còn có ít nghiên cứu cơ bản về gen độc tố
của vi khuẩn V. parahaemolyticus gây bệnh. Đề tài đƣợc thực hiện để đáp ứng tình
hình thực tế, làm cơ sở cho nghiên cứu chẩn đoán và điều trị kịp thời.
1.2 . Tổng quan về vi khuẩn Vibrio và Vibrio parahaemolyticus
1.2.1. Tổng quan về vi khuẩn Vibrio


alginolyticus và V. parahaemolyticus có thể phát triển ở nồng độ NaCl 6% - 8%.
Hầu hết các loài Vibrio sống ở 30
o
C nhƣng có một số loài ƣa mặn sinh trƣởng
ở 37
o
C. Các loài V. parahaemolyticus, V. alginolyticus, V. cholerae có thể sinh
trƣởng ở 42
o
C. Tất cả các loài Vibrio đều nhạy cảm với nhiệt độ, đun nóng đến khi
nhiệt độ bên trong hải sản đạt đến 60
o
C trong vài phút thì có thể loại bỏ Vibrio. Làm
lạnh là biện pháp quan trọng giúp kiểm soát và ngăn chặn sự phát triển của vi khuẩn
này.
Vi khuẩn Vibrio nhạy cảm với môi trƣờng acid và phát triển tốt nhất ở giá trị
pH trên trung tính, tức là từ 7,5 – 8,5 nhƣng chúng cũng có khả năng chịu đƣợc môi
trƣờng kiềm. Chúng bị ức chế ở pH dƣới 6,8 và trên 10,2 (Rujiwat, 2007).

8
Các loài Vibrio chủ yếu sống ở nƣớc và mật độ phân bố tùy theo nhiệt độ,
nồng độ Na
+
, hàm lƣợng dinh dƣỡng có trong nƣớc và sự có mặt của các loài thực
vật và động vật (McCarter, 1999). Chúng thƣờng sống ở biển hoặc cửa sông, trên bề
mặt và trong ruột động vật biển. Ngƣời ta thƣờng phân lập chúng từ các cặn trầm
tích, nƣớc, thực vật và hải sản. Các loài hải sản là nơi an toàn cho các loài Vibrio
sinh sống, bao gồm các loài nhƣ trai, sò, cua, tôm, mực. Đối với các loài không ƣa
mặn, chúng có thể đƣợc phân lập từ mẫu nƣớc ngọt (Rujiwat, 2007).
Hầu hết các loài Vibrio phân lập từ các mẫu lâm sàng của ngƣời đều gây bệnh
**
**
TCBS agar
V
V
V
V
Km
V
X
X
X
V
X
mCPC agar
Km
Ti
Km
Km
Km
Km
Km
Km
V
Km

+
−
+
+
+
+
+
Arginine dihydrolase
−
−
+
+
−
+
−
−
−
+
+
Ornithine
decarboxylase
+
+
−
−
−
−
+
+
+

3% NaCl
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
6% NaCl
+
−
+
+
+
+
−
+
+
+
−
8% NaCl
+
−
T
+
−

Khả
năng
lên men
Sucrose
+
+
+
+
−
+
−
−
T
T
−
D-
cellobiose
−
−
+
−
−
−
−
T
+
+
−
Lactose
−

+
+
T
−
D-Mannitol
+
+
+
+
−
+
+
+
T
+
−
ONPG
−
+
+
+
−
+
+
−
+
+
−
Voges-
+

N
N
N
N
0
N
N
N
N
K
N
Gelatinase
+
+
+
+
−
+
+
+
+
+
−
Urease
−
−
−
−
−
−

trong môi trƣờng nƣớc bao gồm nhiệt độ nƣớc, nồng độ muối và oxy, sự tƣơng tác
của các sinh vật phù du, các chất hữu cơ lơ lửng, cá và hải sản và cƣờng độ thủy
triều.
Các đặc tính sinh hóa đặc trƣng cho V. parahaemolyticus bao gồm: phản ứng
oxydase (+), khả năng sử dụng lysin (+), ornithin (+), arginine (+), khả năng lên men
đƣờng arabinose (+), lactose (-), sucrose (-), mannitol (+), mannose (+), phát triển
đƣợc trong phạm vi nồng độ muối từ 3-8%, không mọc ở môi trƣờng không có muối
(0%) hoặc nồng độ muối quá cao (10%).
Các chủng V. parahaemolyticus phân lập có thể phân biệt nhau bằng kiểu
huyết thanh (serotype). Hệ thống để xác định các kiểu huyết thanh của V.
parahaemolyticus dựa trên các cấu trúc kháng nguyên khác nhau của vỏ
lipopolysaccharides (kháng nguyên O) và nang (kháng nguyên K) (Joseph và cộng
sự, 1983). Theo FDA, có 12 kiểu kháng nguyên O và hơn 70 kiểu kháng nguyên K
đã đƣợc xác định (Bảng 1.4).
Bảng 1.4. Các kháng nguyên của Vibrio parahaemolyticus (1986)
Kháng nguyên O
Kháng nguyên K
1
1,25,26,32,38,41,56,58,64,69
2
3,28
3
4,5,6,7,27,30,31,33,37,43,45,48,54,57,58,59,65
4
4,8,9,10,11,12,13,34,42,49,53,55,63,67
5
5,15,17,30,47,60,61,68
6
6,18,46
7

chính của vi khuẩn V. parahaemolyticus (Kaper và cộng sư, 1984). Protein TDH có
trọng lƣợng phân tử đƣợc xác định là 42 kDa bằng sử dụng sắc kí lọc gel (Takeda và
cộng sự, 1978). Cấu trúc của nó không có lipit hay cacbohydrat mà là một dimer,
bao gồm hai tiểu đơn vị và mỗi tiểu đơn vị có khối lƣợng 21 kDa. Protein này rất
bền nhiệt, khi đun nóng ở 100
o
C trong 10 phút thì protein bị biến tính còn lại 165
amino axit với một cầu nối disulfua ở gần đầu carboxyl (–COOH) (Tsunasawa và
cộng sự, 1987).
Năm 1988, Honda và các đồng nghiệp phát hiện ra một hemolysin mới trong
khi phân lập các chủng lâm sàng KP dƣơng tính (Honda và cộng sựz1988).
Hemolysin này đƣợc gọi là TRH (TDH-related haemolysin), có tính chất hóa lý,
miễn dịch và sinh học tƣơng tự nhƣ TDH. Hai protein TDH và TRH đƣợc coi là yếu
tố độc tính quan trọng trong khả năng gây bệnh của V. parahaemolyticus. Chúng

13
đƣợc mã hóa bởi các gen tƣơng ứng là tdh và trh có kích thƣớc lần lƣợt là 269 bp và
250 bp (Nishibuchi và cộng sự, 1992; Honda và Iida, 1993; Xu và cộng sự, 1994).
Giữa các chủng V. parahaemolyticus khác nhau chứa các gen độc tố khác nhau. Hầu
nhƣ tất cả các mẫu lâm sàng đều dƣơng tính với gen tdh hoặc trh, hoặc cả hai, trong
khi gần nhƣ tất cả các mẫu từ môi trƣờng không có hoặc có với tỉ lệ thấp 1 - 5%
(Nishibuchi và Kaper, 1995, Robert và cộng sự, 2004).
Các chủng V. parahaemolyticus gây bệnh là các chủng KP dƣơng tính, có
chứa gen tdh và gen trh mã hóa các protein độc tố TDH, TRH nằm trong operon độc
tố Vp-toxRS và đƣợc điều hòa bởi gen toxR. Operon Vp-toxRS có tên này là do cấu
trúc và chức năng tƣơng tự với operon toxRS của V. cholerae mã hóa cho các gen
nội độc tố tả. Tƣơng tự operon toxRS của V. cholerae, operon Vp-toxRS của V.
parahaemolyticus không chỉ điều khiển sự phiên mã của gen độc tố ruột tdh mà còn
các gen khác nữa. Trình tự của operon Vp-toxRS đƣợc phát hiện có tất cả các chủng
V. parahaemolyticus (Nishibuchi và cộng sự, 1995).

tdh mà còn chứa cụm gen T3SS2, do vậy, liên quan đến khả năng gây bệnh của V.
parahaemolyticus.
Cùng với TDH và TRH, một hemolysin khác đã đƣợc phát hiện trên V.
parahaemolyticus là TLH (thermolabile haemolysin). TLH là một protein không bền
nhiệt và có hoạt tính phospholipase / lysophospholipase (Shinoda và cộng sự, 1991).
Cấu trúc của gen tlh có chứa một ORF dài 1254 bp. Dạng tiền protein và protein
trƣởng thành của TLH gồm có 418 và 398 amino acids với trọng lƣợng phân tử
tƣơng ứng là 47,5 và 45,3 kDa (Shinoda và cộng sự, 1991). Hàm lƣợng G + C của
tlh là 47,6% (Taniguchi và cộng sự, 1986). Nghiên cứu cho thấy không có sự tƣơng
đồng về trình tự của hai gen tdh và tlh. Gen tlh đã đƣợc tìm thấy ở genome của tất cả
các chủng V. parahaemolyticus đƣợc phân lập từ các mẫu lâm sàng hay môi trƣờng.
Tuy nhiên, vai trò của haemolysin này đối với việc gây bệnh dạ dày ruột của V.
parahaemolyticus vẫn chƣa đƣợc biết đến.
1.2.4. Khả năng gây bệnh của Vibrio parahaemolyticus
1.2.4.1. Nguồn lây nhiễm

15
V. parahaemolyticus đƣợc tìm thấy chủ yếu trong các loại thực phẩm có
nguồn gốc từ biển nhƣ cua, hàu, sò…, chúng thƣờng hiện diện khoảng 10 CFU/g –
10
3
CFU/g trong những ngày hè ấm áp. Loài này có thế hệ thời gian ngắn (8-9 phút).
Chúng chỉ cần một thời gian ngắn có nhiệt độ tăng (khoảng từ 30 - 42
o
C, tối ƣu là
37
o
C) là đủ để phát triển đến mức độ lây nhiễm (10
6
tế bào/ml) (Daniels và cộng sự,

3+
) sẽ đƣợc liên kết với
các thể mang sắt của vi khuẩn có khả năng cạnh tranh với các protein gắn sắt của vật
chủ. Phức hợp này sau đó sẽ liên kết với các thụ thể trên màng tế bào và đƣợc vận
chuyển vào trong tế bào (Zhang và Austin, 1998). Hoạt tính hemolysin của vi khuẩn
Vibrio phụ thuộc vào nồng độ ion sắt của vật chủ trong quá trình xâm nhiễm
(Stoebner và Payne, 1988). Trong nhiều trƣờng hợp, hoạt tính tạo lỗ màng của
hemolysin không chỉ giới hạn ở các tế bào hồng cầu mà còn ở một số loại tế bào
khác nhƣ tế bào mast, các bạch cầu trung tính và các tế bào nhân đa hình
(polymorphonuclear) làm tăng cƣờng độc tính và dẫn tới phá hủy các mô (Iida và
Honda, 1997).
Hemolysin có vai trò gây độc chính trong V. parahaemolyticus là một
hemolysin chịu nhiệt do gen tdh mã hóa. Hemolysin này có tên là TDH. TDH là
ngoại độc tố có khả năng làm tan máu, gây tiết dịch ruột, gây độc cho một vài loại tế
bào và hoạt động của tim (Iida và Honda, 1997). Theo Honda và cộng sự (1992)
TDH phá vỡ tế bào eukaryote theo ba bƣớc. Đầu tiên chúng liên kết với màng tế bào
sau đó chúng tham gia tạo ra các kênh lỗ màng (porin channel) ở tế bào biểu mô
thành ruột có đƣờng kính khoảng 2 nm, các kênh này cho phép nhiều loại ion tràn
vào nhƣ Na
+
, Mg
2+
, Ca
2+
. Khi lƣợng TDH tăng lên thì cũng tăng lên các kênh này
làm cho các ion tràn vào tự do và tế bào căng lên hết mức và bị phá vỡ do mất cân
bằng thẩm thấu.
1.2.4.3. Đặc điểm của bệnh
Vào những năm 1950, V. parahaemolyticus lần đầu tiên đƣợc xác định là tác
nhân gây bệnh do thực phẩm ở Nhật Bản. Đến cuối những năm 1960 và đầu những

18
Bảng 1.5. Các triệu chứng lâm sàng viêm dạ dày ruột gây ra bởi Vibrio
parahaemolyticus
Triệu chứng
Tỷ lệ của triệu chứng
Trung bình
Phạm vi (khoảng)
Tiêu chảy
98%
80 - 100%
Đau thắt bụng
82%
68 - 100%
Nôn
71%
40 - 100%
Buồn nôn
52%
17 - 79%
Đau đầu
42%
13 - 56%
Sốt
27%

dàng và đáng tin cậy do vậy thƣờng đƣợc sử dụng để phân tích. Các gen thƣờng
đƣợc sử dụng để xác định loài V. parahaemolyticus bằng kỹ thuật PCR là toxR và
gyrB. Gen toxR là gen điều hòa operon độc tố, bảo thủ đối với V. parahaemolyticus
(Kim và cộng sự, 1999). Ngoài toxR, gen gyrB cũng là gen bảo thủ ở V.
parahaemolyticus nên cũng có thể đƣợc sử dụng để xác định loài V.
parahaemolyticus (Zulkifli và cộng sự, 2009). Trong khi phản ứng khuếch đại các
gen độc tố nhƣ tdh, tlh, trh lại đƣợc sử dụng để kiểm tra khả năng gây bệnh của vi
khuẩn (Zulkifli và cộng sự, 2009).
1.3. Tính cấp thiết và mục tiêu của đề tài
1.3.1. Tính cấp thiết của đề tài
Ở Việt Nam, việc phát hiện vi sinh vật trong thực phẩm hầu hết chỉ dựa trên
phƣơng pháp truyền thống: nuôi cấy kết hợp với các thử nghiệm sinh hóa, miễn
dịch. Các quy trình này rất phức tạp, tiêu tốn thời gian ít nhất từ 2 đến 6 ngày. Đó
cũng là lý do vì sao một vụ ngộ độc phải mất cả tuần mới tìm đƣợc nguyên nhân
gây bệnh. Mặt khác, phƣơng pháp nuôi cấy kết hợp hoàn toàn không đáp ứng đƣợc
yêu cầu kiểm tra, giám sát và kiểm dịch của các cơ quan quản lý. Vì vậy, việc
nghiên cứu phƣơng pháp chẩn đoán nhanh chóng để kiểm soát bệnh và để sản xuất
ra thuốc điều trị kịp thời, tiện dụng là vô cùng cần thiết.
Trong năm 2010, đề tài nghiên cứu khoa học sinh viên “Phân lập và xác định
gen độc tố của vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus trong hải sản tƣơi sống tại các chợ
của thành phố Nha Trang” của sinh viên Nguyễn Thị Cẩm Ly đã xây dựng đƣợc
quy trình PCR đơn phát hiện hai gen độc tố toxR, tlh là gen phổ biến ở tất cả các